CC BY
22
HayKOBHH BicHHK .HbBiBCbKoro HamoHaibHoro ymBepcurery BeTepHHapHoi' MegnuUHH Ta 6i0TexH0iroriH iMeHi C.3. f^H^Koro Scientific Messenger of Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies
doi: 10.15421/nvlvet7911
ISSN 2519-2698 print ISSN 2518-1327 online
http://nvlvet.com.ua/
УДК 636.5: 577.21
Аналiз зв'язку алельних вар1ант1в гешв IGF-I, GH та PIT-1 з продуктивними ознаками курей породи бiркiвська барвиста
Р.О. Кулiбаба [email protected]
1нститут тваринництва НААН, вул. 7-г Гвардшськог армп, 3, смт. Кулиничi, Харювський р-н, Хартвська обл.,62404, Украгна
У cmammi розглянуто питання зв 'язку алельних варгантгв гешв iнсултоподгбного ростового фактору I (IGF-I), гормону росту (GH) та гiпофiзaрного фактора транскрипци-1 (PIT-1) з показниками яечног продуктивноcтi курей породи бiркiвcь-ка барвиста. З використанням методiв класичног ПЛР та ПЛР-ПДРФ визначали PstI-nолiморфiзм у 5'UTR фрaгментi гену IGF-I; HinfI-полiморфiзм у промоторному фрaгментi IGF-I; AluI-полiморфiзм у четвертому ттрот гена GH; наяв-нicть/вiдcутнicть iнcерцil у другому ттрот гена PIT-1. В результaтi проведених до^джень виявлено вiрогiднi вiдмiнноc-тi в значеннях маси яйця на 30 тиждень життя за HinfI-полiморфiзмом у промоторному фрaгментi локусу iнcулiноподiб-ного ростового фактора I. Для особин з генотипом C/C характеры бiльшi значення даного показника в порiвняно з A/A (51,7 ± 0,61 проти 47,9 ± 0,92 вiдповiдно). За PstI-полiморфiзмому 5'UTR гена iнcулiноподiбногоростового фактора Iпоказано перевагу значення кiлькоcтi знесених яець за 12 тижтв продуктивноcтi для особин з генотипом C1C1 порiвняно з C2C2 (65,2 ± 3,77 проти 60,9 ± 1,33), однаку даному випадку вiдмiнноcтi невiрогiднi, що може бути пов'язано з малою ктьтстю особин C1C1 (12). За тшими локусами вiрогiдних вiдмiнноcтей за визначеними показниками не виявлено.
K.mnoei слова: кури, полiморфiзм, локус, алель, ген, генотип, молекулярно-генетичш маркери, популящя, лжя, продук-тивтсть.
Анализ связи аллельных вариантов генов IGF-I, GH и PIT-1 с продуктивными признаками кур породы борковская барвистая
Р.А. Кулибаба [email protected]
Институт животноводства НААН, ул. 7-й Гвардейской армии, 3, пгт. Кулиничи, Харьковский р-н, Харьковская обл., 62404, Украина
В статье рассмотрены вопросы связи аллельных вариантов генов инсулиноподобного ростового фактора I (IGF-I), гормона роста (GH) и гипофизарного фактора транскрипции-1 (PIT-1) с показателями яичной продуктивности кур породы борковская барвистая. С использованием методов классической ПЦР и ПЦР-ПДРФ определяли PstI-полиморфизм в 5'UTR фрагменте гена IGF-I; Hmfl-полиморфизм в промоторном фрагменте IGF-I; AluI-полиморфизм в четвертом интро-не гена GH; наличие/отсутствие инсерции во втором интроне гена PIT-1. В результате проведенных исследований выявлены достоверные различия в значениях массы яйца на 30 неделю жизни по HirfI-полиморфизму в промоторном фрагменте локуса инсулиноподобного ростового фактора I. Для особей с генотипом C/C характерны большие значения данного показателя по сравнению с A/A (51,7 ± 0,61 против 47,9 ± 0,92 соответственно). По PstI-полиморфизму в 5'UTR гена инсулиноподобного ростового фактора I показано преобладание значения количества снесенных яиц за 12 недель продуктивности для особей с генотипом C1C1 по сравнению с C2C2 (65,2 ± 3,77 против 60,9 ± 1,33), однако в данном случае различия не достоверны, что может быть связано с недостаточным количеством особей генотипа C1C1 (12). По другим локусам достоверных различий не выявлено.
Citation:
Kulibaba, R.O. (2017). Association of allele variants of IGF-I, GH and PIT-1 genes with production traits of Birkivska Barvista chicken breed. Scientific Messenger LNUVMB, 19(79), 53-57.
Ключевые слова: куры, полиморфизм, локус, аллель, ген, генотип, молекулярно-генетические маркеры, популяция, линия, продуктивность.
Association of allele variants of IGF-I, GH and PIT-1 genes with production traits of Birkivska Barvista chicken breed
R.O. Kulibaba [email protected]
Institute of animal science NAAS, 7th Guards Army Str., 3, p.d. Kulinichi, Kharkiv region, 62404, Ukraine
The article considers the questions about association between allelic variants of insulin-like growth factor I (IGF-I), growth hormone (GH) and pituitary transcription factor-1 (PIT-1) genes with the egg productivity of the Borkovskaya Barvistaya chicken breed. Using classical PCR and PCR-RFLP methods, the PstI-polymorphism in the 5'UTR fragment of the IGF-I gene, HinfI-polymorphism in the promoter fragment of IGF-I gene, AluI-polymorphism in the fourth intron of the GH gene and indel polymorphism in the second intron of the PIT-1 gene were determined. As a result of the studies the significant differences in egg weight values on 30 weeks of life for HinfI-polymorphism in the promoter fragment of the IGF-I gene were revealed. For individuals with the C/C genotype was specific the large values of this index compared to A/A (51,7 ± 0,61 vs. 47.9 ± 0,92 respectively). For PstI-polymorphism in the 5'UTR of the IGF-I gene was shown the prevalence in the number of eggs for 12 weeks ofproductivity for individuals with the C1C1 genotype compared to C2C2 (65,2 ± 3,77 vs. 60,9 ± 1,33), but in this case the differences are not significantly, what can be caused by a small number of individuals with C1C1 genotype (12). There were no significant differences for other loci.
Key words: chicken, polymorphism, locus, allele, gene, genotype, molecular genetic markers, population, line, productivity.
Вступ
Вивчення зв'язку р1зних алел1в функщональних гешв з господарсько-корисними ознаками вщноситься до одше! з базових складових маркер-асоцшовано! селекци (MAS) у твариннищга в цшому та в птах1в-нищга зокрема (Fulton, 2008; Wolc, 2014). У зв'язку з цим до актуальних питань вщноситься завдання ви-значення пол1морфних вар1анпв р1зних гешв-кандидапв, функщонування яких пов'язано з проявом господарсько-корисних ознак (Khlestkina, 2014). До одних 1з найбшьш щкавих гешв-кандидапв, що пов'язаш з показниками яечно! продуктивносп курей вщносяться гени шсулшопод1бного ростового фактору I, гормону росту та гшоф1зарного фактора транск-рипци-1 (Saxena et al., 2009).
1нсулшопод1бний ростовий фактор I вщноситься до полшептид1в, що буруть участь у забезпеченш росту та диференщювання клпин i тканин оргашзму (Li et al., 2008). Здшснюе практично ус функцп сома-тотропного гормону в перифершних тканинах, що робить його, поряд з гормоном росту, одним iз найбшьш перспективних об'екпв у сучаснш селекци птищ.
Гормон росту - один iз найбшын багатофункщо-нальних гормошв органiзму тварин та птищ (Shahnaz et al., 2008). Бере участь у забезпеченш найширшого спектру фiзiологiчних функцiй. Виявлеш алельнi варiанти, що виникають внаслвдок варiативностi пос-лiдовностей залишк1в азотистих основ у ланцюгу ДНК рiзних фрагментiв гена (iнтрони, екзони тощо), якi пов'язанi з такими господарсько-корисними ознаками птищ, як яечна та м'ясна продуктившсть, як1сть шкаралупи, а також з резистентнiстю до захворювань (Liu et al., 2001; Nie et al., 2005; Enayati and Rahimi-Mianji, 2009).
Гiпофiзарний фактор транскрипцп-1 - полiпептид, що бере участь у регуляцп транскрипци генiв, якi кодують гормон росту, пролактин, родину трансфор-мируючих ростових факторiв та iнше. Ген PIT-1 ввд-носиться до одного iз найбшьш перспективних гешв-кандидатiв, алельнi варiанти якого пов'язанi з проявом рiзних господарсько-корисних ознак (Bhattacharya et al., 2012).
Дослвдження щодо вивчення зв'язку рiзних алелiв окремих гешв-кандидапв являють собою досить рутину практику сучасно! заруб1жно! генетики та селекци птищ, однак в Укрш'ш ще недостатньо розповсю-джеш, що в цiлому й визначило вщставання показни-к1в продуктивностi курей вичизняно! селекцil. Запро-понована робота, яка е невiд'eмною складовою цшого комплексу досл1джень iз застосування молекулярно-генетичних маркерiв у селекцil курей впчизняних порiд, спрямована на подолання даного недол1ку.
Ранiше у роботах автора було розглянуто питання вивчення основних генетико-популяцшних парамет-рiв популяци курей породи бiркiвська барвиста за сукупшстю молекулярно-генетичних маркерiв, на-самперед PCR-RFLP та Indel. Мета дано! роботи -вивчити зв'язок полiморфiзму в локусах iнсулiнопо-дiбного ростового фактора I, гормону росту та гшофь зарного фактора транскрипцп-1 з показниками яечно! продуктивносп курей породи бiркiвська барвиста лши A.
Матерiал i методи дослiджень
Дослвдження проводили у лаборатори профiлакти-ки захворювань птищ та молекулярно! дiагностики Державно! дослвдно! станцi! птахiвництва НААН, а також у лаборатори молекулярно-генетичних i фiзiо-лого-бiохiмiчних досл1джень у твариннищта 1нститу-ту тваринництва НААН.
Для проведения дослщжень було використано птицю укра!нсько! селекцп - кури яечного напрямку продуктивностi, лiнi! A, породи бiркiвська барвиста (n = 100). Курей утримували у вiварi! лабораторi! (популяцiя 2014 року). В якосп джерела ДНК викори-стовували кров птицi.
Як об'екти дослщжень було обрано локуси, алель-ш варiанти яких пов'язанi з показниками продуктив-ностi птицi (зпдно з лггературними джерелами), -гени iнсулiноподiбного ростового фактора I, гормону росту та гiпофiзарного фактору транскрипцi!-1.
Полiморфiзм локусу iнсулiноподiбного ростового фактора I (IGF-I) визначали за допомогою аналiзу двох мутацiй (SNP) у сайтах рестрикцп для вщповвд-них рестриктаз. У першому випадку полiморфiзм IGF-I визначали за наявшстю/вщсутшстю сайту для PstI у 5'UTR фрагментi гену (Nagaraja et al., 2000; Li et al., 2010). У другому випадку - за наявшс-тю/вщсутшстю сайту для Hinfl у промоторi (Zhou et al., 2005). Полiморфiзм у четвертому iнтронi гена гормону росту курей (GH) визначали на шдстаы ре-зулътатiв власних дослвджень - за допомогою аналiзу наявносл/ввдсутносп сайту для AluI (Kulibaba et al., 2017). На вщм^ ввд усiх вищеперерахованих, алель-нi варiанти гена PIT-1 пов'язанi не з точковою мутащ-ею (SNP) в сайл рестрикцi!, а з наявшстю/вщсутшстю шсерцп, розмiром 57 п. н., у другому iнтронi гену (маркер класу Indel) (Nie et al., 2008). Генотипування особин у даному випадку проводили з використанням аналiзу продуктiв амплiфiкацi! (у всiх iнших випадках анал1зували продукти рестрикцп).
Для проведення амплiфiкацi! використовували вь диовццп для кожного локусу o.iiгонуклсотиди. ГШР
I 00%
90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%
с2/с2
проводили за допомогою реагенпв DreamTaq PCR Master Mix (Thermo Scientific) з використанням про-грамуемого термоциклеру «Терцик» («ДНК-технолопя», Роая) за вщповщними програмами.
Обробку ампл1ф1кованих фрагменпв ендонуклеа-зами рестрикцй' проводили зпдно з шструкцгями виробника (FastDigest, Thermo Scientific). Генотипування особин за кожним 1з локуав проводили через пор1вняння довжин ампл1ф1кованих/рестрикц1йних фрагменпв на електрофореграмах.
Шсля проведення процедури генотипування окре-мих особин на п1дстав1 отриманих даних проводили обл1к показник1в яечно! продуктивносп курей: En12 (Egg number) - шлькють яець за 12 тижшв продуктивносп (23-34 тижш життя); En40 - к1льк1сть яець за 40 тижшв продуктивносп (23-62 тижш життя); Ew30 (Egg weight) - маса яець на 30 тиждень життя; Ew52 -маса яець на 52 тиждень життя. Зв'язок алельних вар1анпв пол1морфних локуав з показниками продук-тивност1 курей оцшювали шляхом пор1вняння серед-шх значень за р1зними генотипами з використанням t-критер1ю Стьюдента.
Результати та Тх обговорення
За результатами генетико-популяцшних досл1-джень показано, що у досл1дн1й популяцИ курей локуси IGF-I, GH та PIT-1 е пол1морфними. У наявност1 особини ус1х можливих генотип1в (у випадку двоха-лельних систем !х три) за кожним 1з ген1в. Однак сп1вв1дношення гомозиготних та гетерозиготних ге-нотип1в у кожному 1з локус1в 1стотно в1др1зняються, що вщображено на рисунку 1.
| с
'Ш:
Т/Т
ТГ777777777Т
шв
шш
гШ;
М
IGF-I, Psfl IGF-I. Hinfl GH. Ahl
PIT-1
Рис. 1. Сшввщношення частот генотипiв за локусами IGF-I, GH та PIT-1 у дослщнш популяцil курей
Сшввщношення частот генотипiв при дослiдженнi зв'язку рiзних алельних варiантiв певних локуав з продуктивними ознаками курей мае принципове зна-чення для статистично! обробки результатiв дослi-джень. Кiлькiсть особин рiзних генотипiв, насамперед гомозиготних, повинно бути достатшм для проведення статистичного аналiзу. В дослiднiй лшп курей за результатами генетико-популяцiйних дослщжень не виявлено достатньо! для проведення дослщжень кiль-костi особин з генотипом C/C за локусом GH, внасль
док незначного значення частоти алеля C (0,08). Тому аналiз показнишв продуктивносп курей породи бiр-швська барвиста за даним локусом проводили тшьки мiж особинами з генотипами C/T та T/T. За вама iншими локусами аналiзували показники рiзних гомо-зиготних та гетерозиготних особин у межах конкрет-них генiв.
У таблищ подано данi щодо показнишв яечно! продуктивносп особин рiзних генотитв досл!дно! популяцi! курей.
Таблиця 1
Показники яечноТ продуктивное^ курей породи б1рк'1вська барвиста лМя A за локусами IGF-I, GH та ___PIT-1 (М ± m)_
Локус Генотип Показники продуктивност
En12, шт. En40, шт. Ew30, г EW52, г
IGF-I PstI C,/C, 65,2 ± 3,77a 204,4 ± 9,63a 52,9 ± 1,34a 58,9 ± 1,68a
C1/C2 61,0 ± 2,49a 203,9 ± 5,66a 54,2 ± 1,57a 58,6 ± 0,99a
C2/C2 60,9 ± 1,33a 203,7 ± 3,37a 52,5 ± 1,12a 57,1 ± 0,58a
IGF-I HinfI A/A 62,1 ± 4,14a 206,3 ± 12,21a 47,9 ± 0,92a 57,6 ± 1,81a
A/C 61,6 ± 1,51a 201,9 ± 4,62a 51,5 ± 0,89b 57,2 ± 0,69a
C/C 64,2 ± 1,22a 206,5 ± 3,35a 51,7 ± 0,61b 58,4 ± 0,74a
GH C/T 60,8 ± 2,44a 202,3 ± 7,09a 51,8 ± 2,25a 58,0 ± 1,06a
AluI T/T 63,1 ± 1,08a 204,8 ± 3,03a 52,6 ± 0,76a 57,5 ± 0,55a
I/I 60,8 ± 2,33a 203,4 ± 6,71a 51,2 ± 1,38a 57,9 ± 1,19a
PIT-1 I/D 64,4 ± 1,43a 210,7 ± 3,79a 51,1 ± 0,83a 58,2 ± 0,77a
D/D 62,2 ± 1,51a 205,2 ± 4,21a 51,8 ± 0,67a 57,1 ± 0,76a
Примттка: a, b - в1дм1нност1 в1ропдт (P < 0,01) у межах локусу
В результат! проведених дослвджень з'ясовано, що за PstI-полiморфiзмом у локус IGF-I в1рог1дних в1д-мшностей за дослiдженими показниками мiж особи-нами рiзних генотипiв не виявлено. При цьому вияв-лено перевагу значения шлькосп знесених яець за 12 тижшв продуктивностi у особин з генотипом QQ порiвняно з C2C2 (65,2 ± 3,77 проти 60,9 ± 1,33), однак ввдмшносп не вiрогiднi, що може бути пов'язано з малою кiлькiстю особин C1C1 (12). Гетерозиготнi особини за визначеними показниками займають про-м1жне положення.
Своею чергою за HinfI-полiморфiзмом локусу IGF-I виявлено вiрогiднi вiдмiнностi у значеннях маси яйця на 30 тиждень життя. Для особин з генотипом C/C характерш бiльшi значення даного показника порiвняно з A/A. За iншими показниками ютотних вiдмiнностей мiж особинами рiзних генотипiв не ви-явлено.
За AluI-полiморфiзмом у четвертому iнтронi гену гормону росту вiрогiдних вiдмiнностей за показниками яечно! продуктивностi також не виявлено. При цьому, за винятком показника маси яйця на 52 тиждень життя, в цшому превалюють особини з генотипом TT, що найбшьш виражено за кшьшстю яець за 12 тижшв продуктивного перiоду. При цьому слщ враховувати той факт, що порiвияния проводяться не м1ж показниками протилежних гомозиготних особин (C/C та T/T), а мiж гетерозиготами C/T та гомозиготами T/T. Беручи до уваги кодомшантний тип наслi-дування у даному випадку, можливо припустити, що значення показнишв особин з генотипами C/C та T/T будуть бiльш виражено в^^знятися.
За ло кусом PIT-1 не виявлено вираже них вщмш-ностей за значениями показнишв продуктивносп м1ж особинами з рiзними генотипами. Однак у даному випадку, на вiдмiну ввд усiх iнших, значення показнишв гетерозиготних особин перевищують так1 у гомозигот (за винятком Ew30), тимчасом як у шших локу-сах гетерозиготи, як правило, займають пром1жне положення.
BlICIIOBK'll
B pe3ynbTari npoBegeHux gocnig®eHb BuaBneHo Bi-
porigHi BigMiHHOCTi y 3HaneHHax Macu afca Ha 30 th®-geHb ^mra 3a HinfI-noniMop$i3MoM y np0M0T0pH0My ^parneHTi noKycy iHcyniHonogi6Horo pocTOBoro $aKTopa I. ,3,na oco6hh 3 reHOTunoM C/C e xapaKTepHHMH 6inbmi 3HaneHHa gaHoro noKa3HHKa nopiBHaHo 3 A/A (51,7 ± 0,61 npoTH 47,9 ± 0,92 BignoBigHo). 3a Pstl-nomMop$i3MoM y 5'UTR reHy iHcyniHonogi6Horo poc-TOBoro ^arcropy I noKa3aHo nepeBa®aHHa 3HaneHHa KinbKocri 3HeceHux ae^ 3a 12 TH®HiB npogyKTHBHocri gna oco6hh 3 reHoTunoM CiCi nopiBHaHo 3 C2C2 (65,2 ± 3,77 npoTH 60,9 ± 1,33), ogHaK y gaHoMy BunagKy Big-MiHHocTi He BiporigHi, mo Mo®e 6yTH BHKnuKaHo He3Ha-hhom KinbKicTM oco6hh 3 reHoTunoM CiCi (12). 3a iH-muMH noKycaMH BiporigHux BigMiHHocreH 3a BH3Hane-hhmh noKa3HHKaMH He BuaBneHo.
Pe3ynbTaTH gocnig®eHb Mo®yTb 6yTH BHKopucTaHi gna npoBegeHHa noganbmoi ceneKmHHoi po6oTH 3 nony-namero Kypen nopogu 6ipKiBCbKa 6apBHCTa niHii A 3 MeToro oTpuMaHHa MiKponiHin 3 6a®aHHMH reHoranaMH 3a reHaMH iHcyniHonogi6Horo pocToBoro $aKTopa I, ropMoHy pocTy Ta rino$i3apHoro $aKTopa TpaHCKpunmi-1.
Bi6^iorpa$iHMi iIOCII. lainm
Wolc, A. (2014). Understanding genomic selection in poultry breeding. World's Poultry Sci. J. 70, 309-314. Fulton, J.E. (2008). Molecular genetics in a modern poultry breeding organization. World's Poultry Sci. J. 64, 171-176.
Khlestkina, E.K. (2014). Molecular markers in genetic
studies and breeding. Russ J Genetics. 4(3), 236-244. Saxena, V.K., Sachdev, A.K., Gopal, R., Pramod, A.B. (2009). Roles of important candidate genes on broiler meat quality. World's Poultry Sci. J. 65, 37-50. Li, H., Zhu, W., Chen, K., Wu, X., Tang, Q., Gao, Y. (2008). Associations between GHR and IGF-1 gene polymorphisms, and reproductive traits in Wenchang chickens. Turk. J. Vet. Anim. Sci. 32(4), 281-285. Shahnaz, S., Shadma, F., Rank, D.N., Khanna, K., Joshi, C.G. (2008). Growth hormone gene polymorphism
HayKoBHH BicHHK ^HyBME iMeHi C.3. I^H^Koro, 2017, t 19, № 79
and its correlation with different traits in Bantam and Leghorn chicken. Indian journal of poultry science. 43(2), 123-127.
Enayati, B., Rahimi-Mianji, G. (2009). Genomic growth hormone, growth hormone receptor and transforming growth factor p-3 gene polymorphism in breeder hens of Mazandaran native fowls. African journal of biotechnology. 8(14), 3154-3159.
Nie, Q., Lei, M., Ouyang, J., Zenq, H., Yang, G., Zhang, X. (2005). Identification and characterization of single nucleotide polymorphisms in 12 chicken growth-correlated genes by denaturing high performance liquid chromatography. Genet. Sel. Evol. 37(3), 339360.
Liu, H.C., Kung, H.J., Fulton, J.E., Morgan, R.W., Cheng, H.H. (2001). Growth hormone interacts with the Ma-rek's disease virus SORF2 protein and is associated with disease resistance in chicken. PNAS USA. 98(16), 9203-9208.
Bhattacharya, T.K., Chatterjee, R.N., Priyanka, M. (2012). Polymorphisms of Pit-1 gene and its association with growth traits in chicken. Poultry Science. 91, 1057-1064.
Nagaraja, S.C., Aggrey, S.E., Yao, J., Zadworny, D., Fairfull, R.W., Kuhnlein, U. (2000). Trait association
of a genetic marker near the IGF-I gene in egg-laying chickens. J. Hered. 91, 150-156.
Li, H., Zhu, W., Chen, K., Song, W., Shu, J., Han, W. (2010). Effects of the polymorphisms of GHR gene and IGF-1 gene on egg quality in Wenchang chicken. Research Journal of Poultry Sciences. 3(2), 19-22.
Zhou, H., Mitchell, A.D., McMurtry, J.P., Ashwell, C.M., Lamont, S.J. (2005). Insulin-Like Growth Factor-I Gene Polymorphism Associations with Growth, Body Composition, Skeleton Integrity, and Metabolic Traits in Chickens. Poultry Science. 84, 212-219.
Kulibaba, R.A., Liashenko, Y.V., Yurko, P.S. (2017). Novel AluI-polymorphism in the fourth intron of chicken growth hormone gene. Cytol. Genet. 51(1), 54-59.
Nie, Q., Fang, M., Xie, L., Zhou, M, Liang, Z., Luo, Z., Wang, J., Bi, W., Liang, C., Zhang, W., Zhang, X. (2008). The PIT1 gene polymorphisms were associated with chicken growth traits. BMC Genet. 9, 20-24.
Received 11.09.2017 Received in revised form 30.09.2017 Accepted 3.10.2017
