CC BY
60
УДК - 575.17:575.116.12:575.174.015.3:577.112.825 АНАЛИЗ СОЧЕТАНИЯ МУТАЦИЙ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ А И В АЛЛЕЛЕЙ ГЕНА В-ЛАКТОГЛОБУЛИНА У КРС.
ЕВ. Дроздов, В.В. Заякин, И.Я. Нам
Определены частоты вариантов гена бета-лактоглобулина в стадах коров черно-пестрой, айрширской породы и частного беспородного скота на территории Брянской области. Было установлено несовпадение при определении аллельных вариантов А и В по двум методикам, что может свидетельствовать о рекомбинации ме^цу мутациями во втором и четвертом экзонах гена бета-лактоглобулина.
Ключевые слова: аллельные варианты гена бета-лактоглобулина, Чёрно-пёстрая порода, Аирширская порода, частный беспородный скот, ПЦР-ПДРФ
Бета-лактоглобулин (ßLG) - серосодержащий белок, не осаждается сычужным ферментом. У парнокопытных ßLG встречается как стабильный димер в интервале pH 3,0 - 7,0. ßLG крупного рогатого скота состоит из 178 аминокислот и имеет молекулярный вес мономера около 18300 дальтон [1]. Содержание ßLG в молоке крупного рогатого скота составляет около 0,4 г/л [2,3].
Последовательность ßLG жвачных проявляет консерватизм на уровне 96%-99%. Биологическая функция ßLG состоит предположительно в транспорте витамина А. Кроме того, ßLG жвачных связывает in vitro длинноцепочечные жирные кислоты и триглицериды. Играет важную роль в обеспечении качества молока, влияет на коагуляцию молока, образования сыра и масла.
Ген ßLG имеет размер 4662 п.о. и состоит из 7 экзонов и 6 интронов. В настоящее время известно 10 генетически обусловленных аллельных вариантов ßLG - A B, C, D, E, F, G, I, J, W. Наиболее часто встречаются четыре аллеля - A, B, C и D. Определенные генетические варианты гена бета-лактоглобулина коррелируют с высоким содержанием казеина и жирности молока. Так вариант B связан с высоким содержанием в молоке казеиновых белков, высоким процентом жира и параметрами казеинового коагулята, а вариант A характеризуется высоким содержанием сывороточных белков и суммарным содержанием белков молока [4].
Изучив полиморфизм локуса ßLG, Aschaffenburg, и Drewry [5,6], установили, что отличие аллеля А от В определяется в аминокислотной позиции 64 (Asp в A, Gly в В) и позиции 118 (Val в А, Ala в В).
Типирование А и В аллелей ßLG с помощью метода ПЦР-ПДРФ, основано на выявлении одной из этих мутаций.
Идентификацию аллельного полиморфизма ßLG по точечной замене в нуклеотидной последовательности в экзоне 4 предложил Medrano J.F. et al [7] в 1990г. Эта мутация предполагает появление дополнительного сайта рестрикции для эндонуклеазы HaelII и замене в пептидной последовательности аминокислоты Val на Ala для В варианта в положении 118.
Другая методика, определения аллелей А, В. Си D была предложена Гладырь Е.А. [8]. По этой методике вариант В определяется по замене аминокислоты Asp на Gly в положении 64. Данная мутация определяется с помощью рестриктаза PvuII.
В связи с тем, что в настоящее время разработаны две методики, позволяющие согласованно выявлять А и В варианты гена бета-лактоглобулина, стало возможным предположить наличие рекомбинации между мутациями расположенных в разных частях гена типирующих В-аллель ßLG.
Целью нашего исследования было выявление случаев несоответствия при определении аллельных вариантов АиВпо двум методикам, основанных на анализе мутаций расположенных в разных частях гена ßLG КРС и определить частоты встречаемости генотипов гена бета-лактоглобулина в анализируемым группах КРС на территории Брянской области.
Материалы и методы
Исследования проводились на образцах ДНК, полученных из крови коров чёрно-пестрой (n=36) ОАО «Снежка», айрширской (n=45) СПХ Сельцо и частного скота (n=61). В качестве антикоагулянта использовали ЭДТА (0,5М).
ДНК выделяли из образцов крови стандартным методом с применением SDS и протеиназы К с перерасчётом объемов растворов на 500 мкл цельной крови.
Для изучения полиморфизма ßLG был использован метод полимеразной цепной реакции с последующим рестрикционным анализом продуктов амплификации (ПЦР-ПДРФ).
Таблица 1
Характеристика праймеров используемых для определения вариантов гена РЬО
Маркер Последовательность праймера, 5’-3’ Температура отжига, °С Методика
BLG/PvuII cta-ttg-tcc-tcg-tag-agg-aag-c aga-aag-ccc-tgg-ata-agc-agc-c 60 Гладырь Е.А., 2001
BLG/HaeIII tgt-gct-gga-cac-cga-cta-caa-aaa-g gct-ccc-ggt-ata-tga-cca-ccc-tct 55 Medrano, et al., 1990
Типирование аллелей генов проводили в соответствии с оригинальными методиками авторов, указанных в таблице.
Реакцию проводили в амплификаторе «Терцик» фирмы «ДНК-технология». ДНК денатурировали при 94°С в течение 4 минут, а затем в 2% агарозном геле. проводили 35 циклов амплификации в следующем режиме: 94°С - 1мин., отжиг - 1 мин (при температуре указанной в таблице 1), 72°С - 1мин. Конечный этап синтеза проводили при 72°С в течение 4 мин.
Для тестирования аллельных вариантов PLG по методикам [7,8], продукты амплификации в течение часа при 37°С обрабатывали соответствующими эндонуклеазами. Продукты рестрикции разделяли.
Результаты
Для выявления аллельных вариантов PLG нами выбраны методики, в основе которых лежит анализ точечных нуклеотидных замен в экзонах 2 и 4. Каждая из этих методик выявляет одну из двух мутаций характерных для аллеля В. Методика [8] в позиции 64 аминокислотной последовательности и [7] в позиции 118. Проводя анализ по этим методикам можно учитывать эти две замены.
По методике (Medrano, et al., 1990) амплифицировали фрагмент ДНК включающий участок 4 интрона и 4 экзона 247 п.о. Вариант В от А отличается наличием дополнительного сайта для рестриктазы HaeIII. После обработки продуктов ПЦР этой рестриктазой появляются специфичные для этих аллелей фрагменты: 148 и 99п.о. - для А варианта и 99, 74 и74 п.о. для В варианта. На рисунке 1(a) показана электрофореграмма фрагментов ДНК после рестрикции эндонуклеазой HaeIII.
По методике (Гладырь и др., 2001) амплифицировали фрагмент длиной 1248 п.о. После рестрикции по сайтам PvuII наблюдали появление специфичных фрагментов длиной 774 и 474 п.о. соответствующих аллелю А. точковая мутация в нуклеотидной последовательности варианта В обуславливает образование дополнительно сайта рестрикции PvuII и приводит к наличию трёх специфичных для аллеля В фрагментов длиной 774, 297 и 177 п.о. фрагменты с длинами соответствующие аллелю D выявлены не были. Рестрикция PstI позволяет определять аллель С. В анализируемых образцах вариант C не обнаружен. Пример определения варианта гена бета-лактоглобулина по этой методике приведен на рис. 1(6)
1 2 3 4 5 6 M 1 2 Э 4 5 6 7
i—
■ —~ ■ ljr
I«*.. ШШШ ШЯШ
IT**
AA BB AH AH HI« AH AH Bll AA AH Hi) AH
Рис. 1. Электрофореграмма продуктов рестрикции при анализе полиморфизма гена бета-лактоглобулина по методикам: a) Medrano, et al., 1900, б) Гладырь и др.,2001. Размер фрагментов ДНК и генотипы указаны на
фотографиях.
Таблица 2
Частоты генотипов PLG у исследуемых пород КРС
порода n ЧАСТОТА ГЕНОТИПОВ, % по методике Г ладырь и др.,2001 ЧАСТОТА ГЕНОТИПОВ, % по методике Medrano, et al., 1900 Частота несовпадений генотипов, %
AA AB BB AA AB BB
Черно-пестрая 36 19,4 50 30,5 19,4 47,2 33,3 2,7
Hex 0,493 0,49
Hobs 0,5 0,472
Аирширская 45 6,6 31,3 62,2 2,2 26,6 71,1 13,3
Hex 0,345 0,262
Hobs 0,311 0,266
Частный скот 61 21,3 52,4 26,2 18 42,6 39,3 9,7
Hex 0,498 0,477
Hobs 0,524 0,426
Результаты анализа генетической структуры изучаемых групп КРС и частоты несовпадений в определении генотипов по описанным методикам указаны в таблице 2.
При оценке полиморфизма гена бета-лактоглобулина у исследуемого крупного рогатого скота наблюдалась повышенная встречаемость генотипов ВВ и АВ. Генотип АВ с большей частотой встречается в поголовье частного стада и у черно-пестрой породы ОАО «Снежка». Максимальное содержание В-аллеля отмечено у айрширской породы СПХ Сельцо. Выявленные нами частоты генотипов в группе коров чёрно-пёстрой породы и частного скота с небольшими отклонениями в сторону увеличения числа гомозигот ВВ (на 7%) соотносятся с частотами генотипов бета-лактоглобулина установленных Гладырь ЕА. в группе чёрно-пёстрых коров ГУП «ПНО Пойма», Московской области и Усенбековым Е.С. в Ленинградской области [8,9]. Частота генотипов в группе коров айрширской породы сравнима с частотами вариантов гена PLG в стаде красной горбатовской породы, анализируемой Гладырь Е.А. в ГУП «Зименки» Владимирской области. В силу отсутствия информации провести сравнение с другими стадами КРС разных пород на территории РФ затруднительно.
Расчёт наблюдаемой (Hobs) и ожидаемой (Hex) гетерозиготности в анализируемых группах коров показывает пропорциональное присутствие гомо- и гетерозигот в изучаемых стадах КРС, за исключением частного стада. В частном стаде отмечается превышение гетерозигот над гомозиготами, что косвенно может свидетельствовать о меньшей вероятности гомозиготизации и потере одного из вариантов гена бета-лактоглобулина по сравнению с другими анализируемыми группами.
При анализе полиморфизма гена бета-лактоглобулина мы обнаружили несоответствия в типировании аллелей этого гена по описанным методикам. На рисунке 3 представлена электрофореграмма, которая иллюстрирует несовпадения при определении аллельных вариантов по представленным методикам. Особенно интересен результат рестрикции фрагментов экзонов 2 и 4 полученных на ДНК образца 109. При рестрикции фрагмента второго экзона 1247 п.о. эндонуклеазой PvuII выявляется типичная картина характерная для АА - варианта гена бета-лактоглобулина, т.е. отсутствие нуклеотидной замены, обеспечивающей появление дополнительного сайта для PvuII, описанного для ВВ-варианта. Напротив, при рестрикции фрагмента экзона 4 этого же образца эндонуклеазой HaeIII наблюдается появление специфичных для В-аллеля фрагментов.
Рис.3. Электрофореграмма продуктов рестрикции при определении вариантов гена бета-лактоглобулина по методикам Гладырь и др.,2001 и Medrano, et al.,1990. 1 - маркер молекулярных масс М27(СибЭнзим). 2,3,4-анализ образца 23; 5, 6, 7 -образец 99; 8, 9, 10 - образец 109; 11, 12, 13 - образец 96; 14, 15, 16 - образец 181. Каждый первыйизтройкитрек -рестрикция эндонуклеазой PvuII , каждый второй - продукты рестрикции Pstl, каждый третий - продукты рестрикции
НаеШ .
Таблица 3
Частоты сочетаний мутаций в генотипах КРС при определении полиморфизма гена бета-лактоглобулина по описанным методикам.
Варианты гена PLG по методике Medrano, et al.,1990
вв АВ АА
АВ 0.61 -
АА 0.22 0.11
ВВ 0.055 -
В таблице 3 отображены частоты встреченных сочетаний аллельных вариантов при определении полиморфизма гена PLG по методикам [7,8]. С наибольшей частотой встречались сочетания АВ/ВВ (0,61) и АА/ВВ (0,22). Сочетание ВВ/АВ было самым редким, а сочетания АВ/АА и ВВ/АА не обнаружены. Генотипы АВ/АВ неотличимы от обычных гетерозигот АВ. В работе Formaggioni P. [10] приведена схема, раскрывающая филогенетические связи между разными вариантами гена бета-лактоглобулина. В основе филогенетического дерева эти авторы расположили В-аллель PLG. Добавляя к этому варианту определенные мутации можно прийти ко всем остальным аллелям. Проведенные нами исследования по выявлению двух мутаций определяющих В-вариант в целом соответствуют приведенной филогенетической связи А- и В-аллелей, но выявленные нами сочетания мутаций не вкладываются в эту схему. Руководствуясь нашими исследованиями, можно предположить, что существуют промежуточные между А- и В-аллелями варианты или что произошла рекомбинация между мутациями во втором и четвертом экзонах гена бета-лактоглобулина с образованием двух новых аллелей.
Frequences of p-lactoglobulin alleles had determinated in herd of black-and-white breed, Aurshire breed and individual cattle at Bryansk region. Obtained results proof fact of recombination between two mutation sites determinating A and B alleles of p-lactoglobulin.
The key words: P-lactoglobulin, black-and-white breed, Aurshire breed, RFLP analysis
Список литературы
1. B-lactoglobulin Droughtmaster: a unique protein variant / Bell K., McKenzie H.A., Murphy W.H., Shaw D.C. // Biochimica et Biophysica Acta. 1970. 214. P. 427-436.
2. Nomenclature of proteins of cow's milk: fifth revision / Eigel W.N., Butler J.E., Ernstrom C.A., Farrell H.M. Jr, Harwalkar V.R., Jenness R., Whitney R.McL. // J. Dairy Sci., Champaign, III. 1984. V. 67. P. 1599-1631.
3. Isolation and rapid sequence characterization of two novel bovine b-lactoglobulins I and J / Godovac-Zimmermann J., Krause I., Baranyi M., Fischer-Frohholz S., Juszczak J., Erhardt G., Buchberger J., Klostermeyer H. // Journal of Protein Chemistry. 1996. 15. P. 743-750.
4. Allelic frequency of kappa-casein and beta-lactoglobulin in Indian crossebred (Bos taurus*Bos indicus) dairy buuls / Patel R.K., Chauhan J.B., Signa K.M., Soni K.J. // Turk. J. Vent.Anim.Sci. 2007. 31(6). P. 399 - 402.
5. Aschaffenburg R., Drewry J. Occurrence of different beta-lactoglobulins in cow’s milk. // Nature. 1955. 176. P. 218-219.
6. Aschaffenburg R., Drewry J. Genetics of the P-lactoglobulins of cow’s milk. // Nature. 1957. 180. P. 376378.
7. Medrano J.F., Aguilar-Cordova E. Polimerase chain reaction - amplification of bovine beta-lactoglobulin genoic sequences and identification of genetic variants by RFLP analysis. //Animal Biotechnology. 1990. 1. 73.
8. Гладырь E.A. ДНК-диагностика вариантов генов каппа-казеина и бета-лактоглобулина у крупного рогатого скота: Автореф. дис. канд. биол. наук. Дубровицы, ВИЖ, 2001.
9. Усенбеков Е.С. Генотипирование крупного рогатого скота по локусам каппа-казеина, бета-лактоглобулина и мутации BLAD: Автореф. дис. канд. биол. наук. Санкт-Петербург, 1995.
10. Formaggioni P., et al., Milk protein polymorphism: detection and diffusion of the genetic
variants in Bos genus, 1999. URL:
http://www.unipr.it/arpa/facvet/annali/1999/formaggioni/formaggioni.htm (Дата обращения: 13.09.2009).
Об авторах
Дроздов Е. В. - аспирант третьего года кафедры ботаники Брянского государственного университета имени академика И.Г. Петровского.
Заякин В.В. - доктор биологических наук, профессор Брянского государственного университета имени академика И.Г. Петровского.
Нам И. Я. - доктор биологических наук, профессор, директор ИННО-центра
биотехнологии и экологии Брянского государственного университета имени академика. И.Г. Петровского, drozdov2008@yandex.ru.
