6Известия Кабардино-Балкарского научного центра РАН № 4 (48) 2012
МЕДИЦИНА
УДК 575.1.
АНАЛИЗ СОПРЯЖЕННОСТИ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ АНОМАЛИЙ У ДЕТЕЙ ЧЕЧЕНСКОЙ ПОПУЛЯЦИИ В СВЯЗИ С ПОЛИМОРФИЗМОМ ГЕНОВ ДЕТОКСИКАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ И ГЕНОВ ОКСИДАТИВНОГО ОТВЕТА
А.М.-Х. СОЛТАЕВА1 , Л.Е. САЛЬНИКОВА2, П.М. ДЖАМБЕТОВА1,
А.В. РУБАНОВИЧ2
1 Чеченский государственный университет 364907, ЧР, г. Грозный, ул. Шерипова, 32. E-mail: mail@chesu.ru
2Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН 119991, ГСП-1, Москва, ул. Губкина, 3 E-mail: iogen(at)vigg.ru
Изучены взаимосвязи между полиморфизмом генов детоксикации ксенобиотиков и генов оксидативного ответа с частотами микроядер в буккальных эпителиоцитах у детей чеченской популяции (529 человек), проживающих в разных районах ЧР, характеризующихся различной степенью загрязнения нефтепродуктами. Средние частоты микроядер достоверно отличались у детей в загрязненных районах (1.54±0.23) и в чистых районах (0.58±0.09). Увеличенная частота микроядер отмечена у носителей аллеля 47С гена SOD2 в гомозиготном состоянии.
Ключевые слова: дети чеченской популяции, загрязненные районы, «чистые» районы, микроядра, полиморфизм генов, гены оксидативного ответа.
Введение
В связи с ухудшающейся экологической обстановкой в России и в мире и увеличением числа больных хроническими заболеваниями очень актуальна проблема оценки влияния загрязнения окружающей среды нефтепродуктами в районах добычи и переработки нефти на здоровье людей и биологические сообщества. Главными потенциальными источниками загрязнения природной среды нефтью и нефтепродуктами являются нефтепромыслы, нефтепроводы, нефтеперерабатывающие заводы.
Наиболее опасными загрязнениями являются продукты горения и низкотемпературной переработки нефти, такие как бенз(а)пирен, бензин, дизельное топливо, бутан, стирол, бензол, хлороформ и другие. Повышение частоты микроядер и ядерных аномалий выявлено у рыб, обитающих в ручье, протекающем через территорию нефтехимического комплекса [5].
У крыс, которых кормили мидиями, обитающими в загрязненных нефтепродуктами водоемах, выявили повреждения ДНК и микроядра в печени и в меньшей степени в костном мозге [7]. Достоверно более высокий уровень хромосомных аберраций по сравнению с условным контролем выявлен у рабочих нефтяных компаний в Эквадоре [9], Индии [6] и Португалии [10].
Проблема загрязнения окружающей среды нефтепродуктами особенно остро стоит в Чеченской Республике, которая несколько последних десятилетий относится к числу самых неблагополучных в экологическом отношении территорий на Северном Кавказе. Крайне опасные масштабы негативного воздействия на природную среду республики связаны в первую очередь с добычей и переработкой нефти и газа. Несмотря на то, что круп-
ные промышленные предприятия не функционируют в последние годы, мощными источниками загрязнения окружающей среды на территории Чеченской Республики являются многочисленные горящие нефтяные скважины, а также открытое горение нефти и ее переработка на кустарных мини-заводах. Также показано неблагоприятное влияние загрязнения почв республики нефтепродуктами на природные популяции растений и тест-системы [3], но это влияние практически не изучено у населения, проживающего на территориях, загрязненных нефтепродуктами, и особенно наиболее уязвимой группы - детей младшего возраста.
Полиморфизм ферментов, ответственных за биотрансформацию химических веществ, в том числе мутагенов и канцерогенов, определяет способность организма активировать или детоксицировать их, влияет на внутреннюю (поглощенную) и биологически эффективную дозы агентов. В зависимости от особенностей генома различные индивидуумы могут сохранять устойчивость или, наоборот, обнаруживать повышенную чувствительность к повреждающим агентам [1].
Биотрансформация ксенобиотиков является многоступенчатым процессом, в котором одновременно или поочередно участвуют многие ферменты различных этапов детокси-кации, что важно учитывать в исследовании мутагенных эффектов у лиц, контактирующих с известными или предполагаемыми мутагенами. Связь генетического полиморфизма с ответом человека на мутагенные воздействия факторов среды является новой и крайне важной областью исследований в экологии человека и экологической генетики, поскольку изучается проблема реализации генотипа в определенных условиях окружающей среды и в выявлении комплекса генов, отвечающих за возникновение патологических состояний при контакте с повреждающими факторами. Развитие этого направления позволяет исследовать механизмы возникновения экологически обусловленной патологии на основе изучения генетически контролируемых механизмов биотрансформации ксенобиотиков.
В соответствии с этим целью данного исследования было изучение частот микроядер в буккальных эпителиоцитах и полиморфизма генов I и II фазы биотрансформации ксенобиотиков, генов оксидативного ответа у детей чеченской популяции, проживающих в условиях нефтяного загрязнения и экологически «чистых» районах.
Материалы и методы
Обследовано 529 детей чеченской популяции со средним возрастом 8.40±0.05 от 7 до 11 лет, проживающих в восьми селах разных районов Чеченской Республики. Из них три села с различной степенью загрязнения нефтепродуктами, где в течение 15 лет проводилась первичная переработка нефти кустарным способом (Долинск, Мескер-Юрт, Николаевская), что сильно повлияло на экологическую обстановку данных сел. И в пяти селах, в которых подобного производства не было, - это высокогорные экологически «чистые» (Шатой, Зандак), равнинные экологически «чистые» (Гойты, Червленная, Ачхой-Мартан). В обследовании участвовали только дети из семей коренных жителей района, все они относятся к одной национальности — чеченцы. Средний возраст родителей исследуемых детей варьирует незначительно. Родители каждого ребенка заполняли анкету со сведениями о нем (табл. 1).
Все обследуемые к моменту сбора материала были практически здоровы, не принимали лекарственных препаратов и в течение трех месяцев до начала исследования не подвергались рентгенологическим обследованиям.
Материалом для исследования послужили клетки слизистых оболочек полости рта (буккальные эпителиоциты) и клетки периферической крови (лимфоциты). Забор крови проводили после подписания родителями формы информационного согласия с безымян-
ного пальца левой руки (100-200 мкл крови). Образцы крови собирали в эппендорфы, содержащие К2ЭДТА, и хранили при 80°С.
Таблица 1.
Характеристика обследованных детей
Населенный пункт Число детей Средний возраст
Мальчики Девочки Мальчики Девочки
Долинск 40 34 8.28±0.16 8.44±0.15
Мескер-Юрт 46 45 7.87±0.12 8.20±0.13
Шатой 18 19 8.05±0.22 8.21±0.21
Зандак 18 24 9.22±0.17 8.75±0.17
Гойты 19 21 8.89±0.15 8.67±0.14
Червленная 25 19 8.64±0.10 8.53±0.19
Николаевская 15 20 8.33±0.23 8.5±0.20
Ачхой-Мартан 85 81 8.05±0.25 8.20±0.15
Всего 266 263 8.36±0.07 8.44±0.06
Цитогенетические исследования (отбор материала, приготовление и анализ препаратов) проводили в соответствии с методическими рекомендациями «Оценка цитологического и цитогенетического статуса слизистых оболочек полости носа и рта у человека» [2] и классификацией Л.П. Сычевой [4]. Готовили мазки буккального эпителия, фиксировали этанолом и уксусной кислотой в соотношении 3 : 1, препараты помещали на 1 час в 2,5% раствор ацетоорсеина (orcein Merck) при 37 °С для окраски хроматина, затем докрашивали цитоплазму 1% раствором светлого зеленого (light green, ICN Biomedicals Inc.) при комнатной температуре в течение 1 мин. На шифрованных препаратах учитывали цитогенетические показатели: частоту клеток с микроядрами при подсчете 1000 буккальных эпите-лиоцитов у каждого обследуемого.
Выделение ДНК. ДНК выделяли из лимфоцитов периферической крови с помощью универсальной пробоподготовки Diatom TM DNA Prep 200 (фирма «Изоген»).
ПЦР-реакция. Методической основой генотипирования явилась аллель-специфическая тетрапраймерная ПЦР. Метод позволяет в одной пробирке амплифицировать фрагменты ДНК различной длины, соответствующие альтернативным аллелям. Тетрапраймерная реакция включает пару внешних праймеров: прямой и обратный и пару внутренних аллель-специфических праймеров, тоже прямой и обратный.
Статистическую обработку результатов исследований проводили стандартными методами с помощью пакета Win STAT 2003.1, интегрированного в Excel.
Результаты
Изменчивость цитогенетических показателей для выборки в целом оказалась достаточно высокой, чтобы обеспечить возможность поиска генотипических ассоциаций. Выборки обследованных групп составляют 329 человек из чистых районов и 200 из загрязненных. Средние частоты микроядер достоверно отличались, составляя у детей в загрязненных районах 1.54±0.23 на 1000 просмотренных клеток, в чистых районах 0.58±0.09 на 1000 клеток (p=4.8*10-9).
Коэффициенты изменчивости равны соответственно 107% и 138%. Изучение распределения частот клеток с микроядрами у детей, проживающих в чистых и загрязненных районах, у 58% (190 человек) из экологически чистых населенных пунктов не были зарегистрированы микроядра, по 3 микроядра на 1000 клеток имели всего 6 человек (1,82 %), 4 микроядра - 2 человека (0,61%). Число детей, проживающих в загрязненных районах и не имеющих микроядра на 1000 клеток, составило всего 33% (66 детей), по 3 микроядра имели 16 детей (8%), по 4 - 11 детей (5,5%), по 5 - 8 детей (4%), по 6 - 5 детей (2,5%) и по 7 -2 ребенка.
Частоты генотипов, изученных локусов в экологически чистых и в загрязненных нефтепродуктами районах представлены в табл. 2.
Таблица 2.
Частоты генотипов в «чистых» и загрязненных районах
Локусы и генотипы Частоты генотипов, %
«Чистый» район «Грязный» район
СУР1Л1 Т606а ге2606345 Т/Т 34 27
т/а 49 58
а/а 17 15
СУР1Л1 Т3801С ге4646903 Т/Т 85 88
Т/С 15 12
С/С 0 0
СУР1Л1 Л4889а (11е462Уа1) Л/Л 90 85
Л/а 10 15
ге1048943 а/а 0 0
СУР1Б1 а1294С (Уа1432Ьеи) ге1056836 С/С 66 69
С/а 33.13 26
а/а 0.93 5
а8ТМ1 Б/Б 56 53
I/* 44 47
а8ТТ1 Б/Б 11.35 12.50
I/* 88.65 87.50
а8ТР1 Л313а (11е105Уа1) ге1695 Л/Л 34.47 42
Л/а 58 45
а/а 7.45 13
80Б2 ге4880 Т/Т 34 34
Т/С 51 44
С/С 16 22
СЛТ ге7943316 Т/Т 47 41
Т/Л 45 41
Л/Л 8 18
Выявленное распределение частот генотипов проверяли на отклонение от равновесия Харди-Вайнберга, для всех изученных генов распределение генотипов соответствовало закону Харди-Вайнберга.
Частоты микроядер на 1000 клеток в зависимости от генотипов по кандидатным ло-кусам представлены в табл. 3. В случае инсерционно-делеционного полиморфизма (гены аБТМ1, аБТТ1) сравнение проводилось для двух вариантов генотипа: «нулевой» -
гомозигота по делеции (D/D) и «функциональный» - несущий функциональный аллель в гомо- или гетерозиготном состоянии (I/*). Здесь и далее * означает произвольный аллель.
Таблица 3.
Частоты микроядер в зависимости от генотипов изученных генов-кандидатов на «чистых» и загрязненных территориях
Локусы и генотипы Число микроядер на тысячу клеток
N Чистые территории N Грязные территории
CYP1A1 T606G rs2606345 T/T 112 0.44±0.13 52 1.73±0.50
T/G 159 0.64±0.13 111 1.51±0.29
G/G 54 0.69±0.22 29 1.38±0.69
CYP1A1 T3801C rs4646903 T/T 272 0.57±0.05 153 1.65±0.13
T/C 48 0.60±0.10 19 1.37±0.38
C/C 0 - 0 -
CYP1A1 A4889G (Ile462Val) rs1048943 A/A 282 0.56±0.04 169 1.54±0.12
A/G 30 0.70±0.18 29 1.62±0.33
G/G 0 - 0 -
CYP1B1 G1294C (Val432Leu) rs1056836 C/C 213 0.59±0.05 134 1.48±0.14
C/G 107 0.57±0.08 51 1.73±0.23
G/G 3 1.00±0.57 9 1.89±0.61
GSTM1 D/D 183 0.54±0.05 106 1.69±0.16
I/* 143 0.63±0.06 94 1.36±0.16
GSTT1 D/D 37 0.57±0.14 25 1.52±0.32
I/* 289 0.58±0.04 175 1.54±0.12
GSTP1 A313G (Ile105Val) rs1695 A/A 111 0.59±0.07 83 1.64±0.19
A/G 187 0.55±0.05 89 1.61±0.17
G/G 24 0.71±0.17 26 1.08±0.24
SOD2 rs4880 T/T 108 0.61±0.07 49 1.67±0.24
T/C 160 0.48±0.05 63 1.59±0.20
C/C 49 0.69±0.12 32 2.16±0.29
CAT rs7943316 T/T 151 0.62±0.06 78 1.47±0.15
T/A 146 0.51±0.06 77 1.66±0.21
A/A 27 0.70±0.22 33 1.79±0.30
Примечание: заливкой выделены случаи значимых межгенотипических различий.
Увеличенная частота микроядер отмечена у носителей аллеля 47С гена SOD2 в гомозиготном состоянии. В загрязненных населенных пунктах значения частот микроядер таковы: 2.16±0.29 для носителей минорного аллеля 47С в гомозиготном состоянии против 1.62±0.15 для детей с аллелем 47Т/* (р=0.007).
В чистых районах частоты микроядер у гомозиготных носителей минорного аллеля 47С (0.69±0.24), незначительно отличаются от частот микроядер у детей, имеющих аллель 47Т/* (0.53±0.08) гена SOD2. Ген SOD2 контролирует синтез супероксиддисмутазы - ан-тиоксидантного фермента. Вместе с каталазой и другими антиоксидантными ферментами она защищает организм человека от постоянно образующихся высокотоксичных кислородных радикалов. Супероксиддисмутаза катализирует дисмутацию супероксида в кислород и пероксид водорода. Таким образом, она играет важнейшую роль в антиоксидантной защите практически всех клеток организма человека.
Результаты данного этапа работы сводятся к следующим выводам:
1. Частоты микроядер в буккальном эпителии у детей, проживающих на загрязненных территориях, существенно выше (1,54+0,23) по сравнению с детьми из чистых районов (0,58+0,09).
2. Повышенная чувствительность к загрязнению среды была достоверно ассоциирована с минорным аллелем 47С гена SOD2, сопряженного, по литературным данным, со сниженной активностью фермента супероксиддисмутазы 2.
ЛИТЕРАТУРА
1. Баранов B.C., Баранова Е.В., Иващенко Т.Э., Асеев М.В. Геном человека и гены предрасположенности / Введение в предективную медицину. СПб: Интермедика, 2000. 272 с.
2. Беляева Н.Н., Сычева Л.П., Журков В.С., Шамарин А.А. и др. Оценка цитологического и цитогенетического статуса слизистых оболочек полости носа и рта у человека. Методические рекомендации. М., 2005. 37 с.
3. Джамбетова П.М., Реутова Н.В., Ситников М.Н. Влияние нефтезагрязнений на морфологические и цитогенетические характеристики растений // Экологическая генетика, 2005. Т. 3. № 4. С. 5-10.
4. Сычева Л.П., Журков В.С., Рахманин Ю.А., Ревазова Ю.А. Применение полиорганного микроядерного теста в эколого-генетических исследованиях // Полиорганный микроядерный тест в эколого-гигиенических исследованиях / Под ред. Ю.А. Рахманина, Л.П. Сычевой. М.: Гениус, 2007. С. 277-286.
5. De Lemos C.T., Irango F. de A., de Oliveira N.C., de Souza G.D., Fachel J.M. Biomonitoring of genotoxicity using micronuclei assay in native population of Astyanax jacuhiensis (Characiformes: Characidae) at sites under petrochemical influence //Sci Total Environ., 2008, № 406 (1-2). Р. 337-343.
6. Krishnamurthi K., Saravana Devi S., Hengstler J.G., Hermes M., Kumar K., Dutta D., Muhil Vannan S., Subin T.S., Yadav R.R., Chakrabarti T. Genotoxicity of sludges, wastewater and effluents from three different industries // Arch Toxicol. 2008, № 82 (12). Р. 965-971.
7. Lemiere S., Cossu-Leguille C., Bispo A., Jour-dain M.J., Lanhers M.C., Burnel D., Vas-seur P. Genotoxicity related to transfer of oil spill pollutants from mussels to mammals via food // Environ Toxicol. , 2004 № 19 (4). Р. 387-395.
8. NebertD.W., CarvanM.J. Ecogenetics: from ecology to health / D.W. Nebert, M.J. Car-van// Toxicol. Industr. Hlth. 1997. V. 13. P. 163 - 192. 77.
9. Paz-y-Minoet C., Lopez-Cortes A., Arevalo M., Sanchez M.E. Monitoring of DNA damage in individuals exposed to petroleum hydrocarbons in Ecuador // Ann N Y Acad Sci., 2008.№ 1140. Р. 121-128.
10. Roma-Torres J., Teixeira J.P., Silva S., Laffon B., Cunha L.M., Mendez J., Mayan O. Evaluation of genotoxicity in a group of workers from a petroleum refinery aromatics plant // Mutat Res., 2006. № 604 (1-2). P/19-27.
ANALYSIS OF CONJUGATE CYTOGENETIC ABNORMALITIES IN CHILDREN OF CHECHEN POPULATION IN CONNECTION WITH GENE POLYMORPHISM AND DETOXIFICATION XENOBIOTICS AND OXIDATIVE RESPONSE GENES
A.M.-H. SOLTAEVA1, L.E. SALNIKOVA2, P.M. DZHAMBETOVA1, A.V. RUBANOVICH2
1 Chechen State University 364 907, CR, Grozny, 32, Sheripova street. E-mail: mail@chesu.ru
2 Institute of General Genetics. N. Vavilov, Academy of Sciences 119991, GSP-1, 3, Gubkin street E-mail: iogen(at)vigg.ru
We study the relationship between gene polymorphism of detoxification of xenobiotics and oxidative response genes with frequencies of micronuclei in buccal epithelial cells in children of Chechen population (529 people) living in different parts of the Chechen Republic, characterized by varying degrees of petroleum pollution. The average frequency of micronuclei was significantly different in children in contaminated areas (1.54 ± 0.23) and in clean areas (0.58 ± 0.099). Increased frequency of micronuclei was observed in carriers of the gene SOD2 allele 47s in the homozygous state.
Key words: children of the Chechen population, contaminated areas, "clean" areas, micronuclei, gene polymorphisms, oxidative response genes.
Работа поступила 26. 03. 2012 г.
