16Известия Кабардино-Балкарского научного центра РАН № 6 (56) 2013
- БИОЛОГИЯ. МЕДИЦИНА -
УДК 575
СОПРЯЖЕННОСТЬ ВРОЖДЕННЫХ МОРФОГЕНЕТИЧЕСКИХ ВАРИАНТОВ И ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ У ДЕТЕЙ ЧЕЧЕНСКОЙ РЕСПУБЛИКИ
П.М. ДЖАМБЕТОВА
Чеченский государственный университет 364907, ЧР, г. Грозный, ул. Шерипова, 32 E-mail: mail@chesu.ru
Впервые изучена сопряженность показателей врожденных морфогенетических вариантов у детей, проживающих в условиях загрязнения окружающей среды продуктами первичной переработки нефти, с полиморфизмом генов детоксикации, репарации и оксидатив-ного ответа. Число ВМГВ на ребенка значимо сопряжено с уровнем загрязнения (р = 0,002) и носительством минорного аллеля GCLC*129T (р = 0,014).
Ключевые слова: морфогенетические варианты, нефтезагрязнение, дети, полиморфизм генов.
Введение
На природную среду Чеченской Республики (ЧР) на протяжении многих лет отрицательное воздействие оказывает нефтедобывающая и нефтеперерабатывающая промышленность. В проведенных на территории ЧР эколого-генетических исследованиях на видах дикорастущей флоры и растительных тест-системах было показано, что почвы, загрязненные нефтепродуктами, обладают мутагенной активностью и вызывают значительное увеличение уровня мутабильности у видов растений, принадлежащих к различным семействам (Джамбетова и др. 2005, 2006).
Показано, что нефтепродукты вызывают значительное повышение хромосомных аберраций и частоту микроядер у человека, в частности, у рабочих нефтяных компаний в Эквадоре (Paz-y-Minoetal., 2008), Индии (Krishnamurthietal., 2008) и Португалии (RomaTorreset al.,2006). В качестве биомаркера определения генотоксического воздействия различных факторов окружающей среды возможно использование частоты врожденных морфогенетических вариантов (ВМГВ) (Соленова Л.Г. и др., 2004), которые являются стойкими морфологическими изменениями органа, выходят за пределы границ вариации нормального строения, но не нарушают функции органа (Рахманин Ю.А., Ревазова Ю.А., 2004).
В данном исследовании изучены частота ВМГВ и его сопряженность с полиморфизмом генов детоксикации, репарации и оксидативного ответа у детей, проживающих на территориях с различным уровнем загрязнения окружающей среды нефтепродуктами.
Генетический полиморфизм рассматривают как один из важных факторов, определяющих индивидуальную чувствительность людей к действию различных повреждающих агентов, в том числе токсических и мутагенных соединений (Ревазова и др., 2009).
В настоящее время значимыми в экологии человека и экологической генетике являются исследования ответа человека на мутагенные воздействия факторов среды, выявляющие генотипы, ответственные за возникновение патологических состояний при воздействии различных агентов.
Материал и методика Исследования проведены в 6 населенных пунктах Чеченской Республики, характеризующихся различным уровнем загрязнения почвы нефтепродуктами: селах Долинск (Грозненский район) и Мескер-Юрт (Шалинский район), где более 15 лет производилась первичная переработка нефти; в селах Гойты (Урус-Мартановский район), Червленая (Наурский район), Зандак (Ножай-Юртовский район), Шатой (Шатойский район), в которых подобного производства не было, но отмечается различный уровень загрязнения нефтепродуктами.
Для изучения влияния загрязнения окружающей среды на здоровье детей проведено комплексное обследование школьников начальных классов средних школ ЧР в возрасте 7-10 лет. В обследовании участвовали только дети из семей коренных жителей района, все они относятся к одной национальности - чеченцы. Родители всех детей, участвующих в обследовании, подписали формы информированного согласия. Данные по половым и возрастным характеристикам представлены в табл. 1.
Таблица 1.
Половые и возрастные характеристики групп детей из Чеченской Республики
Характеристика Зандак Гойты Шатой Червленая Долинск Мескер-Юрт
Число обследованных 51 50 50 50 64 8.53±0.19
в том числе: мальчиков 25 25 24 28 34 30
девочек 26 25 26 22 30 29
Средний возраст детей (хСр.± т) 8,92±0,32 8,72±0,09 8,22±0,12 8,60±0,23 9,08±0,65 8,35±0,09
Средний возраст матери (хср.± т) 29,76±0,79 28,5±0,99 29,00±0,79 28,32±0,83 26,72±0,76 25,54±0,84
Средний возраст отца (хср.± т) 33,67±0,89 33,66±0,94 37,16±0,92 34,80±0,98 32,46±0,85 30,50±1,02
Использовали методику изучения ВМГВ, разработанную на кафедре клинической генетики Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова, которая была апробирована во многих регионах России (Бочков и др., 1994).
Проводили полный наружный осмотр детей, регистрировали 85 четко распознаваемых ВМГВ (Котышева, 2007).
Материалом для изучения полиморфизма генов являлись клетки периферической крови - лимфоциты (забор 100-200 мкл крови из безымянного пальца левой руки ребенка).
Для изучения полиморфизма изучаемых генов из лимфоцитов крови выделяли ДНК с помощью наборов Diatom DNA Prep 200, основанных на использовании гуанидинтиоцио-ната и Nucleus-сорбента.
Генотипирование осуществлялось с использованием аллельспецифической тетрапрай-мерной полимеразной цепной реакции (ПЦР). Метод позволяет в одной пробирке ампли-фицировать фрагменты ДНК, соответствующие альтернативным аллелям. Продукты амплификации разделяли электрофорезом на агарозном геле без использования флуоресцентных меток.
Список изученных локусов приведен в табл. 2.
Статистическую обработку результатов исследований проводили стандартными методами с помощью пакета программ SPSSStatistics 17.0.
Таблица 2.
Характеристика полиморфных сайтов изученных генов
Ген Полиморфизм * Инд. номер Функция**
Репарация двунитевых разрывов ДНК (контроль клеточного цикла, гомологичная рекомбинация ДНК, негомологичное соединение (non-homologous end joining - NHEJ) двунитевых разрывов ДНК)
ATM 5557G>A rs1801516 Asp1853Asn
Tp53 215C>G rs1042522 Pro72Arg
Эксцизионная репарация нуклеотидов
ERCC1 354T>C rs11615 Asn118=
XPD (ERCC2) 862G>A rs1799793 Asp312Asn
XPD (ERCC2) 2251A>C rs13181 Lys751Gln
Эксцизионная репарация оснований
XRCC1 580C>T rs1799782 Arg194Trp
XRCC1 1196A>G rs25487 Gln399Arg
PARP1 (ADPRT) 2285T>C rs1136410 Val762Ala
APEX1 444T>G rs1130409 Asp148Glu
OGG1 977C>G rs1052133 Ser 326 Cys
Детоксикация ксенобиотиков, фаза 1
CYP1A1 -27+606T>G rs2606345 Intronic
CYP1A1 *947+242T>C (T3801C) rs4646903 nearGene-3
CYP1A1 1384A>G(A4889G) rs1048943 Ile462Val
CYP1B1 1294G>C rs1056836 Leu432=
Детоксикация ксенобиотиков, фаза 2
GSTM1 Ins/Del - Null-allele
GSTT1 Ins/Del - Null-allele
GSTP1 313A>G rs1695 Ile105Val
NQO1 559C>T rs1800566 Pro187Ser
ABC-транспортер
ABCB1 (MDR1) 3435T>C rs1045642 Ile1145=
Оксидативный стресс
SOD2 47T>C rs4880 Val16Ala
CAT -89A>T(T21A) rs7943316 UTR-5
GCLC -484-110C>T (C129T) rs17883901 nearGene-5
Метилирование
MTHFR 665C>T(C677T) rs1801133 Ala222Val
Результаты исследования Согласно классификации показателей уровня загрязнения земель химическими веществами изучаемые населенные пункты разделены на две группы (табл. 3) (Порядок определения размеров ущерба от загрязнения земель химическими веществами, 1993).
По содержанию нефтепродуктов в почвах (содержание нефтепродуктов менее 25 мкг/г почвы) населенные пункты Гойты, Зандак, Червленая и Шатой относятся ко 2 низкому
уровню загрязнения (Порядок определения размеров ущерба..., 1993), что позволило принять их в качестве условно чистой зоны. Учитывая, что в условно чистой зоне не проводилась кустарная переработка нефти, подобное загрязнение почвы можно объяснить переносом веществ воздушными потоками.
Населенные пункты Долинск и Мескер-Юрт (содержание нефтепродуктов выше 40 мкг/г почвы), принятые в качестве загрязненных зон (табл. 3), относятся к 4 высокому уровню загрязнения земель химическими веществами (Порядок определения размеров ущерба., 1993).
С использованием ВМГВ в качестве индикатора морфогенетических отклонений пре-натального развития под действием антропогенных факторов проведен популяционный анализ данных признаков у детей ЧР, проживающих на условно чистых и загрязненных территориях. В табл. 3 представлены данные по уровню загрязнения почв нефтепродуктами и среднему числу ВМГВ на 1 ребенка в изученных населенных пунктах ЧР.
Таблица 3.
Частота ВМГВ у детей, проживающих в исследуемых населенных пунктах
Село Уровень загрязнения, Среднее число врожденных
мкг/г почвы морфогенетических вариантов
N М±т
Зандак 18,0 51 2,6 ±0 ,18
Гойты 19,0 50 2,3 ±0,21
Червленая 21,7 50 2,4 ±0,20
Шатой 24,7 50 2,0 ±0,19
Мескер-Юрт 42,5 59 2,7 ±0,20
Долинск 42,5 63 3,2 ±0,18
ВМГВ. Распределение детей по количеству ВМГВ на 1 ребенка в изучаемых населенных пунктах представлено в табл. 4. Результаты исследования показали достоверно высокое значение среднего числа ВМГВ на одного ребенка в загрязненной зоне по сравнению с условно чистой (р = 0,0005).
Таблица 4.
Распределение и средние значения врожденных морфогенетических вариантов
В ЧИСТЫХ И ЗАГРЯЗНЕННЫХ НЕФТЕПРОДУКТАМИ РАЙОНАХ ЧР
Показатель Количество ВМГВ Уровень загрязнения, мкг/г почвы
< 25 >40
N % N %
Количество врожденных морфогенетических вариантов 0 21 10,44 3 2,46
1 41 20,39 12 9,84
2 56 27,86 21 17,21
3 41 20,39 35 28,69
4 29 14,43 26 21,31
5 11 5,47 17 13,93
6 0 0,0 6 4,92
7 2 0,99 2 1,64
М±т 2,34 ± 0,10 2,94 ± 0,15
Различия распределений по %2-критерию: р = 0,009
Различия средних по тесту Манна-Уитни: р = 0,0005
Число показателя морфогенеза на одного ребенка варьирует от 0 до 7. В условно чистых населенных пунктах 58,71% детей с минимальным количеством ВМГВ (0-2), в загрязненных селах в 2 раза меньше (29,51%). Со средним числом показателей морфогенеза (3-4) в условно чистых селах 34,83% детей, в селах, характеризующихся повышенным уровнем загрязнения, половина (50%) имеют 3-4 ВМГВ.
Показано, что у детей с 5 и более ВМГВ выявлена предрасположенность к развитию экологически обусловленной патологии и снижению адаптационных возможностей организма (Котышева Е.Н., 2007), в связи с чем детей, имеющих более 5 показателей морфогенеза, можно отнести к группе риска. По полученным данным, группа риска условно чистой зоны включает 13 детей (6,47%). В нефтезагрязненных населенных пунктах (с. До-линск и Мескер-Юрт) выявлено 25 детей, то есть каждый пятый ребенок входит в группу риска (20, 49%).
Изучение сопряженности полиморфизма генов детоксикации, репарации и оксидатив-ной защиты с врожденными морфогенетическими вариантами в изученных группах детей показало значимую корреляцию только с минорным аллелем гена оксидативной защиты GCLC*129T (р = 0,014) (рис. 1). По остальным 22 полиморфным вариантам изученных генов не была выявлена сопряженность с показателями морфогенеза.
Как видно из рис. 1, носители минорного генотипа гена GCLC имеют более высокий уровень врожденных морфогенетических вариантов, в когорте детей из загрязненных нефтепродуктами районов частота ВМГВ в полтора раза выше по сравнению с детьми из экологически чистой зоны.
Рис. 1. Среднее число ВМГВ для носителей различных генотипов по локусу GCLC*129T
ОБСУЖДЕНИЕ
Результаты научных работ последнего времени свидетельствуют о высокой чувствительности показателя ВМГВ к воздействиям химических поллютантов окружающей среды на здоровье населения. Выявлена закономерность в увеличении среднего числа ВМГВ в зависимости от степени и характера химического загрязнения окружающей среды в различных городах России (Бочков Н.П.,1994, Котышева Е.Н., 2007).
Наши предыдущие экспериментальные исследования, проведенные на территории Чеченской Республики, убедительно показали наличие генотоксического влияния почв, загрязненных нефтепродуктами, на уровень мутабильности у видов природной флоры и тест-систем (Джамбетова, 2005; Джамбетова П.М., Реутова Н.В., 2006) и достоверное повышение частоты цитогенетических нарушений, показателей пролиферации и апоптоза клеток буккального эпителия у детей, проживающих в условиях загрязнения окружающей среды нефтепродуктами (Сычева Л.П., 2007; Джамбетова П.М. и др., 2009).
В данной работе показано значимое влияние нефтезагрязнения на частоту морфогене-тических вариантов у детей (р=0,0005). При этом загрязнение почвы менее 25 мкг/г дает среднее значение ВМГВ, характерное для городов со смешанным уровнем загрязнения (Бочков, 1994), в то время как повышение загрязнения нефтепродуктами выше 40 мкг/г почвы достоверно увеличивает уровень ВМГВ, что говорит о воздействии нефтепродуктов.
Проведенный регрессионный анализ показателя ВМГВ выявил (табл. 5), что число ВМГВ на ребенка ощутимо коррелировало с уровнем загрязнения (р=0,002) и носительст-вом минорного аллелягена оксидативной защиты GCLC*129T (р = 0,014).
Таблица 5.
Результаты регрессионного анализа показателя ВМГВ с уровнем нефтезагрязнения
и 23 полиморфными вариантами генов
Факторы B SE Бета* Р DR2**
Константа 1,968 0,182 2,9-10-24
Уровень загрязнения 0,017 0,005 0,146 0,002 0,019
GCLC 129C>T 0,517 0,209 0,118 0,014 0,014
Таким образом, нами впервые проведено исследование уровня ВМГВ у населения, проживающего в условиях загрязнения почвы нефтепродуктами и не имеющего отношения к производственным процессам. В результате выявлено, что повышение частоты ВМГВ у детей в загрязненных населенных пунктах значимо сопряжено с уровнем загрязнения (р = 0,002) и носительством минорного аллелягена оксидативной защиты GCLC* 129T (р = 0,014).
ЛИТЕРАТУРА
1. Бочков Н.П., Субботина Т.И., Яковлев В.В. и др. Изучение врожденных морфогене-тических вариантов у детей // Гигиена и санитария, 1994. № 3. С. 53-55.
2. Джамбетова П.М., Реутова Н.В. Чувствительность растительных и бактериальных тест-систем на определении мутагенного влияния нефтезагрязнений на окружающую среду // Экологическая генетика, 2006. Т. 4. № 1. С. 22-27.
3. Джамбетова П.М., Реутова Н.В., Ситников М.Н. Влияние нефтезагрязнений на морфологические и цитогенетические характеристики растений // Экологическая генетика, 2005. Т. 3. № 4. С. 5-10.
4. Джамбетова П.М., Молочаева Л.Г., Махтиева А.Б., Сычева Л.П. Оценка влияния загрязнения почв нефтепродуктами на цитогенетический статус и показатели апоптоза в клетках буккального эпителия у детей // Экологическая генетика, 2009. Т. VII. № 4. С. 34-40.
5. Котышева Е.Н. Врожденные морфогенетические варианты в эколого-гигиенических исследованиях. Магнитогорск, 2007. 222 с.
6. Порядок определения размеров ущерба от загрязнения земель химическими веществами (утв. Роскомземом 10 ноября 1993 г. и Минприроды РФ 18 ноября 1993 г). 1993. 12 с.
7. Krishnamurthi K., Saravana Devi S., Hengstler J.G., Hermes M., Kumar K., Dutta D., Muhil Vannan S., Subin T.S., Yadav R.R., Chakrabarti T. Genotoxicity of sludges, wastewater and effluents from three different industries // Arch Toxicol, 2008. № 82 (12). Р. 965-971.
8. Paz-y-Miño C., López-Cortés A., Arévalo M., Sánchez M.E. Monitoring of DNA damage in individuals exposed to petroleum hydrocarbons in Ecuador // Ann N Y Acad Sci., 2008. № 1140. Р. 121-128.
9. Roma-Torres J., Teixeira J.P., Silva S., Laffon B., Cunha L.M., Méndez J., Mayan O. Evaluation of genotoxicity in a group of workers from a petroleum refinery aromatics plant // Mutat Res., 2006. № 604 (1-2). Р. 19-27
ASSOCIATIVITY OF CONGENITAL MORPHOGENETIC OPTIONS AND POLYMORPHISM OF GENES AT CHILDREN OF THE CHECHEN REPUBLIC
P.M. DZHAMBETOVA
Chechen State University 364907, Grozny, 32, Sheripov St.
E-mail: mail@chesu.ru
The conjugate exponent of congenital morphogenetic variants (CMV) in children living in conditions of environmental pollution by products of primary processing of oil, with the genepolymorphism of detoxification, repair and oxidative response is studied for the first time. Number of CMV on one child is significantly associated with the level of contamination (p = 0.002) and the carriage of the minor allele of the gene oxidative protection GCLC* 129T (p = 0.014).
Key words: bone morphogenetic variants, oil pollution, children, gene polymorphism.
Работа поступила 07. 06. 2013 г.
