CC BY
39
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
О КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2020
Анализ циркуляции коронавирусов человека
Яцышина С.Б., Мамошина М.В., Шипулина О.Ю., Подколзин А.Т., Акимкин В.Г.
ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора, 111123, Москва, Россия
Введение. Появление в конце 2019 г. нового коронавируса SARS-CoV-2, ставшего причиной пандемии, породило массу вопросов относительно эпидемиологии нового заболевания COVID-19 и известных ранее инфекций, вызываемых коронавирусами, которым по причине более лёгкого течения заболеваний уделяли мало внимания.
Цель данной работы - многолетнее ретроспективное исследование распространённости и особенностей циркуляции эпидемических коронавирусов человека в Москве при проведении рутинного скрининга. Материал и методы. Методом полимеразной цепной реакции с детекцией в режиме реального времени исследовали на РНК эпидемических коронавирусов человека (HCoVs) мазки из носо- и ротоглотки 16 511 больных острой респираторной инфекцией (ОРИ) в возрасте от 1 мес до 95 лет (58,3% составили дети), собранные с января 2016 г по март 2020 г, и мазки 505 условно-здоровых детей, собранные в 2008, 2010 и 2011 гг. Результаты. HCoVs обнаруживали у 2,6-6,1% обследованных больных в год, статистически значимо чаще у взрослых по сравнению с детьми, без различий по полу. На пике заболеваемости в декабре 2019 г. HCoVs обнаружены у 13,7% обследованных, что в 2 раза выше среднемноголетнего уровня данного месяца. У больных ОРИ детей до 6 лет HCoVs выявляли статистически значимо чаще, чем у здоровых (3,7 vs 0,7%, p = 0,008).
Заключение. HCoVs циркулируют ежегодно, демонстрируя в Московском регионе зимне-весеннюю сезонность с пиком в декабре. За годы наблюдения эпидемическая активность HCoVs росла до максимальных значений в декабре 2019 г. - феврале 2020 г, снизившись в марте до среднемноголетнего уровня. На фоне растущего количества случаев завоза SARS-CoV-2 в Москву в марте 2020 г. частота выявления HCoVs резко понизилась, что, по-видимому, отражает наличие конкуренции между разными коронавирусами и подтверждает специфичность выявления HCoVs использованным в данной работе диагностическим набором.
Ключевые слова: коронавирусы; полимеразная цепная реакция; сезонность; эпидемическая активность. Для цитирования: Яцышина С.Б., Мамошина М.В., Шипулина О.Ю., Подколзин А.Т., Акимкин В.Г. Анализ циркуляции коронавирусов человека. Вопросы вирусологии. 2020; 65(5): 267-275. DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-2020-65-5-3
Для корреспонденции: Яцышина Светлана Борисовна, канд. биол. наук, руководитель Научной группы по разработке новых методов диагностики ОРЗ, ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора, 111123, Москва. E-mail: [email protected]
Участие авторов: Яцышина С.Б. - дизайн исследования, анализ результатов и написание текста; Мамошина М.В. -статистическая обработка данных, оформление списка литературы; Шипулина О.Ю. - организация и проведение лабораторных исследований; Подколзин А.Т. - концепция и дизайн исследования; Акимкин В.Г. - организация выполнения исследования.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Поступила 02.06.2020 Принята в печать 31.08.2020
Analysis of human coronaviruses circulation
Svetlana B. Yatsyshina, Marina V. Mamoshina, Olga Yu. Shipulina, Alexandr T. Podkolzin, Vasiliy G. Akimkin
Central Research Institute for Epidemiology of the Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare, Moscow, 111123, Russia
Introduction. The novel SARS-CoV-2 coronavirus, which emerged at the end of 2019 and caused a worldwide pandemic, triggered numerous questions about the epidemiology of the novel COVID-19 disease and about well-known coronavirus infections, which used to be given little attention due to their mild symptoms. The purpose: The routine screening-based multiyear retrospective observational study of prevalence and circulation patterns of epidemic-prone human coronaviruses in Moscow.
Material and methods. The real-time polymerase chain reaction was used to detect RNA of human coronaviruses (HCoVs) in nasal and throat swabs from 16,511 patients with acute respiratory infection (ARI), aged 1 month to 95
ORIGINAL RESEARCH
years (children accounted for 58.3%) from January 2016 to March 2020, and swabs from 505 relatively healthy children in 2008, 2010 and 2011.
Results. HCoVs were yearly found in 2.6-6.1% of the examined patients; the detection frequency was statistically higher in adults that in children, regardless of sex. At the height of the disease incidence in December 2019, HCoVs were detected in 13.7% of the examined, demonstrating a two-fold increase as compared to the multi-year average for that month. The statistical frequency of HCoV detection in ARI pediatric patients under 6 years was significantly higher than in their healthy peers (3.7 vs 0.7%, p = 0.008).
Conclusion. HCoVs circulate annually, demonstrating a winter-spring seasonal activity pattern in the Moscow Region and reaching peak levels in December. Over the years of observation, the HCoV epidemic activity reached maximum levels in December 2019 - February 2020 and decreased in March to the multi-year average. Amid a growing number of SARS-CoV-2 cases imported to Moscow in March 2020, the HCoV detection frequency dropped sharply, which, apparently, can be explained by the competition between different coronaviruses and by the specificity of HCoV detection with the diagnostic test kit used in this study.
Keywords: coronaviruses; polymerase chain reaction; seasonality; epidemic activity.
For citation: Yatsyshina S.B., Mamoshina M.V., Shipulina O.Yu., Podkolzin A.T., Akimkin V.G. Analysis of human coronaviruses circulation. Problems of Virology (Voprosy Virusologii). 2020; 65(5): 267-275. (In Russ., in Engl.). DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-2020-65-5-3
For correspondence: Svetlana B. Yatsyshina, PhD. Sci. Biol., Head of the Scientific Group on the Development
of New Diagnostic Methods of ARI diagnostics, Central Research Institute of Epidemiology. Moscow, 111123,
Russia. E-mail: [email protected]
Information about the authors:
Yatsyshina S.B., https://orcid.org/0000-0003-4737-941X
Mamoshina M.V., https://orcid.org/0000-0002-1419-7807
Shipulina O.Yu., https://orcid.org/0000-0003-4679-6772
Podkolzin A.T., https://orcid.org/0000-0002-0044-3341
Akimkin V.G., https://orcid.org/0000-0003-4228-9044
Contribution: Yatsyshina S.B - research design, analysis of the results and writing of the text; Mamoshina M.V. -statistical data processing, drawing up the list of references; Shipulina O.Yu. - organization and conduct of laboratory research; Podkolzin A.T. - research concept and design; Akimkin V.G. - organization of research. Acknowledgments. The study had no sponsorship. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Received 2 June 2020 Accepted 31 August 2020
Введение
Коронавирусы, как возбудители инфекций животных и человека, широко распространены в природе. Они относятся к семейству Coronaviridae, подсемейству Orthocoronavirinae, в котором выделяют 4 рода: Alphacoronavirus, Betacoronavirus, Deltacoronavirus и Gammacoronavirus [1]. Представители родов Gam-macoronavirus и Deltacoronavirus инфицируют преимущественно птиц. Вирусы родов Alphacoronavirus и Betacoronavirus обнаруживают у млекопитающих.
Коронавирусы человека (HCoV), циркулирующие ежегодно в популяции людей, т. е. эпидемические коронавирусы, вызывают острые респираторные инфекции (ОРИ) [2], затрагивающие, как правило, верхние дыхательные пути [3-6]. В редких случаях они ассоциируются с поражением нижних дыхательных путей [7], описаны случаи выделения коронави-русов человека от больных пневмонией [8].
Среди эпидемических коронавирусов человека (HCoVs) в настоящее время выделяют 4 вида.
Human coronavirus 229E (род Alphacoronavirus под-род Duvinacovirus) и Betacoronavirus 1 (ранее назывался HCoV-OC43; род Betacoronavirus подрод Embecovi-rus) известны с середины 1960-х гг. Human coronavirus NL63 (род Alphacoronavirus, подрод Setracovirus) и Human coronavirus HKU1 (род Betacoronavirus под-
род Embecovirus) были открыты в 2004 и 2005 гг. соответственно.
Вирионы коронавирусов представляют собой частицы размером 120 нм, сферической формы, содержащие нуклеокапсид (геномную РНК, связанную с нуклеопротеином (N)) спиральной формы, покрытый липидной мембраной со встроенными белками: гликопротеином (spike, S), формирующим булавовидные отростки, гемагглютинин-эстеразой (HE), мембранным протеином (М) и малым мембранным протеином оболочки (E) [9]. Проникновение в клетки слизистых оболочек происходит посредством связывания гликопротеина S со специфичными рецепторами, причём коронавирусы животных и разные виды HCoVs используют для этого различные рецепторы [10].
Геном коронавирусов, самый протяжённый среди всех РНК-содержащих вирусов, представлен однони-тевой линейной молекулой РНК положительной полярности размером 27-32 тыс. нуклеотидов.
В результате рекомбинации РНК коронавирусов разных видов могут появляться новые варианты, приобретающие нехарактерный тканевый тропизм, более высокую вирулентность и способность преодолевать межвидовой барьер [11-13]. Подобные рекомбинационные события между геномами коро-
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
навирусов летучих мышей и других животных, закреплённые естественным отбором, способствовали появлению в популяции людей высоковирулентных для человека коронавирусов: SARS-CoV, возбудителя тяжёлого острого респираторного синдрома (ТОРС) [14, 15], MERS-CoV, возбудителя ближневосточного респираторного синдрома [16], и SARS-CoV-2, возбудителя COVID-19 [17], в 2002, 2012 и 2019 гг. соответственно.
HCoVs, по-видимому, также возникли в результате рекомбинационных событий с участием разных видов коронавирусов млекопитающих [18, 19], с которыми они имеют общего предка, существовавшего миллионы лет назад [20].
Сведения об эпидемиологии инфекции, вызванной HCoVs, отрывочны: полученные в разные годы в отдельных группах пациентов, они не позволяют однозначно судить о сезонности коронавирусной инфекции и распространённости HCoVs в различных возрастных группах больных ОРИ. Разные исследователи сообщают о зимних, весенних или летних подъёмах заболеваемости [21-27].
Долгосрочные исследования циркуляции коронави-русов человека в России не проводили.
Целью данной работы стало многолетнее ретроспективное исследование распространённости эпидемических коронавирусов человека в Москве при проведении рутинного скрининга методом полиме-разной цепной реакции (ПЦР) с детекцией в режиме реального времени.
Материал и методы
Исследовали мазки из носо- и ротоглотки 16 511 пациентов с симптомами ОРИ, собранные с января 2016 г. по март 2020 г. в процессе рутинного скрининга по определению этиологии ОРИ в Москве. Известно о возрасте 16 385 человек, о поле 16 404 обследованных. Возраст больных варьировал от 1 мес до 95 лет, 58,3% обследованных составили дети в возрасте от 1 мес до 18 лет.
В анализ также включены результаты исследования мазков из носо- и ротоглотки, собранных в 2008, 2010 и 2011 гг. у 505 условно-здоровых детей без признаков респираторной инфекции на момент обследования в возрасте от 1 мес до 18 лет (56,2% младше 6 лет) [28].
РНК HCoVs обнаруживали с дифференциацией по родам: Alphacoronavirus (HCoV NL63 и HCoV 229E) и Betacoronavirus (HCoV HKUI, HCoV OC43) методом ПЦР с детекцией в режиме реального времени с помощью набора реагентов «АмплиСенс ОРВИ-скрин-FL» (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзо-ра) по инструкции производителя на приборах для ПЦР с детекцией в режиме реального времени: RotorGene 6000 (Corbett Research, Австралия), Rotor-Gene Q (QIAGEN GmbH, Германия), ДТ-96 (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия).
Мазок из носо- и ротоглотки брали согласно методическим рекомендациям «Лабораторная диагностика гриппа и других ОРВИ методом полимеразной цепной реакции» МР 3.1.0117-17 и клиническим рекомендациям «Лабораторная диагностика гриппа
2016
2017
2018
2019
2020
10трицательные Negative
-Beta-HCoV (HCoV HKU1, HCoV 0C43), %
- Expon. (HCoV суммарно, 1 HCoV in total, %)
^^ Beta-HCoV (HCoV HKU1, HCoV 0C43) 4ZZZM Alpha-HCoV (HCoV NL63, HCoV 229E)
HCoV суммарно, % HCoV in total, %
-Alpha-HCoV (HCoV NL63, HCoV 229E), %
h^3 £Г о ф а
p 50
Г о
а *
о s
5 з
is s
а *
s а
ф <<
r
o S!
3 3
s 3
fD
b i
b 3
<D О
55 ®
О * ф a
(D <D
X XI
EU О
3 °
S. i
з i
(D I £3 s
sO ,
Рис. 1. Распространённость эпидемических коронавирусов в динамике за 5 лет.
По оси абсцисс - годы наблюдения (с января 2016 г. по март 2020 г.); по оси ординат слева - абсолютное число обследованных и положительных
случаев, справа - доля положительных случаев.
Fig. 1. Prevalence of epidemic-prone coronaviruses over 5 years. The horizontal line - years of observation (from January 2016 to March 2020); the vertical line, on the left - the absolute number of the observed and positive
cases; on the right - the proportion of positive cases.
ORIGINAL RESEARCH
Рис. 2. Сезонная распространённость эпидемических коронавирусов за 5 лет наблюдения (с января 2016 г. по март 2020 г.).
По оси абсцисс - месяцы наблюдения. По оси ординат слева - совокупное абсолютное число обследованных и положительных случаев, справа - доля
положительных случаев помесячно за весь период наблюдения. Fig. 2. Seasonal prevalence of epidemic-prone coronaviruses over 5 years of observation (from January 2016 to March 2020).
The horizontal line - months of observation. The vertical line, on the left - the total absolute number of the observed and positive cases; on the right - the
proportion of positive cases per month for the entire observation period.
и других ОРВИ методом полимеразной цепной реакции» (2016 г.)1, объединяя в пробирке с 0,5 мл транспортной среды, и хранили до исследования при температуре от +4 до +8 °С не более 3 сут.
Статистический анализ включал проверку распределений на нормальность и расчёт критерия %2 Пирсона с использованием программы SPSS Statistics v. 18, 95% доверительный интервал (ДИ) вычисляли по методу Вальда [29].
Результаты
HCoVs обнаруживались ежегодно, демонстрируя экспоненциальную динамику увеличения к 2020 г. доли положительных находок с 2,6 до 6,1% числа обследованных больных. Вирусы, относящиеся к роду Alphacoronavirus (Alpha-HCoV), ежегодно встречались в 1,5-3 раза чаще, чем Betacoronavirus (Beta-HCoV) (рис. 1).
В циркуляции HCoVs наблюдалась выраженная зимне-весенняя сезонность (рис. 2). Подъём заболеваемости, вызванной HCoVs, отмечался с ноября по май, когда они выявлялись более чем у 3% обследованных с ОРИ; пик приходился на декабрь-февраль (7,4-5,5%). В летние месяцы доля инфицированных HCoVs не превышала 0,5% (см. рис. 2 ). Частота обнаружения Alpha-HCoV ежемесячно была в несколько раз выше, чем Beta-HCoV.
С ноября 2019 г. по февраль 2020 г. отмечено превышение эпидемической активности HCoVs: уве-
1Клинические рекомендации. https://fedlab.ru/upload/medialibrary/
b71/_-_-_-_-_06122016.pdf (дата обращения: 23.06.2020).
личение частоты выявления в 2 раза относительно среднемноголетнего уровня (СМУ) для каждого месяца наблюдения. На пике подъёма в декабре 2019 г. (рис. 3) частота выявления HCoVs составила 13,7% (СМУ 7,0%), в январе-феврале - 8% (СМУ 3,1 и 4,2 %), а в марте резко снизилась до 4,1% (СМУ 4,2%).
Представляет интерес вопрос распространённости инфекции у больных разного пола и возраста.
Суммарная доля коронавирусной инфекции среди больных ОРИ женщин оказалась выше, чем мужчин (4,6 vs 3,7; p = 0,013), однако в разные годы эти показатели варьировали (табл. 1), что не позволяет сделать вывод о наличии статистически значимых различий распространённости HCoVs у лиц разного пола.
Распространённость коронавирусной инфекции у больных ОРИ разного возраста отражена в табл. 2. Чёткий возрастной пик отсутствует, однако в целом HCoVs статистически чаще выявлялись у взрослых, чем у детей (5,43%; 95% ДИ 4,92-6,0 vs 3,19%; 95% ДИ 2,86-3,56; p < 0,01) (рис. 4).
При обследовании группы детей без симптомов ОРИ HCoVs были обнаружены в 12 (2,1%; 95% ДИ 1,234,11%) из 505 случаев, положительные результаты встречались во все сезоны, однако более половины из них (7 случаев) были выявлены весной.
У условно-здоровых детей в возрасте до 6 лет HCoVs выявлялись статистически значимо реже, чем у детей того же возраста с симптомами ОРИ (0,7% vs 3,7%; p = 0,008). Распространённость HCoVs у больных ОРИ старше 6 лет и условно-здоровых того же возраста не имела статистически значимых различий: 66 (2,4%) из 2803 vs 10 (4,5%) из 221 (р = 0,047).
Обсуждение
Полученные данные свидетельствуют о том, что HCoVs циркулируют ежегодно, их активность в Московском регионе повышается в зимне-весенний период с пиком в декабре. Выявленный нами характер сезонности согласуется с данными исследования в Норвегии [30], тогда как в Израиле и Гонконге отмечена весенне-летняя активность [27, 31]. По-видимому, это связано с климатическими особенностями регионов, влияющими на циркуляцию HCoVs, как и других респираторных вирусов [32].
Частота выявления HCoVs в нашем исследовании соответствует таковой в других странах [2, 27, 30, 33].
К сожалению, большинство опубликованных исследований касались только детского контингента. В единственном опубликованном исследовании, проведённом в США на выборке больных в возрасте 0-96 лет, средний возраст инфицированных HCoVs составил 22 года [33]. По нашим данным, средний возраст больных, инфицированных HCoVs, - 24 года, медиана - 23 года.
HCoVs обнаружены нами у 2,1% условно-здоровых детей. Сходные с нашими результаты (1,9%) получе-
Таблица 1. Частота выявления коронавирусов у больных острыми респираторными инфекциями разного пола Table 1. Coronavirus detection frequency in female and male patients with acute respiratory infection
Женщины Females Мужчины Males
Годы Years количество обследованных number of the examined число лиц с положительным результатом исследования на Beta-HCoV, абс. (%) number of individuals tested positive for Beta-HCoV, abs. (%) число лиц с положительным результатом исследования на Alpha-HCoV, абс. (%) number of individuals tested positive for Alpha-HCoV, abs. (%) общее число лиц с положительным результатом исследования на HCoV, абс. (%) total number of individuals tested positive for HCoV, abs. (%) количество обследованных number of the examined число лиц с положительным результатом исследования на Beta-HCoV, абс. (%) number of individuals tested positive for Beta-HCoV, abs. (%) число лиц с положительным результатом исследования на Alpha-HCoV, абс. (%) number of individuals tested positive for Alpha-HCoV, abs. (%) общее число лиц с положительным результатом исследования на HCoV, абс. (%) total number of individuals tested positive for HCoV, abs. (%)
2016 1115 7 (0,63; 95% ДИ* 0,25-1,29) 29 (2,60; 95% ДИ 1,75-3,71) 36 (3,23; 95% ДИ 2,27-4,44) 1167 4 (0,34; 95% ДИ 0,09-0,88) 18 (1,54; 95% ДИ 0,92-2,43) 22 (1,89; 95% ДИ 1,19-2,84)
2017 2018 2019 2020 (январь-март) (January-March) 1352 1687 1966 2085 10 (0,74; 95% ДИ 0,36-1,36) 5 (0,30; 95% ДИ 0,1-0,69) 29 (1,48; 95% ДИ 0,99-2,11) 39 (1,87; 95% ДИ 1,33-2,55) 21 (1,55; 95% ДИ 0,96-2,36) 45 (2,67; 95% ДИ 1,95-3,55) 104 (5,29; 95% ДИ 4,34-6,37) 87 (4,17; 95% ДИ 3,36-5,12) 31 (2,29; 95% ДИ 1,56-3,24) 50 (2,96; 95% ДИ 2,21-3,89) 133 (6,77; 95% ДИ 5,69-7,97) 126 (6,04; 95% ДИ 5,06-7,15) 1453 1671 1955 1953 18 (1,24; 95% ДИ 0,74-1,95) 4 (0,24; 95% ДИ 0,07-0,61) 16 (0,82; 95% ДИ 0,47-1,33) 29 (1,48; 95% ДИ 1,0-2,13) 25 (1,72; 95% ДИ 1,12-2,53) 26 (1,56; 95% ДИ 1,02-2,27) 70 (3,58; 95% ДИ 2,8-4,5) 91 (4,66; 95% ДИ 3,77-5,69) 43 (2,96; 95% ДИ 2,15-3,97) 30 (1,80; 95% ДИ 1,21-2,55) 86 (4,40; 95% ДИ 3,53-5,4) 120 (6,14; 95% ДИ 5,12-7,3)
Всего Total 8205 90 (1,10; 95% ДИ 0,88-1,35) 286 (3,49; 95% ДИ 3,11-3,91) 376 (4,58; 95% ДИ 4,15-5,06) 8199 71 (0,87; 95% ДИ 0,68-1,09) 230 (2,81; 95% ДИ 2,47-3,19) 301 (3,67; 95% ДИ 3,28-4,1)
Примечание. * Здесь и в табл. 2: ДИ - доверительный интервал. Note. * Here and in table 2: CI - confidence interval.
Таблица 2. Распространённость коронавирусов в разных возрастных группах больных острыми респираторными инфекциями Table 2. Coronavirus prevalence in different age groups of patients with acute respiratory infection
Возраст, Количество Число лиц с положительным Число лиц с положительным резуль- Число лиц с положительным резуль-
годы обследованных результатом исследования на татом исследования на Beta-HCoV, татом исследования на Alpha-HCoV,
Age, Number HCoV, абс. (%) абс. (%) абс. (%)
years of the examined Number of individuals tested Number of individuals tested positive Number of individuals tested positive
positive for HCoV, abs. (%) for Beta-HCoV, abs. (%) for Alpha-HCoV, abs. (%)
< 1 1451 50 (3,45; 95% ДИ 2,57-4,52) 14 (0,96; 95% ДИ 0,53-1,61) 36 (2,48; 95% ДИ 1,74-3,42)
1-2 1259 47 (3,73; 95% ДИ 2,76-4,93) 10 (0,79; 95% ДИ 0,38-1,46) 37 (2,94; 95% ДИ 2,08-4,03)
3-5 4042 142 (3,51; 95% ДИ 2,97-4,13) 37 (0,92; 95% ДИ 0,65-1,26) 105 (2,60; 95% ДИ 2,13-3,14)
6-17 2803 66 (2,35; 95% ДИ 1,83-2,99) 16 (0,57; 95% ДИ 0,33-0,93) 50 (1,78; 95% ДИ 1,33-2,35)
18-44 5003 253 (5,06; 95% ДИ 5,26-5,7) 58 (1,16; 95% ДИ 0,88-1,5) 195 (3,90; 95% ДИ 2,19-4,47)
45-59 1213 83 (6,84; 95% ДИ 5,49-8,41) 20 (1,65; 95% ДИ 1,01-2,54) 63 (5,19; 95% ДИ 4,01-6,6)
> 60 614 35 (5,70; 95% ДИ 4,0-7,84) 4 (0,65; 95% ДИ 0,18-1,66) 31 (5,05; 95% ДИ 3,46-7,09)
ORIGINAL RESEARCH
ны исследователями из Словении [25]. В Нидерландах HCoVs выявляли у детей контрольной группы с большей частотой (10%) [30].
В нашем исследовании у детей в возрасте до 6 лет с симптоматикой ОРИ статистически значимо чаще обнаруживались HCoVs, чем у здоровых того же возраста, аналогично данным исследователей из Словении [25]. Тогда как среди детей 6-18 лет частота выявления HCoVs у больных и здоровых была практически одинакова, что совпадает с данными норвежских исследователей [30].
Такие возрастные различия, по-видимому, можно объяснить более лёгким и даже бессимптомным течением инфекции у детей старшего возраста вследствие приобретённого анамнестического иммунитета. У больных ОРИ взрослых распространённость коро-
навирусной инфекции оказалась выше, чем у детей, что может быть связано со снижением анамнестического иммунитета с возрастом.
Оба рода HCoVs демонстрировали одинаковую сезонность циркуляции, но сезонные подъёмы заболеваемости Beta-HCoV не были столь выраженными по сравнению с Alpha-HCoV, а распространённость первого среди детей и взрослых была практически одинаковой.
По данным сероэпидемиологических исследований, IgG к разным видам HCoVs обнаруживаются довольно часто, особенно у взрослых. От 91 до 100% обследованных в США лиц старше 50 лет имели IgG ко всем четырём HCoVs в сыворотке крови и в 8-30% случаев - секретируемые слизистой носоглотки IgA, что свидетельствует о широкой распространённости
Рис. 3. Распространённость эпидемических коронавирусов с сентября 2019 г. по март 2020 г. Fig. 3. Prevalence of epidemic-prone coronaviruses from September 2019 to March 2020.
Рис. 4. Распространённость эпидемических коронавирусов у детей и взрослых. Вертикальная шкала - доля положительных случаев. Fig. 4. Prevalence of epidemic-prone coronaviruses in children and adults. The vertical line - the proportion of positive cases.
инфекции и возможности повторного заражения ко-ронавирусами одного и того же вида [34].
Экспериментальным путём показано отсутствие кросс-реактивности нейтрализующих антител к HCoVs разных родов и внутри одного рода Beta-HCoV [35, 36].
Наши данные о более высокой частоте выявления HCoVs у взрослых, чем у детей, в совокупности с результатами иммунологических исследований зарубежных коллег позволяют предполагать формирование непродолжительной иммунологической защиты после инфицирования и возможность повторных случаев заражения HCoVs разных видов.
Более резкое по сравнению с предыдущими сезонами снижение частоты обнаружения HCoVs в марте 2020 г. на фоне роста случаев завоза SARS-CoV-2 в Москву может быть следствием конкуренции между разными коронавирусами и, бесспорно, подтверждает специфичность выявления РНК HCoVs использованным в данной работе диагностическим набором.
Заключение
Проведённое ретроспективное исследование позволило оценить распространённость и выявить особенности циркуляции HCoVs в Москве за 5 лет (с 2016 по 2020 гг.). Циркуляция HCoVs характеризовалась зимне-весенней сезонностью c преобладанием Alpha-HCoVs, без различий по полу. Распространённость HCoVs варьировала от 2,6 до 6,1% числа обследованных больных в год с превышением в 2 раза СМУ в эпидемическом сезоне 2019-2020 гг. У детей до 6 лет с симптомами ОРИ HCoVs выявлялись статистически значимо чаще, чем у условно-здоровых того же возраста, что свидетельствует о значимости возбудителей для развития инфекции. При инфицировании HCoVs детей старшего возраста, возможно, имеющих защитный анамнестический иммунитет, заболевание, по-видимому, протекает в лёгкой и бессимптомной форме, что может объяснять одинаковую частоту выявления вирусов у лиц с наличием и отсутствием респираторной симптоматики. Обнаруженный нами рост частоты выявления HCoVs у взрослых можно объяснить отсутствием перекрёстной реакции нейтрализующих антител к разным HCoVs и снижением уровня антител с возрастом.
В последние годы эпидемическая активность коро-навирусов человека нарастала, достигнув максимума в декабре 2019 г. - феврале 2020 г., что совпало с появлением в Китае нового коронавируса SARS-CoV-2, относящегося к роду Betacoronavirus. Это совпадение могло быть не случайностью, а закономерным отражением активизации эволюционных процессов в популяции коронавирусов млекопитающих, изучение которых заслуживает отдельного внимания.
ЛИТЕРАТУРА
1. de Groot R.J., Baker S.C., Baric R., Enjuanes L., Gorbalenya A.E., Holmes K.V., et al. Family Coronaviridae. In: King A.M., Lefkowitz E., Adams M.J., Carstens E.B. Virus Taxonomy: Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. London, San Diego: Elsevier Academic Press; 2011.
2. Cabeça T.K., Granato C., Bellei N. Epidemiological and clinical features of human coronavirus infections among different subsets of patients. Influenza OtherRespir. Viruses. 2013; 7(6): 1040-7. DOI: http://doi.org/10.1111/irv.12101
3. Bradburne A.F., Bynoe M.L., Tyrrell D.A. Effects of a «new» human respiratory virus in volunteers. Br. Med. J. 1967; 3(5568): 767-9. DOI: http://doi.org/10.1136/bmj.3.5568.767
4. Esposito S., Bosis S., Niesters H.G.M., Tremolati E., Begliatti E., Rognoni A., et al. Impact of human coronavirus infections in otherwise healthy children who attended an emergency department. J. Med. Virol. 2006; 78(12): 1609-15. DOI: http://doi.org/10.1002/ jmv.20745
5. Dare R.K., Fry A.M., Chittaganpitch M., Sawanpanyalert P., Olsen S.J., Erdman D.D. Human coronavirus infections in rural Thailand: a comprehensive study using real-time reverse-transcription polymerase chain reaction assays. J. Infect. Dis. 2007; 196(9): 1321-8. DOI: http://doi.org/10.1086/521308
6. Николаева С.В., Зверева З.А., Каннер Е.В., Яцышина С.Б., Усенко Д.В., Горелов А.В. Клинико-лабораторная характеристика коронавирусной инфекции у детей. Инфекционные болезни. 2018; 16(1): 35-9. DOI: http://doi.org/10.20953/1729-9225-2018-1-35-39
7. Gaunt E.R., Hardie A., Claas E.C.J., Simmonds P., Templeton K.E. Epidemiology and clinical presentations of the four human corona-viruses 229E, HKU1, NL63, and OC43 detected over 3 years using a novel multiplex real-time PCR method. J. Clin. Microbiol. 2010; 48(8): 2940-7. DOI: http://doi.org/10.1128/JCM.00636-10
8. Woo P.C.Y., Lau S.K.P., Chu C., Chan K., Tsoi H., Huang Y., et al. Characterization and complete genome sequence of a novel coronavirus, coronavirus HKU1, from patients with pneumonia. J Virol. 2005; 79(2): 884-95. DOI: http://doi.org/10.1128/JVI.79.2.884-895.2005
9. Dent S., Neuman B.W. Purification of coronavirus virions for Cryo-EM and proteomic analysis. Methods Mol. Biol. 2015; 1282: 99108. DOI: https://doi.org/ 10.1007/978-1-4939-2438-7_10
10. Gralinski L.E., Baric R.S. Molecular pathology of emerging coronavirus infections. J. Pathol. 2015; 235(2): 185-95. DOI: http://doi. org/10.1002/path.4454
11. Poland A.M., Vennema H., Foley J.E., Pedersen N.C. Two related strains of feline infectious peritonitis virus isolated from immuno-compromised cats infected with a feline enteric coronavirus. J. Clin. Microbiol. 1996; 34(12): 3180-4.
12. Woo P.C., Lau S.K., Huang Y., Yuen K.Y. Coronavirus diversity, phylogeny and interspecies jumping. Exp. Biol. Med. (Maywood). 2009; 234(10): 1117-27. DOI: http://doi.org/10.3181/0903-MR-94/
13. Lu S., Wang Y., Chen Y., Wu B., Qin K., Zhao J., et al. Discovery of a novel canine respiratory coronavirus support genetic recombination among betacoronavirus1. Virus Res. 2017; 237: 7-13. DOI: http://doi.org/10.1016/j.virusres.2017.05.006
14. Poon L.L.M., Chu D.K.W., Chan K.H., Wong O.K., Ellis T.M., Leung Y.H.C., et al. Identification of a novel coronavirus in bats. J. Virol. 2005; 79(4): 2001-9. DOI: http://doi.org/10.1128/ JVI.79.4.2001-2009.2005
15. Luk H.K.H., Li X., Fung J., Lau S.K.P., Woo P.C.Y. Molecular epidemiology, evolution and phylogeny of SARS coronavirus. Infect. Genet. Evol. 2019; 71: 21-30. DOI: http://doi.org/10.1016/j.mee-gid.2019.03.001
16. Abdel-Moneim A.S. Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV): evidence and speculations. Arch. Virol. 2014; 159(7): 1575-84. DOI: http://doi.org/10.1007/s00705-014-1995-5
17. Andersen K.G., Rambaut A., Lipkin W.I., Holmes E.C., Garry R.F. The proximal origin of SARS-CoV-2. Nat. Med. 2020; 26(4): 4502. DOI: http://doi.org/10.1038/s41591-020-0820-9
18. Corman V.M., Muth D., Niemeyer D., Drosten C. Hosts and sources of endemic human coronaviruses. Adv. Virus Res. 2018; 100: 16388. DOI: http://doi.org/10.1016/bs.aivir.2018.01.001
19. Ye Z.W., Yuan S., Yuen K.S., Fung S.Y., Chan C.P., Jin D.Y. Zoonotic origins of human coronaviruses. Int. J. Biol. Sci. 2020; 16(10): 1686-97. DOI: http://doi.org/10.7150/ijbs.45472
20. Wertheim J.O., Chu D.K., Peiris J.S., Kosakovsky Pond S.L., Poon L.L. A case for the ancient origin of coronaviruses. J. Virol. 2013; 87(12): 7039-45. DOI: http://doi.org/10.1128/JVI.03273-12
21. Jevsnik M., Ursic T., Zigon N., Lusa L., Krivec U., Petrovec M. Coronavirus infections in hospitalized pediatric patients with acute respiratory tract disease. BMC Infect. Dis. 2012; 12: 365. DOI: http://doi.org/10.1186/1471-2334-12-365
ORIGINAL RESEARCH
22. Varghese L., Zachariah P., Vargas C., LaRussa P., Demmer R.T., Fu-ruya Y.E., et al. Epidemiology and clinical features of human coro-naviruses in the pediatric population. J. Pediatric. Infect. Dis. Soc. 2018; 7(2): 151-8. DOI: http://doi.org/10.1093/jpids/pix027
23. Monto A.S., Cowling B.J., Peiris J.S.M. Coronaviruses. In: Kaslow R.A., Stanberry L.R., Le Duc J.W., eds. Viral Infections of Humans: Epidemiology and Control. Boston, MA: Springer US; 2014: 199-223. DOI: http://doi.org/10.1007/978-1-4899-7448-8_10
24. Dominguez S.R., Robinson C.C., Holmes K.V. Detection of four human coronaviruses in respiratory infections in children: a one-year study in Colorado. J. Med. Virol. 2009; 81(9): 1597-604. DOI: http://doi.org/10.1002/jmv.21541
25. Jevsnik M., Steyer A., Pokorn M., Mrvic T., Grosek S., Strle F., et al. The role of human coronaviruses in children hospitalized for acute bronchiolitis, acute gastroenteritis, and febrile seizures: a 2-year prospective study. PLoS One. 2016; 11(5): e0155555. DOI: http://doi.org/10.1371/journal.pone.0155555
26. Vabret A., Dina J., Gouarin S., Petitjean J., Tripey V., Brouard J., et al. Human (non-severe acute respiratory syndrome) coronavi-rus infections in hospitalised children in France. J. Paediatr. Child Health. 2008; 44(4): 176-81. DOI: http://doi.org/10.1111/j.1440-1754.2007.01246.x.
27. Friedman N., Alter H., Hindiyeh M., Mendelson E., Shemer Avni Y., Mandelboim M. Human coronavirus infections in Israel: epidemiology, clinical symptoms and summer seasonality of HCoV-HKU1. Viruses. 2018; 10(10): 515. DOI: http://doi.org/10.3390/v10100515
28. Яцышина С.Б., Спичак Т.В., Ким С.С., Воробьева Д.А., Агеева М.Р., Горелов А.В. и др. Выявление респираторных вирусов и атипичных бактерий у больных пневмонией и здоровых детей за десятилетний период наблюдения. Педиатрия. Журнал им. Г.Н. Сперанского. 2016; 95(2): 43-50.
29. Sauro J., Lewis J. Estimating completion rates from small samples using binomial confidence intervals: comparisons and recommendations. Proc. Hum. Factors Ergon. Soc. Annu. Meet. 2005; 49(24): 2100-3. DOI: http://doi.org/10.1177/154193120504902407
30. Heimdal I., Moe N., Krokstad S., Christensen A., Skanke L.H., Nordb0 S.A., et al. Human coronavirus in hospitalized children with respiratory tract infections: a 9-year population-based study from Norway. J. Infect. Dis. 2019; 219(8): 1198-206. DOI: http:// doi.org/10.1093/infdis/jiy646
31. Chiu S.S., Chan K.H., Chu K.W., Kwan S.W., Guan Y., Poon L.L.M., et al. Human coronavirus NL63 infection and other coronavirus infections in children hospitalized with acute respiratory disease in Hong Kong, China. Clin. Infect. Dis. 2005; 40(12): 1721-9. DOI: http://doi.org/10.1086/430301
32. Li Y., Reeves R.M., Wang X., Bassat Q., Brooks W.A., Cohen C., et al. Global patterns in monthly activity of influenza virus, respiratory syncytial virus, parainfluenza virus, and metapneumovirus: a systematic analysis. Lancet Glob. Health. 2019; 7(8): e1031-45. DOI: http://doi.org/10.1016/S2214-109X(19)30264-5
33. Biggs H.M., Killerby M.E., Haynes A.K., Dahl R.M., Gerber S.I., Watson J.T. Human coronavirus circulation in the USA, 2014 -2017. Open. Forum Infect. Dis. 2017; 4(Suppl. 1): S311-2. DOI: http://doi.org/10.1093/ofid/ofx163.727
34. Gorse G.J., Patel G.B., Vitale J.N., O'Connor T.Z. Prevalence of antibodies to four human coronaviruses is lower in nasal secretions than in serum. Clin. Vaccine Immunol. 2010; 17(12): 1875-80. DOI: http://doi.org/10.1128/CVI.00278-10
35. Chan C.M., Tse H., Wong S.S.Y., Woo P.C.Y., Lau S.K.P., Chen L., et al. Examination of seroprevalence of coronavirus HKU1 infection with S protein-based ELISA and neutralization assay against viral spike pseudotyped virus. J. Clin. Virol. 2009; 45(1): 54-60. DOI: http://doi.org/10.1016/jjcv.2009.02.011
36. McIntosh K., Dees J.H., Becker W.B., Kapikian A.Z., Chanock R.M. Recovery in tracheal organ cultures of novel viruses from patients with respiratory disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1967; 57(4): 933-40. DOI: http://doi.org/10.1073/pnas.57.4.933
REFERENCES
1. de Groot R.J., Baker S.C., Baric R., Enjuanes L., Gorbalenya A.E., Holmes K.V., et al. Family Coronaviridae. In: King A.M., Lefkowitz E., Adams M.J., Carstens E.B. Virus Taxonomy: Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. London, San Diego: Elsevier Academic Press; 2011.
2. Cabeja T.K., Granato C., Bellei N. Epidemiological and clinical features of human coronavirus infections among different subsets of patients. Influenza Other Respir. Viruses. 2013; 7(6): 1040-7. DOI: http://doi.org/10.1111/irv.12101
3. Bradburne A.F., Bynoe M.L., Tyrrell D.A. Effects of a "new" human respiratory virus in volunteers. Br. Med. J. 1967; 3(5568): 7679. DOI: http://doi.org/10.1136/bmj3.5568.767
4. Esposito S., Bosis S., Niesters H.G.M., Tremolati E., Begliatti E., Rognoni A., et al. Impact of human coronavirus infections in otherwise healthy children who attended an emergency department. J. Med. Virol. 2006; 78(12): 1609-15. DOI: http://doi.org/10.1002/ jmv.20745
5. Dare R.K., Fry A.M., Chittaganpitch M., Sawanpanyalert P., Olsen S.J., Erdman D.D. Human coronavirus infections in rural Thailand: a comprehensive study using real-time reverse-transcription poly-merase chain reaction assays. J. Infect. Dis. 2007; 196(9): 1321-8. DOI: http://doi.org/10.1086/521308
6. Nikolaeva S.V., Zvereva Z.A., Kanner E.V., Yatsyshina S.B., Usen-ko D.V., Gorelov A.V. A clinical-laboratory characteristic of coronavirus infection in children. Infektsionnye bolezni. 2018; 16(1): 35-9. DOI: http://doi.org/10.20953/1729-9225-2018-1-35-39 (in Russian)
7. Gaunt E.R., Hardie A., Claas E.C.J., Simmonds P., Templeton K.E. Epidemiology and clinical presentations of the four human corona-viruses 229E, HKU1, NL63, and OC43 detected over 3 years using a novel multiplex real-time PCR method. J. Clin. Microbiol. 2010; 48(8): 2940-7. DOI: http://doi.org/10.1128/JCM.00636-10
8. Woo P.C.Y., Lau S.K.P., Chu C., Chan K., Tsoi H., Huang Y., et al. Characterization and complete genome sequence of a novel coronavirus, coronavirus HKU1, from patients with pneumonia. J Virol. 2005; 79(2): 884-95. DOI: http://doi.org/10.1128/JVI.79.2.884-895.2005
9. Dent S., Neuman B.W. Purification of coronavirus virions for Cryo-EM and proteomic analysis. Methods Mol. Biol. 2015; 1282: 99108. DOI: https://doi.org/ 10.1007/978-1-4939-2438-7_10
10. Gralinski L.E., Baric R.S. Molecular pathology of emerging coronavirus infections. J. Pathol. 2015; 235(2): 185-95. DOI: http://doi. org/10.1002/path.4454
11. Poland A.M., Vennema H., Foley J.E., Pedersen N.C. Two related strains of feline infectious peritonitis virus isolated from immuno-compromised cats infected with a feline enteric coronavirus. J. Clin. Microbiol. 1996; 34(12): 3180-4.
12. Woo P.C., Lau S.K., Huang Y., Yuen K.Y. Coronavirus diversity, phylogeny and interspecies jumping. Exp. Biol. Med. (Maywood). 2009; 234(10): 1117-27. DOI: http://doi.org/10.3181/0903-MR-94/
13. Lu S., Wang Y., Chen Y., Wu B., Qin K., Zhao J., et al. Discovery of a novel canine respiratory coronavirus support genetic recombination among betacoronavirus1. Virus Res. 2017; 237: 7-13. DOI: http://doi.org/10.1016Zj.virusres.2017.05.006
14. Poon L.L.M., Chu D.K.W., Chan K.H., Wong O.K., Ellis T.M., Leung Y.H.C., et al. Identification of a novel coronavirus in bats. J. Virol. 2005; 79(4): 2001-9. DOI: http://doi.org/10.1128/ JVI.79.4.2001-2009.2005
15. Luk H.K.H., Li X., Fung J., Lau S.K.P., Woo P.C.Y. Molecular epidemiology, evolution and phylogeny of SARS coronavirus. Infect. Genet. Evol. 2019; 71: 21-30. DOI: http://doi.org/10.1016/j.mee-gid.2019.03.001
16. Abdel-Moneim A.S. Middle East respiratory syndrome coronavi-rus (MERS-CoV): evidence and speculations. Arch. Virol. 2014; 159(7): 1575-84. DOI: http://doi.org/10.1007/s00705-014-1995-5
17. Andersen K.G., Rambaut A., Lipkin W.I., Holmes E.C., Garry R.F. The proximal origin of SARS-CoV-2. Nat. Med. 2020; 26(4): 4502. DOI: http://doi.org/10.1038/s41591-020-0820-9
18. Corman V.M., Muth D., Niemeyer D., Drosten C. Hosts and sources of endemic human coronaviruses. Adv. Virus Res. 2018; 100: 16388. DOI: http://doi.org/10.1016/bs.aivir.2018.01.001
19. Ye Z.W., Yuan S., Yuen K.S., Fung S.Y., Chan C.P., Jin D.Y. Zoonotic origins of human coronaviruses. Int. J. Biol. Sci. 2020; 16(10): 1686-97. DOI: http://doi.org/10.7150/ijbs.45472
20. Wertheim J.O., Chu D.K., Peiris J.S., Kosakovsky Pond S.L., Poon L.L. A case for the ancient origin of coronaviruses. J. Virol. 2013; 87(12): 7039-45. DOI: http://doi.org/10.1128/JVI.03273-12
21. Jevsnik M., Ursic T., Zigon N., Lusa L., Krivec U., Petrovec M. Coronavirus infections in hospitalized pediatric patients with acute respiratory tract disease. BMC Infect. Dis. 2012; 12: 365. DOI: http://doi.org/10.1186/1471-2334-12-365
22. Varghese L., Zachariah P., Vargas C., LaRussa P., Demmer R.T., Furuya Y.E., et al. Epidemiology and clinical features of human coronaviruses in the pediatric population. J. Pediatric. Infect. Dis. Soc. 2018; 7(2): 151-8. DOI: http://doi.org/10.1093/jpids/ pix027
23. Monto A.S., Cowling B.J., Peiris J.S.M. Coronaviruses. In: Kaslow R.A., Stanberry L.R., Le Duc J.W., eds. Viral Infections of Humans: Epidemiology and Control. Boston, MA: Springer US; 2014: 199-223. DOI: http://doi.org/10.1007/978-1-4899-7448-8_10
24. Dominguez S.R., Robinson C.C., Holmes K.V. Detection of four human coronaviruses in respiratory infections in children: a one-year study in Colorado. J. Med. Virol. 2009; 81(9): 1597-604. DOI: http://doi.org/10.1002/jmv.21541
25. Jevsnik M., Steyer A., Pokorn M., Mrvic T., Grosek S., Strle F., et al. The role of human coronaviruses in children hospitalized for acute bronchiolitis, acute gastroenteritis, and febrile seizures: a 2-year prospective study. PLoS One. 2016; 11(5): e0155555. DOI: http://doi.org/10.1371/journal.pone.0155555
26. Vabret A., Dina J., Gouarin S., Petitjean J., Tripey V., Brouard J., et al. Human (non-severe acute respiratory syndrome) coronavi-rus infections in hospitalised children in France. J. Paediatr. Child Health. 2008; 44(4): 176-81. DOI: http://doi.org/10.1111/j.1440-1754.2007.01246.x.
27. Friedman N., Alter H., Hindiyeh M., Mendelson E., Shemer Avni Y., Mandelboim M. Human coronavirus infections in Israel: epidemiology, clinical symptoms and summer seasonality of HCoV-HKU1. Viruses. 2018; 10(10): 515. DOI: http://doi.org/10.3390/v10100515
28. Yatsyshina S.B., Spichak T.V., Kim S.S., Vorob'eva D.A., Agee-va M.R., Gorelov A.V., et al. Revealing of respiratory viruses and atypical bacteria in children with pneumonia and healthy children for ten years of observation. Pediatriya. Zhurnal im. G.N. Speransk-ogo. 2016; 95(2): 43-50. (in Russian)
29. Sauro J., Lewis J. Estimating completion rates from small samples using binomial confidence intervals: comparisons and recommen-
dations. Proc. Hum. Factors Ergon. Soc. Annu. Meet. 2005; 49(24): 2100-3. DOI: http://doi.org/10.1177/154193120504902407
30. Heimdal I., Moe N., Krokstad S., Christensen A., Skanke L.H., Nordb0 S.A., et al. Human coronavirus in hospitalized children with respiratory tract infections: a 9-year population-based study from Norway. J. Infect. Dis. 2019; 219(8): 1198-206. DOI: http:// doi.org/10.1093/infdis/jiy646
31. Chiu S.S., Chan K.H., Chu K.W., Kwan S.W., Guan Y., Poon L.L.M., et al. Human coronavirus NL63 infection and other coronavirus infections in children hospitalized with acute respiratory disease in Hong Kong, China. Clin. Infect. Dis. 2005; 40(12): 1721-9. DOI: http://doi.org/10.1086/430301
32. Li Y., Reeves R.M., Wang X., Bassat Q., Brooks W.A., Cohen C., et al. Global patterns in monthly activity of influenza virus, respiratory syncytial virus, parainfluenza virus, and metapneumovirus: a systematic analysis. Lancet Glob. Health. 2019; 7(8): e1031-45. DOI: http://doi.org/10.1016/S2214-109X(19)30264-5
33. Biggs H.M., Killerby M.E., Haynes A.K., Dahl R.M., Gerber S.I., Watson J.T. Human coronavirus circulation in the USA, 2014 -2017. Open. Forum Infect. Dis. 2017; 4(Suppl. 1): S311-2. DOI: http://doi.org/10.1093/ofid/ofx163.727
34. Gorse G.J., Patel G.B., Vitale J.N., O'Connor T.Z. Prevalence of antibodies to four human coronaviruses is lower in nasal secretions than in serum. Clin. Vaccine Immunol. 2010; 17(12): 1875-80. DOI: http://doi.org/10.1128/CVI.00278-10
35. Chan C.M., Tse H., Wong S.S.Y., Woo P.C.Y., Lau S.K.P., Chen L., et al. Examination of seroprevalence of coronavirus HKU1 infection with S protein-based ELISA and neutralization assay against viral spike pseudotyped virus. J. Clin. Virol. 2009; 45(1): 54-60. DOI: http://doi.org/10.1016/jjcv.2009.02.011
36. McIntosh K., Dees J.H., Becker W.B., Kapikian A.Z., Chanock R.M. Recovery in tracheal organ cultures of novel viruses from patients with respiratory disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1967; 57(4): 933-40. DOI: http://doi.org/10.1073/pnas.57A933
