CC BY
38
УДК 547.854.4:547.857.5
раздел ХИМИЯ
АНАЛИЗ ПРОДУКТОВ МЕТИЛИРОВАНИЯ 5-ФТОРУРАЦИЛА ДИМЕТИЛСУЛЬФАТОМ В ВОДНЫХ ЩЕЛОЧНЫХ РАСТВОРАХ МЕТОДАМИ ВЭЖХ И ЯМР-СПЕКТРОСКОПИИ
© Р. С. Буранбаева, А. Н. Лобов, С. А. Грабовский, С. П. Иванов*
Уфимский Институт химии РАН Россия, Республика Башкортостан, 450054 г. Уфа, пр. Октября, 71.
Тел.: +7 (347) 235 60 96.
Email: ivanov_sp@anrb.ru
В работе подобраны условия для хроматографического анализа продуктов алкилирования 5-фторурацила диметилсульфатом в водных щелочных растворах методом ВЭЖХ. Использовалась колонка с фазой C18, элюент состава вода: ацетонитрил = 90:10, аналитическая длина волны 265 нм. Продукты выделены методом полупрепаративной ВЭЖХ и идентифицированы на основании данных 1И, 13С, 15N и 19F ЯМР спектроскопии как 1-метил-5-фторурацил, 3-ме-тил-5-фторурацил, 1,3-диметил-5-фторурацил. Их структуры однозначно доказаны методом ЯМР спектроскопии с использованием 1H-15N корреляционных спектров. Впервые приведены данные по 15N и 19F спектрам полученных соединений.
Ключевые слова: 5-фторурацил, алкилирование диметилсульфатом, 1 -метил-5-фторура-цил, 3-метил-5-фторурацил.
Известно, что 5-фторурацил (1), аналог ура-цила и тимина, входящих в состав нуклеиновых кислот, является одним из наиболее широко применяемых противоопухолевых агентов [1]. При этом, в инъекционных формах препарата используется щелочной водный раствор 5-фторурацила, что обусловлено низкой растворимостью действующего вещества в кислой и нейтральной водной средах. При этом показано, что образование солей не уменьшает биологической активности 1 [2].
В щелочной водной среде у производных ура-цила могут наблюдаться таутомерное и кислотно-основное равновесия. На основании квантово-химических расчетов [3, 4] и экспериментальных данных [5, 6] наиболее устойчивой формой 5-фторурацила в кислых и нейтральных водных растворах является дикето-таутомер. Суммарное содержание других та-утомерных форм - менее 0.1% [7]. Смещение кислотно-основного равновесия в щелочной водной среде приводит к анионным формам, наиболее вероятными из которых являются анионы АШ и АШ [8-
10], однако ряд авторов предполагают о возможности депротонирования от гидроксильных групп енольных форм [11, 12].
Положение депротонирования по первой ступени можно определить, если известны константы диссоциации по N(1) и N(3) положениям пиримиди-нового кольца.
В литературных данных (рКа1=7.8-8.0 [13, 14]) приводят только константы, не конкретизируя место депротонирования. Известно также, что в растворе может существовать смесь анионных форм АШ и АШ [15], причем их соотношение может меняться в зависимости от применяемого растворителя [16].
Для однозначного определения механизма де-протонирования можно использовать модельные соединения для анионов АШ и АШ-3-метил и 1-ме-тил-5-фторурацилы, соответственно.
Для получения указанных соединений в данной работе проводился их синтез путем метилирования 5-фторурацила диметилсульфатом в щелочном водном растворе по методике [15], согласно которой при алкилировании 1 в щелочной среде чаще всего образуется смесь продуктов: 5-фтор-1-метилурацил (2), 5-фтор-3-метилурацил (3) и 5-фтор-1,3-димети-лурацил (4) (схема 1).
Целью данной работы являлся подбор условий для качественного анализа продуктов метилирования 1 методом ВЭЖХ и выделение индивидуальных
о' N
F И.
NaOH, DMS
F H,C-
■F H3C-
O^ N
Схема 1
CH3 2
H 3
CH3 4
о
о
о
H
F
HC
F
F
о
о
о
о
о
H
F
N
N
+
о
N
H
соединений для идентификации веществ на хрома-тограммах.
Экспериментальная часть
В качестве исходных веществ без дополнительной очистки использовали 5-фторурацил (98%, Sigma-Aldrich), диметилсульфат (99%, Sigma-Al-drich) и гидроксид натрия квалификации «х.ч.» (ЗАО «Каустик», Россия). Для приготовления растворов и элюента применяли воду двойной перегонки, а также ацетонитрил квалификации «ос.ч, 4 сорт» (Криохром, Россия). Воду и ацетонитрил фильтровали через мембранный фильтр ФМПА-0.45-47 (ВЛАДиСАРТ, Россия)
Реакцию проводили в термостатируемом реакторе объемом 50 мл при 25 °С. Постоянную температуру поддерживали с помощью термостата LOIP LT-205 (Россия). 0.14 г (0.0035 моль) NaOH растворяли в 20 мл воды и добавляли 0.065 г (0.0005 моль) 5-фторурацила. После полного растворения добавляли 0.45 мл диметилсульфата. За ходом реакции наблюдали методом ВЭЖХ на хроматографе Shi-madzu LC-20 cо спектрофотометрическим диодно-матричным детектором. Использовали колонку Zorbax RX С18, 250x4.6 мм; 5 мкм (Agilent, США). В качестве подвижной фазы применяли элюент состава CH3CN:H2O=10:90 (% об.), скорость потока составляла 1 мл/мин. Детектирование проводилось при длинах волн 215 и 265 нм.
Фракционирование реакционной смеси проводилось полупрепаративно на хроматографической системе Стайер (Аквилон). Применялась колонка с фазой Luna C18, 250x4.6 мм; 10 мкм (Phenomenex, США). В качестве подвижной фазы использовался элюент состава вода:ацетонитрил = 90:10 (% об.). Скорость потока - 4 мл/мин. Детектирование проводилось при длине волны 265 нм.
Спектры ЯМР 1H, 13С, 15N и 19F спектроскопии регистрировали на импульсном спектрометре «Bruker» Avance III с рабочей частотой 500.13 МГц (1H), 470.59 МГц (19F), 125.47 МГц (13C) и 50.67 МГц (15N) с использованием 5 мм датчика с Z-градиентом PABBO при постоянной температуре образца 298 K в растворе D2O. Химические сдвиги в спектрах ЯМР 1Н приведены в м.д. относительно остаточного сигнала воды (SH 4.79 м.д.). Химические сдвиги в спектрах ЯМР 13С, 19F и 15N приведены в м.д. относительно внешнего цифрового стандарта сигналов TMS, CFCl3 и жидкого аммиака при 25 °С соответственно. Двумерные спектры зарегистрированы в стандартных режимах многоимпульсных последовательностей программного обеспечения прибора. Для {1H, 13С} HSQC спектра [17] (размер матрицы составил 2K на 256 эксп., 5.0 кГц для FZ-проекции и 27.7 кГц - для Fi) зарегистрирован с задержкой d4 оптимизированной под наблюдение Jch = 145 Гц. Для {1H, 13С} HMBC спектра [18, 19] (размер матрицы: 2K на 256 эксп., 5.0 кГц для F2-проекции и 27.7 кГц - для F1) зарегистрирован с задержкой d6 = 71.4 мс (cnst13 = 7 Гц). Спектры 19F ЯМР спектры были зарегистрированы в 32
прохода со спектральным окном 75.0 кГц с 128К точек данных, релаксационная задержка составила 2.5 с, длительность 90°-го импульса на ядрах 19Р составила 15 мкс. Спектры {1Н, gsHMBC [18, 19] (размер матрицы 4К на 512 эксп., 6.0 кГц для К2-проекции и 15.2 кГц - для ^1) зарегистрирован с задержкой d6 = 142.8 мс (сшШ = 3.5 Гц).
1-метил-5-фторурацил. Выход 0.0975 г (15%). Спектр ЯМР 1Н (Б20, 5 м.д., / Гц): 3.31 (с, 3Н, СНз), 7.76 (д, 1Н, /б-г = 5.9, Н-6). Спектр ЯМР 13С Ф2О, 5с м.д.): 36.21 (Щ)-СНз); 151.92 С(2), 160.81 С(4); 140.32 С(5); 131.97 С(6). Спектр ЯМР ^ ^0, 5 м.д.): 119.70 N(1). Спектр ЯМР 19Г ^0, 5 м.д., / Гц): -168.58 (д, 1Г, 3/е- нб = 5.9, Г).
3-метил-5-фторурацил. Выход 0.02145 г (33%). Спектр ЯМР *Н ^0, 5 м.д., / Гц): 3.26 (3Н, СНз), 7.63 (уш. с, 1Н, Н-6). Спектр ЯМР 13С ^0, 5 м.д.): 27.75 (N(3)-CHз); 152.70 С(2), 160.11 С(4); 143.22 С(5); 127.10 С(6). Спектр ЯМР 15N ^0, 5 м.д.): 158.76 N(3). Спектр ЯМР 19Г (Б20), 5, м.д.: -168.27.
1,3-диметил-5-фторурацил. Выход 0.0195 г (30%). Спектр ЯМР *Н ^0, 5 м.д.): 3.37 (3Н, N(1)-СНз), 3.29 (3Н, N(3)-СНз), 7.79 (д, 1Н, 3/н6-г = 5.6, Н-6). Спектр ЯМР 13С (Б20, 5 м.д.): 37.15 (^1)-СНз), 27.75 (N(3)-CHз); 151.51 С(2), 159.69 С(4); 138.75 С(5); 130.08 С(6). Спектр ЯМР 15N ^0, 5 м.д.): 117.74 N(1), 157.75 N(3). Спектр ЯМР 19Г ^0, 5 м.д., / Гц): -167.34 (д, 1Г, з/г- Нб = 5.6, Г).
Обсуждение результатов
На первом этапе работы проводилась оптимизация условий анализа продуктов метилирования 5-фторурацила методов ВЭЖХ. Для этого в качестве пробы использовали гомогенный раствор продуктов метилирования 1. Удовлетворительного разделения всех 4 компонентов смеси удалось достигнуть на колонке с обращенной фазой с применением элюента вода-ацетонитрил при аналитических длинах волн 215 или 265 нм (рис. 1) (подробные условия анализа приведены в экспериментальной части). Выбор этих длин волн для детектирования ^метилпроизводных 5-фторурацила обусловлен литературными данными: в УФ-спектрах кислых и нейтральных водных растворов данных соединений наблюдаются максимумы поглощения в областях 210-220 и 260-280 нм [20].
Как видно из рис. 1, в ходе метилирования 5-фторурацила на хроматограмме наблюдается 4 пика, очевидно, содержащих продукты метилирования. Пик 1 соответствует исходному 5-фторурацилу.
Для идентификации синтезированных веществ методом полупрепаративной ВЭЖХ было проведено фракционирование индивидуальных соединений (номера фракций соответствовали номерам пиков на рис. 1).
После упаривания растворителя, структура соединений в выделенных фракциях однозначно устанавливалась методом ЯМР спектроскопии :Н, 13С, ^ с использованием {*Н, 13С} НМВС, HSQC и {*Н,
НМВС спектров (рис. 2).
тАи
1500 1250 1000 750 500 250 0
0.0 2.5 5.0 7.5 мин
Рис. 1. Хроматограмма продуктов реакции при 265 нм после оптимизации условий анализа. Пик 1-5-фторурацил.
Для соединения 1-метил-5-фторурацила в {1Н, НМВС спектре (рис. 2) наблюдается кросс-пик между сигналами протонов метильной группы и азота при 119.70 м.д., также с данным атомом азота взаимодействует дублетный сигнал Н-6, что указывает на атом азота в положении 1. В {1Н, НМВС спектре 3-метил-5-фторурацила кросс-пик наблюдается между сигналами протонов метильной группы и азота при 158.76 м.д. - положение характерное для N(3) [16]. В случае с 1,3-диметил-5-фторурацилом - между сигналами протонов при-азотных метильных групп и атомов азотов N(1) & 117.74 м.д. и 5N 157.75 м.д. N(3).
Таким образом, в данной работе оптимизированы условия для хроматографического анализа продуктов алкилирования 5-фторурацила диметил-сульфатом в водных щелочных растворах методом ВЭЖХ. Продукты выделены методом полупрепаративной ВЭЖХ и идентифицированы на основании данных 1Н, 13С, и ЯМР спектроскопии как 1-метил-5-фторурацил, 3-метил-5-фторурацил, 1,3-ди-метил-5-фторурацил. Их структуры однозначно доказаны методом ЯМР спектроскопии с использованием (:Н, 15N} корреляционных спектров. Впервые приведены данные по и 19Б спектрам полученных соединений.
ррт
80
120
-160
-200
ррт
120
-160
-200
ррт
80
120
-160
-200
'I.........Г
7.8 ррт 3.4 3.3 ррт 7.8 ррт 3.4 3.3 ррт 7.8 ррт 3.4 3.3 ррт
Рис. 2. Фрагменты {1Н, 15Ы} НМВС спектров: А - 1-метил-5-фторурацила (фракция 2); Б - 3-метил-5-фторурацила (фракция 3); В - 1,3-диметил-5-фторурацила (фракция 4).
80
180
180
180
Анализ методами ВЭЖХ и ЯМР спектроскопии выполнен на оборудовании ЦКП «Химия» УфИХ РАН.
ЛИТЕРАТУРЫ
1. Grem L. L. 5-Fluorouracil: Forty-plus and still ticking. A review of its preclinical and clinical development // Invest. New Drugs. 2000. Vol. 18. Pp. 299-313.
2. Salimgareeva M.Kh., Farafontova E. I., Abdrakhimova G. S., Ivanov S. P., Vakhitova Yu.V. Synthesis, biological activity, and mechanism of action of mono-substituted 5-halouracils salts // Pharm. Chem. J. 2014. Vol. 48. Pp. 235-237.
3. Markova N., Enchev V., Timtcheva I. Oxo-hydroxy tautomer-ism of 5-fluorouracil: water-assisted proton transfer // J. Phys. Chem. A. 2005. Vol. 109. Pp.1981-1988.
4. Lukmanov T. I., Ivanov S. P., Khamitov E. M., Khursan S. L. Relative stability of keto-enol tautomers in 5,6-substituted ura-cils: Ab initio, DFT and PCM study // Comput. Theor. Chem. 2013. Vol. 1023. Pp. 38-45.
5. Iza N.,Morcillo J. Identification of ionic and tautomeric species of uracil by second derivative UV absorption spectroscopy // J. Mol. Struct. 1988. Vol. 175. Pp. 31-36
6. Sultanbaev M. V., Ostakhov S. S., Gantsev Sh.Kh., Khalilullin F. A., Kazakov V. P. Fluorescent Study of the Keto-Enol Equilibrium of 5-Fluorouracil Tautomers in Aqueous Solutions // High Energy Chemistry. 2010. Vol. 44. №5. Pp. 415-418.
7. Султанбаев М. В., Остахов С. С., Хурсан С. Л., Ганцев Ш. Х. Флюоресцентные свойства и содержание таутомеров 5-фторурацила в водных растворах // Бутлеровские сообщения. 2011. Т. 25. №5. С. 101-104.
8. Ilyina M. G., Khamitov E. M., Ivanov S. P., Khursan S. L. Anions of uracils: N1 or N3? That is the question // Comput. Theor. Chem. 2016. Vol. 1078. Pp. 81-87.
9. Markova N., Enchev V., Ivanova G. Tautomeric equilibria of 5-fluorouracil anionic species in water // J. Phys. Chem. A. 2010. Vol. 114. Pp. 13154-13162.
10. Иванов С. П., Абдрахимова Г. С., Даутова И. Ф., Спирихин Л. В., Хурсан С. Л. Муринов Ю. И. Изучение депротониро-вания 5-фторурацила // Башкирский химический журнал. 2010. Т.17. №1. С. 42-45.
11. Billinghurst B. E., Oladepo S. A., Loppnow G. R. pH-Depend-ent UV resonance raman spectra of cytosine and uracil // J. Phys. Chem. B. 2009. Vol. 113. Pp. 7392-7397.
12. Pavel I., Cota S., Cinta-Pinzaru S., Kiefer W. Raman, surface enhanced Raman spectroscopy, and DFT calculations: a powerful approach for the identification and characterization of 5-fluorouracil anticarcinogenic drug species // J. Phys. Chem. A. 2005. Vol. 109. Pp. 9945-9952.
13. Гуковская А. С., Сухоруков Б. И., Прокопьева Т. М., Антоновский В. Л. Спектрометрическое изучение протонирова-ния и депротонирования тимина, урацила и его 5-галогено-производных // Изв. АН СССР, Сер. Хим. 1972. №12. С. 2682-2688.
14. Privat E. J., Sowers L. C. A proposed mechanism for the mutagenicity of 5-formyluracil // Mutat. Res. 1996. Vol. 354. Pp. 151-156.
15. Wierzchowski K. L., Litonska E., Shugar D. Infrared and ultraviolet studies on the tautomeric equilibria in aqueous medium between monoanionic species of uracil, thymine, 5-fluoroura-cil, and other 2,4-diketopyrimidines // J. Am. Chem. Soc. 1965. Vol. 83. Pp. 4621-4629.
16. Abdrakhimova G. S., Ovchinnikov M.Yu., Lobov A. N., Spi-rikhin L. V., Ivanov S. P., Khursan S. L. 5-fluorouracil solutions: NMR study of acid-base equilibrium in water and DMSO // J. Phys. Org. Chem. 2014. Vol. 27. Pp. 876-883.
17. Davis A. L., Keeler J., Laue E. D., Moskau D. J. Experiments for recording pure-absorption heteronuclear correlation spectra using pulsed field gradients // J. Magn. Reson. 1992. Vol. 98. №1. Pp. 207-216.
18. Hurd R. E., John B. K.Gradient-enhanced proton-detected het-eronuclear multiple-quantum coherence spectroscopy // J. Magn. Reson. 1991. Vol. 91. №3. Pp. 648-653.
19. Willker W., Leibfritz D., Kerssebaum R., Bermel W. Gradient selection in inverse heteronuclear correlation spectroscopy // Magn. Res. Chem. 1993. Vol. 31. №3. Pp. 287-292.
20. Kheifets G. M., Gindin V. A., Nikolova T. A. Effect of the structure of 1- and 3-methylpyrimidin-4-ones on the rate of nu-cleophilic substitution of the 2-methylsylfanyl group // Russ. J. Org. Chem. 2004. Vol. 40. №1. Pp. 104-113.
Поступила в редакцию 16.11.2016 г.
ANALYSIS OF THE PRODUCTS OF METHYLATION OF 5-FLUOROURACIL BY DIMETHYLSULFATE IN AQUEOUS ALKALINE SOLUTIONS USING METHODS OF HPLC AND NMR SPECTROSCOPY
© R. S. Buranbaeva, A. N. Lobov, S. A. Grabovskiy, S. P. Ivanov*
Ufa Institute of Chemistry, RAS 71 Oktyabrya Avenue, Ufa 450054, Republic of Bashkortostan, Russia.
Phone: +7 (347) 235 60 96.
*Email: ivanov_sp@anrb.ru
In the work, the conditions has been selected for the chromatographic separation of the products of alkylation with dimethylsulfate 5-fluorouracil in aqueous alkaline solutions by high performance liquid chromatography. The column Luna C18 250x4.6mm, 5^m was used. The eluent composition of water: acetonitrile = 90:10 was used. The flow rate was 1 ml/min, analytical wavelength - 265 nm. As a result of the optimization analysis conditions, four symmetric peaks has been observed on the chromatograms, the one of them corresponds to the starter compound 5-fluorouracil. A fractionation product of alkylation of 5-fluorouracil has been performed by semipreparative HPLC in the perspective of identify the remaining three peaks on the chromatogram. Substances contained in selected fractions were identified on the basis of 1H, 13C, 15N and 19F NMR spectroscopy as 1-methyl-5-fluorouracil, 3-methyl-5-fluorouracil, and 1,3-dimethyl-5-fluorouracil. Their structures were unambiguously proved by NMR spectroscopy using the 1H-15N correlation spectra. For the first time we introduce data on the resulting compounds according to 15N and 19F spectra.
Keywords: 5-fluorouracil, alkylation by dimethylsulfate, 1-methyl-5-fluorouracil, 3-methyl-5 -fluorouracil, 1,3-dimethyl-5 -fluorouracil.
Published in Russian. Do not hesitate to contact us at bulletin_bsu@mail.ru if you need translation of the article.
REFERENCES
1. Grem L. L. Invest. New Drugs. 2000. Vol. 18. Pr. 299-313.
2. Salimgareeva M.Kh., Farafontova E. I., Abdrakhimova G. S., Ivanov S. P., Vakhitova Yu.V. Pharm. Chem. J. 2014. Vol. 48. Pp. 235-237.
3. Markova N., Enchev V., Timtcheva I. J. Phys. Chem. A. 2005. Vol. 109. Pp.1981-1988.
4. Lukmanov T. I., Ivanov S. P., Khamitov E. M., Khursan S. L. Comput. Theor. Chem. 2013. Vol. 1023. Pp. 38-45.
5. Iza N.,Morcillo J. J. Mol. Struct. 1988. Vol. 175. Pp. 31-36
6. Sultanbaev M. V., Ostakhov S. S., Gantsev Sh.Kh., Khalilullin F. A., Kazakov V. P. High Energy Chemistry. 2010. Vol. 44. No. 5. Pp. 415-418.
7. Sultanbaev M. V., Ostakhov S. S., Khursan S. L., Gantsev Sh. Kh. Butlerovskie soobshcheniya. 2011. Vol. 25. No. 5. Pp. 101-104.
8. Ilyina M. G., Khamitov E. M., Ivanov S. P., Khursan S. L. Comput. Theor. Chem. 2016. Vol. 1078. Pp. 81-87.
9. Markova N., Enchev V., Ivanova G. J. Phys. Chem. A. 2010. Vol. 114. Pp. 13154-13162.
10. Ivanov S. P., Abdrakhimova G. S., Dautova I. F., Spirikhin L. V., Khursan S. L. Murinov Yu. I. Bashkirskii khimicheskii zhurnal. 2010. Vol. 17. No. 1. Pp. 42-45.
11. Billinghurst B. E., Oladepo S. A., Loppnow G. R. J. Phys. Chem. B. 2009. Vol. 113. Pp. 7392-7397.
12. Pavel I., Cota S., Cinta-Pinzaru S., Kiefer W. J. Phys. Chem. A. 2005. Vol. 109. Pp. 9945-9952.
13. Gukovskaya A. S., Sukhorukov B. I., Prokop'eva T. M., Antonovskii V. L. Izv. AN SSSR, Ser. Khim. 1972. No. 12. Pp. 2682-2688.
14. Privat E. J., Sowers L. C. Mutat. Res. 1996. Vol. 354. Pp. 151-156.
15. Wierzchowski K. L., Litonska E., Shugar D. J. Am. Chem. Soc. 1965. Vol. 83. Pp. 4621-4629.
16. Abdrakhimova G. S., Ovchinnikov M.Yu., Lobov A. N., Spirikhin L. V., Ivanov S. P., Khursan S. L. J. Phys. Org. Chem. 2014. Vol. 27. Pp. 876-883.
17. Davis A. L., Keeler J., Laue E. D., Moskau D. J. J. Magn. Reson. 1992. Vol. 98. No. 1. Pp. 207-216.
18. Hurd R. E., John B. K. J. Magn. Reson. 1991. Vol. 91. No. 3. Pp. 648-653.
19. Willker W., Leibfritz D., Kerssebaum R., Bermel W. Magn. Res. Chem. 1993. Vol. 31. No. 3. Pp. 287-292.
20. Kheifets G. M., Gindin V. A., Nikolova T. A. Russ. J. Org. Chem. 2004. Vol. 40. No. 1. Pp. 104-113.
Received 16.11.2016.
