CC BY
79
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015 УДК 579.843.1:579.25].083.1
Челдышова Н.Б., Крицкий А.А, Краснов Я.М., Смирнова Н.И.
анализ результатов фрагментарного и ПолногЕномного секвенирования атипичных штаммов vibrio cholerae классического биовара, вызвавших вспышку азиатской холеры в россии
ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора, 410005, г. Саратов, ул. Университетская, д. 46
Целью исследования явилось изучение генетических изменений в геноме классических штаммов холерного вибриона, вызвавших атипичную вспышку азиатской холеры в России в 1942-1943 гг. Полногеномное и фрагментарное секвени-рованиеуказанных штаммов выявило наличие мутаций в их структурных (tcpC, tcpF, tcpS, purE) ирегуляторных (vieA, vieS, toxR, hapR, rpoS, crp) генах. Установлено, что гиперпродукция СТ и ТСР, а также отсутствие продукции НАР были вызваны мутациями в регуляторных генах (hapR и rpoS). Ауксотрофность по аденину у штамма V. cholerae М-29 связана с мутацией в гене purE. Таким образом, атипичность эпидемического и клинического процессов при вспышке холеры в России в 1942-1943 гг. была связана с сочетанием фенотипических особенностей вызвавших ее штаммов (ауксотрофность, гиперпродукция СТ, ТСР, отсутствие продукции НАР), обусловленных мутациями в структурных (purE) и регуляторных (hapR и rpoS) генах, с социальными факторами (война, голод, ослабленный организм заключенных).
Ключевые слова: Vibrio cholerae; секвенирование; нуклеотидные последовательности; мутации.
Для цитирования: Эпидемиология и инфекционные болезни. 2015, 20 (5): 24-31.
Cheldyshova N.B., Kritskiy A.A, Krasnov Ya.M., Smirnova N.I.
ANALYSIS OF THE FRAGMENTED AND FULL GENOME SEQUENCING OF ATYPICAL VIBRIO CHOLERAE STRAINS OF THE CLASSICAL BIOVAR, WHICH BROUGHT ABOUT TO THE OUTBREAK OF THE ASIAN CHOLERA IN RUSSIA Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe", 46, Universitetskaya Str., Saratov, Russian Federation, 410005
The aim of the research was the study of genetic changes in the genome of classical strains of Vibrio Cholerae which brought about to the atypical outbreak of Asian cholera in Russia in 1942 -1943. Genome-wide andfragmented sequencing ofmentioned strains revealed the presence of mutations in their structural (tcpC, tcpF, tcpS, purE) and regulatory (vieA, vieS, toxR, hapR, rpoS, crp) genes. The overproduction of CT and TCP, as well as the lack of production NAR were found to be caused by mutations in regulatory genes (hapR and rpoS). Adenine auxotrophy in V. cholerae strain M-29 is associated with a mutation in a gene purE. Thus, atypicality of the epidemic and clinical processes in the outbreak of cholera in Russia in 1942 - 1943 was associated with a combination of phenotypic features(auxotrophy, overproduction CT, TCP, lack of product HAP) of strains which brought it, caused by mutations in the structural (purE) and regulatory (hapR and rpoS) genes with social factors (war, starvation, weakened body of prisoners).
Key words: Vibrio cholerae; .sequencing; nucleotide sequence; mutation.
For citation: Epidemiologiya i InfektsionnyeBolezni. 2015; 20(5): 24-31. (In Russ.)
Холера как особо опасная инфекционная болезнь известна с незапамятных времен, когда эпидемии и пандемии, вызванные Vibrio cholerae Ol-серогруппы классического биовара, ежегодно уносили тысячи жизней. Всего насчитывается 6 пандемий холеры, вызванных V. cholerae Ol-серогруппы классического биовара. Заболевание характеризовалось тяжелым течением, широким распространением, выраженной дегидратацией, большим количеством алгидных форм и летальных случаев (более 40%) [1]. В середине прошлого столетия холерные вибрионы классического биовара были практически полностью вытеснены V. cholerae биовара Эль-Тор, вызвавших седьмую пандемию холеры, продолжающуюся до настоящего
Для корреспонденции: Челдышова Надежда Борисовна, chelna-25@yandex.ru
For correspondence: Cheldyshova N., e-mail: chelna-25@ yandex.ru
времени. Тем не менее штаммы V. с^1егае классического биовара до сих пор выделяются из объектов внешней среды на эндемичных по холере территориях, вызывая отдельные локальные вспышки холеры, в том числе совместно с холерными вибрионами биовара Эль-Тор. Так, вспышки и единичные случаи холеры, вызванной штаммами классического биовара, наблюдались в южных регионах Бангладеш в 1982, 1988-1989 гг., в Мексике в 1991-1997 гг., в Иране и Непале в 2012 г. [2-6]. Имеются также сообщения о выявлении в речной и морской воде (1996-1999 и 2006-2009), а также от больных и носителей (19862004) как классических, так и гибридных штаммов V с^1егае, несущих фено- и генотипические признаки и классического, и Эль-Тор биоваров [7-12]. Все это говорит о том, что классические вибрионы продолжают циркулировать во внешней среде, вызывая угрозу возникновения вспышек холеры и новых штаммов с необычными свойствами.
На территории России последняя вспышка азиатской холеры наблюдалась в 1942-1943 гг. в нескольких городах Поволжья, Прикаспия и Приуралья. В отличие от предыдущих эпидемий данная вспышка характеризовалась атипичностью инфекционного и эпидемического процессов. Так, несмотря на условия военного времени, для вспышки 1942-1943 гг. были характерны сравнительно низкие показатели заболеваемости (среднегодовой показатель заболеваемости на 100 тыс. населения составил 23,1, что на порядок ниже, чем при эпидемиях 1892-1894 и 1918-1923 гг.), значительный уровень длительного вибрионосительства и легких клинических форм (34-52%) на фоне высокой летальности (42,2%), особенно среди заключенных (57,2%) [13]. Интересен и тот факт, что основным путем передачи инфекции служил контактно-бытовой, а не водный путь, характерный для Поволжского региона.
Проведенное ранее исследование фенотипиче-ских свойств штаммов, вызвавших подобное своеобразие вспышки, выявило наличие у них следующих особенностей: суперпродукции основных факторов вирулентности холерного вибриона - холерного токсина (СТ - от cholera toxin) и токсинкорегулируе-мых пилей адгезии (ТСР - от toxin coregulatedpilus), высокой вирулентности, практически полного отсутствия продукции растворимой гемагглютинин/ протеазы (НАР - от haemagglutinin/protease) и аук-сотрофности (в основном по аденину) [13].
Ответственность за синтез СТ несут гены ctxAB, расположенные на мобильном генетическом элементе (МГЭ) - профаге СТХф. Синтез ТСР осуществляет оперон tcpA-F, также расположенный на МГЭ - острове патогенности VPI-I. Экспрессия указанных генов вирулентности находится под контролем регуляторно-го каскада (tcpPH, toxRS и toxT), генов регуляторной системы «quorum sensing» (luxO-P, rpoN, rpoS, hapR), а также генов арhAB, crp, vieABC, h-ns и др. [8, 14-18]. За продукцию НАР отвечает ген hapA, контролируемый регуляторной системой «quorum sensing» [19, 20].
Ауксотрофность штамма может быть вызвана мутациями в одном из генов, ответственных за обмен соответствующей аминокислоты или азотистого основания. В частности, причиной ауксотрофности по аденину может быть мутация в одном из генов pur (purA, purB, purE, purK и др.) [21].
Проведенный нами ранее ПЦР-анализ основных структурных и регуляторных генов, ответственных за вирулентность и жизнеобеспечение у штаммов, выделенных в 1942-1943 гг., не выявил каких-либо особенностей [13], в связи с чем было решено провести более глубокое изучения генома данной группы штаммов с помощью секвенирования.
Цель данной работы состояла в изучении генетических изменений в геноме атипичных классических штаммов холерного вибриона, вызвавших вспышку азиатской холеры в России в 1942 - 1943 гг., на основе анализа их фрагментарного и полногеномного сиквенса.
Материалы и методы
В работе было использовано 12 клинических штаммов V. cholerae классического биовара, выделенных от больных в 1942-1943 гг. на территории Саратовской (5 штаммов), Волгоградской (1 штамм), Астраханской областей (3 штамма) и в Уфе (3 штамма), а также 1 штамм, изолированный из воды в Астрахани. Указанные штаммы были получены из Государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ «Микроб», где они хранились в лиофилизированном состоянии. Культивирование бактерий производили на бульоне и агаре Luria-Ber-tani (LB).
Бактериальную ДНК выделяли с помощью коммерческого набора ДНК-сорб (AmpliSens, Россия) по прилагающейся к нему инструкции. Амплификацию фрагментов генома проводили на программируемом термоциклере с горячей крышкой «БИС М112» с помощью олигонуклеотидных праймеров, представленных в таблице.
Фрагментарное секвенирование ДНК исследуемых штаммов проводили на генетическом анализаторе модели ABI 3500xl. Полученную нуклео-тидную последовательность генов анализировали с помощью программы BioEdit 7.1.3 и сравнивали с таковой у референс-штаммов, представленных в базе данных GenBank.
Полногеномное секвенирование ДНК штамма V. cholerae М-29 осуществляли на приборе для высокопроизводительного секвенирования «PGM» Ion Torrent. Первичный анализ последовательностей ДНК осуществляли с использованием программы Data Collection v 1.0 и Sequencing Analysis Software v. 5.4. Анализ и сравнение полученной полногеномной последовательности с нуклеотидной последовательностью референс-штамма Vibrio cholerae O395 классического биовара, полученной из GenBank, осуществляли с помощью программного обеспечения DNASTAR lasergene Version 11.2.1.25 и BioEdit 7.1.3.
Результаты и обсуждение
На первом этапе исследования мы провели полногеномное секвенирование одного атипичного штамма V. cholerae M-29, выделенного в августе 1942 г. на территории Астрахани из испражнений больного (NCBI GenBank: JFGR00000000). Выбранный штамм отличался высокой продукцией СТ и ТСР, был ауксотрофом по аденину и не продуцировал НАР.
Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей всех генов (кроме гена hapR) штамма М-29 проводился с геномом референс-штамма V. cholerae O395 классического биовара (NCBI GenBank: CP000627.1). Что касается гена hapR, то в связи с тем, что у референс-штамма О395 отмечается делеция аденина в позиции 200, приводящая к сдвигу рамки считывания [22], сравнительный анализ нуклеотидной последовательности гена hapR ати-
Последовательности праймеров, использованных в работе
Название праймера Последовательность праймера (5^3') Длина амплифи-цируемого фрагмента, п.н. Авторы
ctxA-1 CGGGCAGATTCTAGACCTCCTG 740 Fields P. I. et al.,
ctxA-2 CCTGGTACTTCTACTTGAAACG 1992.
ctxB-1 ATGATTAAATTAAAATTTGG 354 Смирнова Н.И.,
ctxB-2 TTAATTTGCCATACTAATTG 2013
prctxAB-1 ATGGGCGACAGGTCATCACATTTAC 557 «
prctxAB-2 GAACTCAGACGGGATTTGTTAGGCA
tcpA-fl1 CTTTGTGTGGTTAAATGTGCG 880 «
tcpA-fl2 AATAATCCGACACCTTGTTGG
zot1-1 TACCATCTATCCGCTTATCC 653 Рассчитаны
zot1-2 TCGTGGGTGGTCAGGGTAA авторами
zot2-1s AACCACGCCTAACATTGCC 718 «
zot2-2s ACCCCGTTTCACTTCTACCC
ürfU1-1s TCCGCATTTGCTAACCAAG 688 «
orfU1-2s GACCTGATTGAACGCAGAC
orfU2-1s CCGATGTGCGACTTGTCCG 629 «
orfU2-2s CAGCGAGCAGGGTTACTACA
orfU-ace-1s AACCCAATCCCACACCACC 649 «
orfU-ace-2s AGCCTGAAGCAAGATAGCC
cep-1 ATGACCAGAAAACTCGAAC 510 «
cep-2 CACGGTAACAATCAGAACA
prtcpAF-1 TTTCTCGCCTTCCCTTACA 673 «
prtcpAF-2 CATACCCTCTTGACCGGTTT
prtoxR-1 GGCTTTCGTTGCTGCCTA 636 «
prtoxR-2 GTCATACCGATCCCGTTATCC
prtoxT-1 AAGGAGATGGAAGTGGTGTG 708 «
prtoxT-2 CTTTCGAGAAGAACCCTGAA
hapR-1 CAAGGATATACCCCTATGGAC 907 «
hapR-2 TGAAAAAAGCTGCTGCCTTAG
hapA-1 GTGTTTTTCATTGACTT 682 «
hapA-2 ATCCCATTGGTCTAGC
hapA2-1 TGGAAAACGAAAGTGTGCAA 620 «
hapA2-2 GCTGACCTCATGGGCACTAAC
hapA3-1 TACTCACCGCTTAACGAC 724 «
hapA3-2 CTCAAGCACTTTGCCGACA
hapA4-1 ACGTGATGGCCGCTCGATA 898 «
hapA4-2 AACTGGCTTCTCGCACC
vieA-1* CAGTTGAGCCAGTTGACCTA 573 «
vieA-2 GCCTACCTAAGCCCTACGAA
vieS-1* TTATTCGCTCTGATACTGATG 1984 «
vieS-2 TTACGCAGCTCCGAACAAG
пичных штаммов проводился с интактнои нуклео-тидной последовательностью данного гена у штамма V. cholerae C6706 (NCBI GenBank: EU523710.1).
Сопоставление геномов штамма М-29 и О395 методом Blast N выявило наличие у штамма М-29 624 одиночных нуклеотидных полиморфизмов.
В первую очередь нас интересовали причины по-
вышенной продукции штаммами СТ и ТСР. Увеличение продукции указанных факторов вирулентности могло быть вызвано мутациями в структурных генах, ответственных за синтез СТ (ctxAB) и ТСР (tcpA-F), а также изменениями в промоторных областях оперонов ctxAB и tcpA-F. Для проверки этого предположения мы провели анализ нуклеотидной
последовательности профага СТХф штамма М-29, который показал 100% идентичность с профагом референс-штамма О395. Нам не удалось обнаружить никаких отличий ни в генах ctxAB, ни в других генах коровой области профага СТХф и RS2- последовательности. Фага RS1 выявлено не было, что характерно для классических вибрионов. Фрагментарное секвенирование структурных генов профага СТХф (ctxAB, асе, zot, сер, orfU и psh) у остальных 12 атипичных штаммов также не выявило никаких изменений.
Анализ промоторной области оперона ctxAB штамма М-29 показал наличие 4 гептаповторов (TTTTGAT), которые являются сайтами связывания для регуляторных белков ToxR и ToxT [16, 23]. Подобное количество гептаповторов в промоторной области ctxAB характерно для Эль-Тор вибрионов и нехарактерно для классических вибрионов, несущих обычно 6-8 гептаповторов. Увеличенное вдвое количество гептаповторов в геноме классических вибрионов, по мнению некоторых авторов [16, 23], может быть одной из причин повышенной продукции ими СТ. Фрагментарное секвенирование промоторной области ctxAB у 11 из 12 исследованных нами атипичных штаммов также выявило наличие лишь 4 гептаповторов. Только один штамм М-9, выделенный из речной воды в Астраханской области, содержал 7 гептаповторов, как и референс-штамм O395. Таким образом, увеличение продукции СТ у атипичных классических штаммов не было связано с изменениями в генах ctxAB или в промоторной области данного оперона.
Сравнительный анализ оперона tcpA-F показал наличие у штамма М-29 трех однонуклеотидных несинонимичных замен в генах tcpC (А/G в позиции 610 п.н. от начала гена и соответственно Lys/ Glu), tcpF (А/G в позиции 707 п.н. от начала гена и соответственно Asn/Ser), tcpS (Т/С в позиции 428 п.н. от начала гена и соответственно Phe/ Ser). Продукт гена tcpF, белок TcpF, участвует в колонизации и стабилизации биопленки [24]. Белки ТсрС и TcpS, кодируемые соответственно генами tcpC и tcpS, формируют поры, необходимые для транспорта белков TcpF и TcpA на внешнюю мембрану [24, 25]. Можно предположить, что наличие указанных мутаций способствовало более эффективному выходу белков TcpF и TcpA на поверхность клеточной мембраны холерного вибриона. Однако для подтверждения этого предположения необходимо проведение дополнительных исследований.
В промоторной области оперона tcpA-F ни у одного из атипичных штаммов изменений выявлено не было.
Следующим этапом нашей работы явилось изучение нуклеотидных последовательностей регуляторных генов, контролирующих продукцию СТ и ТСР, а также промоторных областей некоторых регуляторных генов. Из 20 исследованных нами регуляторных генов (vieAS, aphAB, tcpPH, toxR, toxT, toxS,
hapR, h-ns, rpoN, rpoS, ihfAB, relA, luxO, luxU, luxP и crp) только 6 генов (vieA, vieS, toxR, hapR, rpoS, crp) отличались по своему нуклеотидному составу от референс-штамма О395. Три из шести указанных генов (vieA, vieS, toxR) оказывают позитивное влияние на гены ctxAB и tcpA, в то время как гены hapR, rpoS и crp являются негативными регуляторами указанных генов. Ни в одной из 4 промоторных областей
(PtoxT PtoxR, PaphAB и PtcpPH) изменений обнаружено не
было.
Первое, на что мы обратили внимание, было наличие протяженной делеции, захватывающей сразу 2 гена vieA (1560 п.н.) и vieS (557 п.н.), составляющих трехкомпонентную систему vieSAB. По данным А. Tischler и соавт., [18] данная система снижает концентрацию в клетке c-di-GMP, ингибирующего связывание белка ТохТ с промоторами ctxAB и tcpA-F оперонов. Наличие указанной мутации в генах vieA и vieS было подтверждено с помощью ПЦР-анализа еще у 9 атипичных штаммов. Однако протяженная делеция в регуляторных генах vieA и vieS, позитивно регулирующих гены ctxAB и tcpA, с большей вероятностью привела бы к снижению продукции CT и ТСР, чем к их повышению. Однонуклеотидная несинонимичная замена (А/G в позиции 668 п.н. от начала гена, приводящая к замене His/Arg) обнаруженная нами в глобальном гене-регуляторе toxR, не затрагивала ДНК-связывающий домен белка ToxR и вследствие этого вероятно не оказала существенного влияния на экспрессию генов СТ и ТСР. Таким образом, мутации в генах, ответственных за позитивную регуляцию генов вирулентности холерного вибриона, видимо не могли привести к повышению экспрессии СТ и ТСР.
В связи с этим большой интерес вызвало у нас обнаружение 5 SNP в трех негативных регуляторах генов вирулентности: hapR, rpoS и crp. Два из этих генов - hapR и rpoS - входят в единую регулятор-ную систему и тормозят экспрессию гена aphA, а через него гены вирулентного каскада (tcpPH и toxT) и соответственно гены ctxAB и tcpA [8, 17-20]. Ген crp кодирует синтез белка-рецептора CRP, который в комплексе с циклическим аденозинмонофосфатом на поздней стадии инфекционного процесса блокирует связь белков AphA и AphB с tcpPH-промотором, в результате чего синтез факторов вирулентности подавляется [8].
Особого внимания, на наш взгляд, заслуживают 2 однонуклеотидные несинонимичные замены: С/Т в позиции 337 от начала гена rpoS, ведущая к образованию стоп-кодона «Опал», или TGA (рис. 1, а и б) и G/А в позиции 53 гена hapR, приводящая к замене аргинина (Arg18) на гистидин (His18). Наличие последней мутации подтверждено фрагментарным секвенированием у 11 из 12 оставшихся штаммов (рис. 2, а и б).
Наличие в гене rpoS стоп-кодона в первой трети транслируемой мРНК приводит к образованию дефектного белка RpoS, который не способен к полно-
Рис. 1. Фрагменты нуклеотидных последовательностей гена rpoS (а) и аминокислотных последовательностей белка RpoS (б) референс-штамма О395 и штамма V. cholerae классического биовара М-29, выделенного в 1942 г в Астрахани.
Идентичные нуклеотиды и аминокислоты обозначены точками. Буквами выделены триплеты, содержащие однонуклеотидные замены в позициях 337 и 989, а также аминокислота, не соответствующая таковой, белка Яро8 референс-штамма V. cholerae О395 в позиции 330. Звездочками обозначены позиции белка Яро8, соответствующие стоп-кодонам.
ценному выполнению своей регуляторной функции по прекращению экспрессии СТ и ТСР при достижении высокой клеточной плотности.
Что касается гена hapR, то по данным R. Silva и со-авт. [17], Arg18 входит в состав ДНК-связывающего домена белка HapR и принимает непосредственное участие во взаимодействии с фосфатными группами нуклеотидов промоторной области гена aphA. Замена аргинина, обладающего достаточно силь-
ными основными свойствами, обусловливающими его способность образовывать ионные связи с фосфатными группами нуклеотидов промоторной области, на гистидин, обладающий слабыми основными свойствами, вероятно, и обусловило снижение, а возможно, и полное отсутствие репрессивных свойств белка НарЯ в штамме V. cholerae М-29.
Косвенным подтверждением влияния указанных мутаций на продукцию rpoS и эффективность свя-
Рис. 2. Фрагменты нуклеотидных последовательностей гена hapR (а) и аминокислотных последовательностей белка НарЯ (б) референс-штамма V. cholerae С6706 и атипичных штаммов V. cholerae М-8, М-9, М-14, М-16, М-18, М-19, М-22, М-24, М-29, М-30, М-34, М-35, М-40, выделенных в 1942-1943 гг. в Поволжье и Приуралье.
Идентичные нуклеотиды и аминокислоты обозначены точками. Буквами выделены триплеты, содержащие однонуклеотидные замены в положениях 53 и 85, а также аминокислоты, не соответствующие таковым, белка НарЯ референс-штамма V. cholerae С6706, в позициях 18 и 29.
I
0335 М-2 9
I .... I .... I .... I
10 20 ATGACAGTCGGTATTATCATGGGTT
I i i i i I in i I i i i i I i i i i I i
200 210 CGCTGCGCATC-TTCCCGGAAT ..........CAT.........
. I .... I .... I .... I .... I . .
470 480
AACCCAAATCCGGCTGAGGAGTAA
I
I
.......................I ' ' ......I
10 20 70 80
ОЗЭ5 MTVGIIMGSKSEWPTMKHAAEMLDQF GAAHLPGMTAAFTSLPVLGVPV M_29 .......................... ....HSRNDRRIH* .ASVRRAR
. | ... . | .... | ... . | ...... .
140 150 160
SKVEAFRAKQTCSVLDNPNPAEE* E*SGS.PR*AESXCVG*.KSG*GV
Рис. 3. Фрагменты нуклеотидных последовательностей гена ригЕ (а) и аминокислотных последовательностей белка РигЕ (б) референс-штамма О395 и штамма V. сНо1егае классического биовара М-29, выделенного в 1942 г. в Астрахани. Идентичные нуклеотиды и аминокислоты обозначены точками. Буквами выделен триплет, содержащий однонуклеотидную вставку в позиции 206 и аминокислоты, не соответствующие таковым, белка РигЕ референс-штамма V. сНо1егае О395. Звездочками обозначены позиции белка РигЕ, соответствующие стоп-кодонам.
зывания белка HapR с промоторными областями генов aphA и hapA является и тот факт, что у всех атипичных штаммов практически полностью отсутствовала продукция НАР. Ответственность за синтез НАР несет ген hapA, позитивно регулируемый каскадом, в состав которого входят гены rpoS и hapR [19, 20, 22]. Анализ нуклеотидной последовательности самого гена hapA у всех исследованных штаммов не выявил отличий от референс-штамма О395. В то же время фрагментарное секвенирование гена hapR подтвердило наличие обеих замен ещё у 11 из 12 штаммов. Только у штамма М-9, выделенного из воды в Астрахани, обладающего продукцией НАР и отличающегося более низкой продукцией СТ и ТСР, чем другие штаммы, выделенные в 1942 г., отличий от штамма О395 выявлено не было. По данным различных американских авторов, повреждение хотя бы одного из регуляторных генов rpoS и/или hapR ведет к снижению, а то и полному отсутствию продукции у штамма HAP и повышению продукции СТ и ТСР [19, 20]. В связи с этим мы считаем, что наличие значимых мутаций сразу в двух регуляторных генах rpoS и hapR, оказывающих негативное влияние на регуляторный каскад на поздней стадии инфекционного процесса, может способствовать повышенной продукции СТ и ТСР.
На последнем этапе нашей работы мы изучили причины ауксотрофности штамма V. cholerae М-29 по аденину. Анализ полногеномной нуклеотидной последовательности показал, что в геноме штамма М-29 в гене purE, ответственном за синтез фосфо-рибозиламиноимидазолкарбоксилазы (EC 4.1.1.21), принимающей участие в метаболизме аденина [21], имелась вставка аденина в позиции 206 от начала гена, приводящая к сдвигу рамки считывания и образованию стоп-кодона (рис. 3, а и б), что вероятно и послужило причиной ауксотрофности по аденину штамма М-29.
Заключение
В результате проведенных исследований было показано, что атипичность клинических и эпидеми-
ческих проявлений холеры в России в 1942-1943 гг. была связана с генетическими изменениями вызвавших её штаммов, обусловив наличие у них таких фенотипических особенностей, как ауксотрофность по аденину, гиперпродукция СТ и ТСР, отсутствие продукции НАР.
Ауксотрофность по аденину данной группы штаммов была связана с мутацией в гене ригЕ, приводящей к отсутствию фермента фосфорибо-зиламиноимидазолкарбоксилазы, участвующего в метаболизме аденина. Вследствие этого указанные штаммы, попадая в организм ослабленных голодом и тяжелой работой заключенных, долгое время не вызывали типичной клинической картины холеры из-за медленного нарастания клеточной популяции, которая для своего роста требовала наличия аденина. Это же свойство штаммов препятствовало и распространению вибрионов водным путем. Тем не менее штаммы, попавшие в организм человека из-за отсутствия тормозного воздействия белков RpoS и НарR, синтезировали значительное количество ТСР и СТ. Однако активация СТ происходила достаточно медленно из-за практически полного отсутствия НАР, активирующей СТ, путем расщепления его молекулы на 2 субъединицы: А1 и А2 [13, 19]. Это способствовало развитию легких и стертых клинических форм. Причиной снижения продукции НАР также являлось отсутствие регуляторных белков RpoS и НарR, инициирующих экспрессию гена На-рА. Недостаток НАР, разрушающей на поздней стадии эпидемического процесса рецепторы кишечного эпителия, способствуя выходу холерного вибриона во внешнюю среду [13, 19], обусловил длительное сохранение вибрионов внутри кишечника, что препятствовало широкому распространению инфекции. В то же время в кишечнике зараженных людей происходило накопление большого количества холерного и других токсинов, обусловливая высокую летальность среди заключенных.
В результате описанных событий штаммы холерного вибриона, вызвавшие вспышку азиатской холеры в 1942-1943 гг., несмотря на их высокую вирулентность
и гиперпродукцию СТ и ТСР, большую скученность и миграцию населения, вызванных войной, не смогли вызвать широкого эпидемического распространения. Это еще раз подчеркивает тот факт, что при развитии эпидемического процесса следует учитывать влияние большого количества факторов, таких как гено- и фе-нотипические особенности микроорганизма, организма хозяина-человека, социально-бытовых условий, своевременность проведения противоэпидемических мероприятий и т. д. Отсутствие одного из указанных факторов или их особое сочетание (например, ослабленный голодом организм хозяина и ауксотрофность микроорганизма на фоне мутаций в регуляторных генах) могут оказать значительное влияние на развитие эпидемического процесса.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ганин В.С. Индийская гостья. В кн.: Ганин В.С. По тропам эпидемических катастроф. Иркутск: НЦРВХ СО РАМН; 2011: 144-6.
2. Alam M., Islam M.T., Rashed S.M., Johura F.T., Bhuiyan N.A., Delgado G. et al. Vibrio cholerae classical biotype strains reveal distinct signatures in Mexico. J. Clin. Microbiol. 2012; 50(7): 2212-6.
3. Bakhshi B., Boustanshenas M., Mahmoudi-aznaveh A. Emergence of Vibrio cholerae O1 classical biotype in 2012 in Iran. Lett. Appl. Microbiol. 2014; 58 (2): 145-9.
4. Rai K.R., Rai S.K., Bhatt D.R., Kurokuwa M., Ono K., Magar D.T. Study of medically important Vibrios in the sewage of Katmandu Valley, Nepal. Nepal Med. Coll. J. 2012; 14(3): 212-5.
5. Samadi A.R., Shahid N., Eusof A., Yunus M., Huq M.I., Khan M.U. et al. Classical Vibrio cholerae biotype displaces El Tor in Bangladesh. Lancet. 1983; 321: 805-7.
6. Siddique A.K., Baqui A.H., Eusof A., Haider K., Hossain M.A., Bashir I. et al. Survival of classic cholera in Bangladesh. Lancet. 1991; 337: 1125-7.
7. Kokashvili T., Elbakidze T., Jaiani E., Janelidze N., Kamkamidze G., Whitehouse C. et al. Comparative phenotypic characterization of Vibrio cholerae isolates collected from aquatic environments of Georgia. Georgian Med. News. 2013; 224: 55-62.
8. Kovacikova G., Skorupski K. Overlapping binding sites for the virulence gene regulators aphA, aphB and cAMP-CRP at the Vibrio cholerae tcpPH promoter. Mol. Microbiol. 2001; 41(2): 393-407.
9. Monakchova E.V. Phenotypic and Molecular Characteristics of epidemic and non-epidemic Vibrio cholerae Strains Isolated in Russia and Certain Countries of Commonwealth of Independent States (CIS). In: Ramamurthy T., Bhattacharya S.K., eds. Epidemiological and Molecular Aspects on Cholera: Infectious Diseases Series. New York: Humana Press; 2010: 185-201.
10. Nair G.B., Faruque S.M., Bhuiyan N.A., Kamruzzaman M., Siddique A.K., Sack D.A. J. New variants of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor with attributes of the classical biotype from hospitalized patients with acute diarrhea in Bangladesh. Clin. Microbiol. 2002; 40: 3296-9
11. Na-Ubol M., Srimanote P., Chongsa-Nguan M., Indrawattana N., Sookrung N., Tapchaisri P. et al. Hybrid & El Tor variant biotypes of Vibrio cholerae O1 in Thailand. Indian J. Med. Res. 2011; 133: 387-94.
12. Pun S.B. The first appearance of classical-like phenotype Vibrio cholerae in Nepal. N. Am. J. Med. Sci. 2014; 6(4): 183-4.
13. Смирнова Н.И., Челдышова Н.Б., Заднова С.П., Кутырев В.В. Молекулярно-генетические особенности штаммов Vibrio cholerae classica, вызвавших эпидемию азиатской холеры в России в 1942 г. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2001; 4: 12-6.
14. Смирнова Н.И., Заднова С.П., Агафонов Д.А., Шашко-ва А.В., Челдышова Н.Б., Черкасов А.В. Сравнительный молекулярно-генетический анализ мобильных элементов природных штаммов возбудителя холеры. Генетика. 2013; 49(9): 1036-47.
15. Higgins D.E., DiRita V.J. Transcriptional control of toxT, a regulatory gene in the ToxR regulon of Vibrio cholerae. Mol. Microbiol. 1994; 14(1): 17-29.
16. Mekalanos J.J., Swartz D.J., Pearson G.D., Harford N., Groyne
F., de wilde M. Cholera toxin genes: nucleotide sequence, deletion analysis and vaccine development. Nature. 1983; 306: 551-7.
17. Silva R. S. De, Kovacikova G., Lin W., Taylor R. K., Skorupski K., Kull F.J. Crystal structure of the Vibrio cholerae quorum-sensing regulatory protein HapR. J. Bacteriol. 2007; 189(15): 5683-91.
18. Tischler A.D., Lee S.H., Camilli A. The Vibrio cholerae vieSAB locus encodes a pathway contributing to cholera toxin production. J. Bacteriol. 2002; 184(15): 4104-13.
19. Jobling M.G., Holmes R.K. Characterization of hapR, a positive regulator of Vibrio cholerae HA/protease gene hap, and its identification as a functional homologue of the Vibrio harveyi luxR gene. Mol. Microbiol. 1997; 26(5): 1023-34.
20. Yildiz F.H., Schoolnik G.K. Role of rpoS in stress survival and virulence of Vibrio cholerae. J. Bacteriol. 1998; 180(4): 773784.
21. Zalkin H., Dixon J.E. De novo purine nucleotide biosynthesis. Progr. Nucleic Acid Res Mol. Biol. 1992; 42: 259-87.
22. Zhu J., Miller M.B., Vance R.E., Dziejman M., Bassler B.L., Mekalanos J.J. Quorum-sensing regulators control virulence gene expression in Vibrio cholerae. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2002; 99: 3129-34.
23. Yu R.R., DiRita V.J. Regulation of gene expression in Vibrio cholerae by toxT involves both antirepression and RNA polymerase stimulation. Mol. Microbiol. 2002; 43:119-34.
24. Kirn T.J., Taylor R.K. TcpF is a soluble colonization factor and protective antigen secreted by El Tor and classical O1 and O139 Vibrio cholerae serogroups. Infect. and Immun. 2005; 73(8): 4461-70.
25. Bose N., Taylor R.K.J. Identification of a TcpC-TcpQ outer membrane complex involved in the biogenesis of the toxin-coregulat-ed pilus of Vibrio cholerae. J. Bacteriol. 2005; 187(7): 2225-32.
Поступила 11.06.15
REFERENCES
1. Ganin V. S. Indian guest. In: Ganin V. S. By the Tracks OfEpidemic Catastrophes. [Indiyskaya gostiya. Po tropam epidemicheskikh katastrof]. Irkutsk: SCRRS SB RAMS; 2011: 144-6.
2. Alam M., Islam M.T., Rashed S.M., Johura F.T., Bhuiyan N.A., Delgado G. et al. Vibrio cholerae classical biotype strains reveal distinct signatures in Mexico. J. Clin. Microbiol. 2012; 50(7): 2212-6.
3. Bakhshi B., Boustanshenas M., Mahmoudi-aznaveh A. Emergence of Vibrio cholerae O1 classical biotype in 2012 in Iran. Lett. Appl. Microbiol. 2014; 58 (2): 145-9.
4. Rai K.R., Rai S.K., Bhatt D.R., Kurokuwa M., Ono K., Magar D.T. Study of medically important Vibrios in the sewage of Katmandu Valley, Nepal. Nepal Med. Coll. J. 2012; 14(3): 212-5.
5. Samadi A.R., Shahid N. , Eusof A. , Yunus M., Huq M.I., Khan M.U. et al. Classical Vibrio cholerae biotype displaces El Tor in Bangladesh. Lancet. 1983; 321: 805-7.
6. Siddique A.K., Baqui A.H., Eusof A., Haider K., Hossain M.A., Bashir I. et al. Survival of classic cholera in Bangladesh. Lancet. 1991; 337: 1125-7.
7. Kokashvili T., Elbakidze T., Jaiani E., Janelidze N., Kamkamidze
G., Whitehouse C. et al. Comparative phenotypic characterization of Vibrio cholerae isolates collected from aquatic environments of Georgia. Georgian Med. News. 2013; 224: 55-62.
8. Kovacikova G., Skorupski K. Overlapping binding sites for the
virulence gene regulators AphA, AphB, and cAMP-CRP at the Vibrio cholerae tcpPH promoter. Mol. Microbiol. 2001; 41(2): 393-407.
9. Monakchova E.V. Phenotypic and Molecular Characteristics of Epidemic and Non-epidemic Vibrio cholerae Strains Isolated in Russia and Certain Countries of Commonwealth of Independent States (CIS). In: Ramamurthy T., Bhattacharya S.K. eds. Epidemiological and Molecular Aspects on Cholera: Infectious Diseases Series. New York: Humana Press; USA, 2010: 185-201.
10. Nair G.B., Faruque S.M., Bhuiyan N.A., Kamruzzaman M., Sid-dique A.K., Sack D.A.J. New variants of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor with attributes of the classical biotype from hospitalized patients with acute diarrhea in Bangladesh. Clin. Microbiol. 2002; 40: 3296-9.
11. Na-Ubol M., Srimanote P., Chongsa-Nguan M., Indrawattana N., Sookrung N., Tapchaisri P. et al. Hybrid & El Tor variant biotypes of Vibrio cholerae O1 in Thailand. Indian J. Med. Res. 2011; 133: 387-94.
12. Pun S.B. The first appearance of classical-like phenotype Vibrio cholerae in Nepal. N. Am. J. Med. Sci. 2014; 6(4): 183-4.
13. Smirnova N.I., Cheldyshova N.B., Zadnova S.P., Kutyrev V.V. Molecular genetic features of Vibrio cholerae classica strains which caused an epidemic of Asian cholera in Russia in 1942. Molekulyarnaya genetika, mikrobiologiya i virusologiya. 2001; (4): 12-6. (in Russian)
14. Smirnova N.I., Zadnova S.P., Agafonov D.A., Shashkova A.V., Cheldyshova N.B., Cherkasov A.V. Comparative molecular-genetic analysis of mobile elements in natural strains of cholera agent. Genetika. 2013; 49(9): 1036-47. (in Russian)
15. Higgins D.E., DiRita V.J. Transcriptional control of toxT, a regulatory gene in the ToxR regulon of Vibrio cholerae. Mol. Microbiol. 1994; 14(1): 17-29.
16. Mekalanos J.J., Swartz D.J., Pearson G.D., Harford N., Groyne F., de Wilde M. Cholera toxin genes: nucleotide sequence, deletion analysis and vaccine development. Nature. 1983; 306: 551-7.
17. Silva R. S. De, Kovacikova G., Lin W., Taylor R. K., Skorupski K., Kull F.J. Crystal structure of the Vibrio cholerae quorum-
sensing regulatory protein HapR. J. Bacteriol. 2007; 189(15): 5683-91.
18. Tischler A.D., Lee S.H., Camilli A. The Vibrio cholerae vieSAB locus encodes a pathway contributing to cholera toxin production. J. Bacteriol. 2002; 184(15): 4104-13.
19. Jobling M.G., Holmes R.K. Characterization of hapR, a positive regulator of Vibrio cholerae HA/protease gene hap, and its identification as a functional homologue of the Vibrio harveyi luxR gene. Mol. Microbiol. 1997; 26(5): 1023-34.
20. Yildiz F.H., Schoolnik G.K. Role of rpoS in stress survival and virulence of Vibrio cholerae. J. Bacteriol. 1998; 180(4): 773-84.
21. Zalkin H., Dixon J.E. De novo purine nucleotide biosynthesis. Progr. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 1992; 42: 259-87.
22. Zhu J., Miller M.B., Vance R.E., Dziejman M., Bassler B.L., Mekalanos J.J. Quorum-sensing regulators control virulence gene expression in Vibrio cholerae. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2002; 99: 3129-34.
23. Yu R. R., DiRita V. J. Regulation of gene expression in Vibrio cholerae by ToxT involves both antirepression and RNA polymerase stimulation. Mol. Microbiol. 2002; 43: 119-34.
24. Kirn T.J., Taylor R.K. TcpF is a soluble colonization factor and protective antigen secreted by El Tor and classical O1 and O139 Vibrio cholerae serogroups. Infect. and Immun. 2005; 73(8): 4461-70.
25. Bose N., Taylor R.K.J. Identification of a TcpC-TcpQ outer membrane complex involved in the biogenesis of the toxin-coregulat-ed pilus of Vibrio cholerae. J. Bacteriol. 2005; 187(7): 2225-32.
Received 11.06.15
Сведения об авторах:
Крицкий Андрей Александрович, мл. науч. сотр. лаб. патогенных вибрионов ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб»; Краснов Ярослав Михайлович, канд. хим. наук, зав. лаб. геномного и протеомного анализа ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб»; Смирнова Нина Ивановна, доктор биол. наук, проф., зав. лаб. патогенных вибрионов ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб».
Опечатка
В выпуске журнала № 4 за 2015 г. на стр. 8 была допущена опечатка. Было напечатано:
Акиншина Ю.А.1, Ларичев В.Ф.2, Марданлы С.Г.1, Бутенко А.М.2, Хуторецкая Н.В.2, Сайфуллин М.А.3 Следует читать:
Акиншина Ю.А.1, Ларичев В.Ф. 2, Козлова А.А. 2, Сайфуллин М.А.3, Марданлы С.Г.1, Бутенко А.М.2 Редакция журнала приносит авторам свои извинения.
