CC BY
597
адекватной работе оборудования и реагентов. Это и будет основанием для того, что один и тот же пациент в двух разных лабораториях будет получать результаты анализов со статистически незначимыми различиями, т. е. в любой лаборатории здоровый будет признан здоровым, а больной - больным.
Принципиальным прорывом в решении указанных проблем явится введение ГОСТ Р ИСО 18113.1-5 «Изделия медицинские для диагностики in vitro. Информация, предоставляемая изготовителем (маркировка)», а также выполнение в клинико-диагностической лаборатории требований ГОСТ Р ЕН 13612, ГОСТ Р ЕН 13640, ГОСТ Р ЕН 13641.
Сегодня можно рекомендовать сотрудникам лабораторий следующее:
- запрашивать у поставщиков тест-систем, контрольных материалов и калибраторов информацию о том, как была обеспечена метрологическая прослеживаемость. В паспорте калибраторов и контрольных материалов должно быть указано, какие эталоны были использованы для присвоения значений и диапазонов для конкретной партии контрольных материалов и калибраторов;
- запрашивать от поставщиков тест-систем, контрольных материалов и калибраторов подтверждения того, что оборудование, которое было использовано на производстве для присвоения значений, имело должное метрологическое обеспечение как в части физических измерений, так и в целом по системе управления качеством измерений;
- использовать продукцию компаний, производство которых сертифицировано на соответствие менеджмента качества по ИСО 13485;
- для более глубокого контроля качества своей аналитической системы можно периодически использовать эталонные материалы высшего порядка, которые производят национальные метрологические институты.
В целом оценка аналитической точности работы оборудования для медицинских лабораторий включает:
- установление прослеживаемости к калибраторам (ISO 17511);
- соответствие качества реальной работы требованиям производителя - процедура верификации (ISO/NP 23640. In vitro диагностические медицинские устройства - стабильность определения и/или верификация in vitro диагностических реагентов);
- постоянный мониторинг выполнения измерительных процедур - внутренний контроль качества (ВКК), выполнение требований ГОСТ Р 53133.1 и ГОСТ Р 53133.2;
- оценку сопоставимости результатов с результатами иных лабораторий - межлабораторное сравнение, ВОК;
- оценку клинической точности с помощью шкалы ошибок Кларка.
В заключение нужно со всей очевидностью констатировать, что современной лабораторной службе необходимо не отгораживаться от проблем метрологической корректности выполняемых исследований и создавать «фронт» борьбы с метрологами, а активно изучать эти проблемы, прежде всего изложенные в национальном достоянии - серии ГОСТ P ИСО и ГОСТ P, сформированных усилиями проф. В. В. Меньшикова, и на основе полученных знаний выстраивать систему внедрения этих стандартов, прежде всего ГОСТ P ИСО 15189. Такая позиция, безусловно, позволит не только завоевать должное отношение со стороны администрации, но и создаст платформу взаимопонимания и продуктивного взаимодействия с клиницистами прежде всего в части обеспечения диагностической эффективности и рационального использования наукоемких лабораторных технологий.
ЛИТEPАТУPА
1. Международный словарь по метрологии и общие понятия и соответствующие термины. 2-е изд. СПб.: Изд. Профессионал; 2010. 82 с.
2. Проценко В. Н. Основы обеспечения качества клинических лабораторных исследований: учебное пособие. Харьков; 2002. 120 с.
3. Стандартизация в клинической лабораторной медицине. Организационные и метрологические аспекты. М.; 2005. 251 с.
4. Compendium on Analytical Nomenclature (The Orange Book). International Union of Pure and Applied Chemistry. 2002.
5. Rios A. QUANAS Training Course. Traceability. Bucarest; 2004.
6. BIMP - Международное бюро Мер и Весов - информация о доступных референсных материалах, методиках выполнения измерений. http://www.bipm.org/en/home/
7. Global Harmonization Task Force - Международная организация, занимающаяся гармонизацией регулирования оборота изделий медицинского назначения (информация по управлению рисками). http://www.ghtf.org/
8. European Committee for Standardization. Европейский комитет по стандартизации. http://www.cen.eu.
9. International Union of Pure and Applied Chemistry. Международный союз теоретической и прикладной химии. http://www.mpac. org.
10. Clinical and Laboratory Standards Institute. Институт стандартов лабораторной медицины. http://www.clsi.org.
11. The International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. Международная федерация клинической химии и лабораторной медицины. http://www.ifcc.org.
Поступила 25.04.12
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013
УДК 616-074/-078:061.6]:658.562.012.7
С. Б. Павлов, м. В. Кумечко, Л. В.Черных, Н. м. Бабенко
анализ погрешностей дозирования и способы их минимизации
харьковская медицинская академия последипломного образования
Работа посвящена анализу факторов, влияющих на погрешности дозирования, а также вкладу этих погрешностей в общую погрешность анализа. Общая погрешность дозирования включает не только значение погрешности, указанное в паспорте к дозирующему устройству, но и значения погрешностей, которые могут возникнуть на всех этапах дозирования в ходе выполнения методики. С учетом характеристики дозирующих устройств, их достоинств и недостатков в статье обоснован выбор типов дозаторов для использования в лабораторных исследованиях. На примере идеально откалиброванного и соответствующего паспортным данным дозатора воздушного перемещения были проанализированы способы устранения ошибок и минимизации погрешностей.
Ключевые слова: погрешность, дозирование, дозирующие устройства, дозаторы воздушного перемещения, контроль качества лабораторных исследований
S.B. Pavlov, M.V. Kumetchko, L.V. Tchernikh, N.M. Babenko
THE ANALYSIS OF DOSAGE INACCURACY AND ITS MINIMIZATION MODES
The article deals with the analysis of factors impacting dosage inaccuracy and input of this inaccuracy into total inaccuracy of analysis. The total dosage inaccuracy includes both the value of inaccuracy mentioned in the technical passport of dosage device and inaccuracy values occurring at all stages of dosage during implementation of technique. The characteristics of dosage devices and their merits and shortcomings are taken into account. The article substantiates the choice of types of dosage devices to be implemented in the laboratory research. The modes of errors elimination and inaccuracy minimization were analyzed against the perfectly calibrated and totally corresponded to passport data device of air transfer dosage.
Key words: dosage, inaccuracy, dosage device, air transfer dosage device, quality control, laboratory research
В настоящее время очень остро стоит вопрос о совершенствовании контроля качества лабораторных исследований. Контроль качества - это система мероприятий, направленных на минимизацию погрешностей, возникающих на всех этапах исследования, начиная от забора материала и заканчивая постановкой диагноза врачом. Аналитический этап является наиболее сложным и трудоемким в лабораторных исследованиях. Любая процедура, выполняемая на этом этапе, включает ряд шагов, на каждом из которых могут возникнуть погрешности, влияющие на конечный результат. Таким образом, составляющие погрешности анализа определяются различными этапами аналитической процедуры [3]. Относительная погрешность аналитической процедуры включает погрешности, связанные с качеством и нестабильностью реактивов и воды, погрешности посуды (чистота и погрешности мерной посуды), прибора, термостатирования, дозирования и т. п. [5], т. е.
Д
=
+ Д2 + Д2 + Д2 + ... + Д2 (1).
{ посуды прибора дозирования n 4 7
Количественно относительная погрешность обычно выражается коэффициентом вариации. Например, предельно допустимый коэффициент общей аналитической вариации для определения натрия [4] составляет 2%. Это значит, что сумма всех погрешностей не должна превышать 2%. Поэтому увеличение значения какой-либо из составляющих общей погрешности приводит к тому, что коэффициент вариации методики увеличивается, а следовательно, клиническая информативность анализа снижается.
Рассмотрим одну из составляющих относительной погрешности анализа - погрешность дозирования, вклад которой в общую погрешность анализа очень высок. Точность дозирования напрямую влияет на точность получаемого результата лабораторного исследования, поэтому необходимо применять все меры для снижения величины погрешности дозирования и прежде всего знать и соблюдать технику дозирования и постоянно улучшать его качество.
Описание работы дозирующих систем, правила дозирования и калибровки пипеток регламентируются международной серией стандартов ISO 8655, которая была создана на основе немецкой серии - DIN Standart 12650 c некоторыми изменениями [8].
Дозирование в лаборатории осуществляется с помощью пипеток. На сегодняшний день существует три основных типа пипеток различных конструкций с разным уровнем точности и воспроизводимости - стеклянные пипетки, пипеточные дозаторы воздушного перемещения и пипеточные дозаторы прямого перемещения.
Стеклянные пипетки имеют ряд недостатков: большую зависимость точности от мастерства лаборанта, низкую скорость пипетирования, необходимость вспомогательных элементов (резиновая трубка, груша), высокую смачиваемость
Для корреспонденции:
Павлов Сергей Борисович, канд. биол. наук, зав. ЦНИЛ Адрес: 61176, Харьков, ул. Корчагинцев, 58 Телефон: +38-057-711-80-45 E-mail: psb@ua.fm
стенок пипетки, невысокую точность доведения до метки ввиду ее ширины или вытирания рисок с течением времени и т. д. [1]. Таким образом, стеклянные пипетки не обеспечивают необходимое качество дозирования и их использование в лабораториях нежелательно.
В отличие от стеклянных пипеток автоматические пи-петочные дозаторы (далее дозаторы) имеют более высокую точность дозирования, удобны в работе и обеспечивают высокую производительность процесса дозирования. Принцип работы дозаторов воздушного перемещения основан на воздушном вытеснении жидкости. Дозирование происходит за счет увеличения или уменьшения объема воздуха между дозируемой жидкостью и поршнем.
Дозаторы с системой прямого перемещения функционируют практически без воздуха, так как поршень, интегрированный в наконечник пипетки, всегда находится в прямом контакте с жидкостью образца. Поршень заменяют после каждого процесса пипетирования. Дозаторы этого типа применяются для дозирования вязких жидкостей, жидкостей с высоким давлением пара, радиоактивных или агрессивных сред. Жидкости с высоким давлением насыщенного пара будут испаряться внутри пипетки, а жидкости с более высокой плотностью или вязкостью будут стремиться расширить столб воздуха внутри дозатора. Поэтому при использовании дозатора прямого перемещения для таких видов жидкостей будет получен более точный результат, чем при применении дозатора воздушного перемещения. Кроме того, перекрестное загрязнение из-за испарения жидкостей в дозаторах прямого перемещения сведено к минимуму. Однако высокая стоимость комплектующих (наконечников), а также неудобство при их замене приводят к тому, что лаборатории отдают предпочтение более дешевым и удобным автоматическим дозаторам воздушного перемещения.
Автоматические дозаторы бывают двух типов: с постоянным (фиксированным) и с переменным объемом дозирования. Если ограничители хода поршня жестко зафиксированы, такой дозатор позволяет дозировать только один фиксированный объем. Дозаторы с переменным объемом дозирования имеют шкалу объемов, на которой устанавливается требуемое значение.
Дозаторы могут быть как механическими, так и электронными. В механическом дозаторе поршень приводится в движение рукой лаборанта, в электронном дозаторе движением поршня управляет микродвигатель, встроенный в ручку. Работа с электронными дозаторами значительно повышает скорость и качество лабораторных исследований за счет высокой воспроизводимости и точности результатов, а также отсутствия какой-либо зависимости от навыков пользователя. Эти пипетки могут программироваться на разные протоколы дозирования, многократное дозирование, перемешивание, аспирацию, направление и скорость промывки. Существенным достоинством по сравнению с механическими дозаторами является отсутствие необходимости калибровки. Основным недостатком этого типа пипеток является их высокая стоимость.
Однако следует помнить, что какими бы современными не были дозирующие устройства в вашей лаборатории, непрофессиональная работа лаборанта и пренебрежение правилами дозирования могут свести к нулю работу на всех последующих этапах лабораторного процесса.
Целью данной работы является анализ факторов, влияющих на общую погрешность дозирования, количественная оценка
о4 ■С 31
ь о 2 2,5-
1 2-
со 5 1,5-
О
с о 1 "
§ 0,5-
к о-0
0 1
50
Точность
150
200
100 Объем, мкп
—•— Воспроизводимость (CV)
График зависимости точности и воспроизводимости дозатора от объема.
этих факторов, а также рекомендации по минимизации всех погрешностей, которые могут возникнуть при пипетировании.
Дозаторы воздушного перемещения, работая по принципу воздушного вытеснения жидкости, подвержены ошибкам, связанным с изменениями окружающей среды, особенно температуры и атмосферного давления. Поэтому для дозаторов этого типа необходима регулярная проверка метрологических характеристик (1 раз в 3-4 мес в зависимости от частоты использования [15]). Для проверки дозаторов в основном применяется гравиметрический метод, который требует строго контролируемых условий окружающей среды (температуры, влажности, атмосферного давления), высокой точности весов, элементарных знаний в области статистики. Этот метод основан на измерении массы дозы дистиллированной воды, полученной с применением пипеточного дозатора [7]. Условия и правила проведения проверки метрологических характеристик дозирующих устройств и их калибровки описаны в ISO 8655 Standard [12]. Значения погрешностей измерений, полученные в результате проверки дозатора, сравнивают с характеристиками по спецификации (паспорт к дозирующему устройству). Случайная ошибка по паспортным данным к дозатору может варьировать от 0,2 до 6% [2].
Поскольку дозирующие устройства являются средствами измерительной техники, после процедуры калибровки дозатор необходимо поверить [6].
Рассмотрим факторы, оказывающие влияние на погрешность дозирования, на примере идеально откалиброванного, полностью соответствующего паспортным данным поверенного дозатора воздушного перемещения (предположительно систематическая ошибка отсутствует).
Для уменьшения общей погрешности при дозировании необходимо выбирать дозатор, соответствующий дозируемому объему. На рисунке приведен график зависимости точности и воспроизводимости дозатора переменного объема 20-200 мкл от дозируемого объема.
Как видно из графика, дозирование объемов, близких к максимальным (150-200 мкл), дает меньшую погрешность. При минимальных дозируемых объемах значения погрешностей резко возрастают. Таким образом, при необходимости набрать объем 50 мкл, нужно использовать дозатор с максимальным объемом, близким к 50 мкл, а не дозаторы переменного объема с максимальными объемами 500 или 1000 мкл.
Для более точного дозирования не рекомендуется выходить за пределы диапазона дозирования для дозатора переменного объема, даже если позволяет шкала. Дозирование, осуществляемое таким образом, ведет к неопределенной ошибке. Кроме того, всегда есть риск повредить механический счетчик дозирующего устройства.
Особенностью дозаторов воздушного перемещения является то, что между поршнем и жидкостью всегда остается определенный объем воздуха, который действует как упругая пружина. Нарушение герметичности между наконечником и посадочным конусом дозирующего устройства приводит к изменению объема воздуха внутри дозатора, что служит источником ошибок в процессе пипетирования. Поэтому на-
бирать жидкость в пипетку необходимо только при хорошо закрепленном наконечнике. Правильно надетый наконечник в месте соприкосновения с посадочным конусом образует видимое кольцо. При неправильно надетом наконечнике или несоответствии его и дозирующего устройства ошибка дозирования может составлять 0,4% и более [9]. Использование дозаторов и наконечников одной фирмы-производителя существенно уменьшает ошибку при дозировании.
Отклонение от вертикальной оси на 30-40° приводит к превышению объема дозированной жидкости на 0,5-0,7% (из-за влияния гидростатического давления) [15], поэтому при дозировании пипетка должна находиться строго в вертикальном положении. Между циклами дозирования и при хранении дозирующее устройство должно располагаться в штативе, а не на столе во избежание риска контаминации.
Явления смачивания или несмачивания, возникающие на границе раздела жидкости и твердого тела (стенок наконечника), могут оказывать влияние на результат дозирования. Для минимизации этого влияния, а также для выравнивания влажности воздуха внутри воздушного пространства дозатора рекомендуется предварительное 3-5-кратное смачивание наконечника предназначенной для дозирования жидкостью, что приводит к соответствию объемов жидкости в первой и последующих дозируемых пробах. Если при дозировании определенной жидкости появляется необходимость изменить объем дозирования той же жидкости, наконечник следует сменить и снова смочить его перед последующим дозированием. Некоторые авторы рекомендуют предварительное смачивание наконечников только для объемов более 10 мкл [9]. Ошибки, связанные с отсутствием предварительного смачивания наконечника, по нашим данным, могут составлять около 0,1%.
Благодаря предварительному смачиванию наконечника можно уменьшить погрешность, связанную с разницей температур наконечника и дозируемой жидкости. Если температура наконечника 20°С, а дозируемой жидкости 4°С, первый дозируемый (сухим чистым наконечником) объем всегда больше, чем последующие, дозируемые этим же наконечником. Это объясняется тем, что при контакте холодного образца с воздухом внутри дозатора последний сжимается и объем дозируемой жидкости увеличивается. Все последующие дозированные объемы будут меньше, чем необходимый объем, за счет расширения воздуха внутри дозатора. Точность дозирования варьирует в пределах 0,1-0,2% на каждый градус разницы между температурой образца и наконечника [13]. Таким образом, чтобы избежать погрешности при пипетировании, дозируемая жидкость и наконечник должны иметь одинаковую температуру.
Поскольку пипетка откалибрована при 20-25°С, работать нужно в помещении, температура которого близка к комнатной. Ошибки дозирования, связанные с изменениями условий окружающей среды, по нашим данным, могут варьировать в диапазоне 0,2-0,4%. Для калибровки дозирующих устройств используют дистиллированную или деионизированную воду. При дозировании растворов, плотность которых отличается от плотности воды, объем набранной в наконечник жидкости будет отличаться от требуемого.
Тепло рук лаборанта, долго держащего дозатор, может существенно нагреть его составляющие и воздух внутри дозатора, это может привести к тому, что во время движения поршня
Таблица 1
Рекомендуемая глубина погружения наконечника
Дозируемый объем Рекомендуемая глубина погружения наконечника, мм
0,1-1 мкл 1
1-100 мкл 2-3
101-1000 мкл 2-4
1001-10 мл 3-6
Таблица 2
Вклад погрешностей дозирования в общую погрешность анализа
Погрешности при дозировании Количество дозирований в ходе выполнения методики
1 2 3 n
Погрешности дозатора по паспортным данным, % 0,2-6 0,2-6 0,2-6 0,2-6
Неправильно надетый наконечник, % 0,4 и более 0,4 и более 0,4 и более 0,4 и более
Отклонение дозатора от вертикального положения на 30-40°, % 0,5-0,7 0,5-0,7 0,5-0,7 0,5-0,7
Отсутствие предварительного смачивания наконечника, % 0,1 0,1 0,1 0,1
Разность температур наконечника и дозируемой жидкости в 5°С, % 0,5-1,0 0,5-1,0 0,5-1,0 0,5-1,0
Несоответствие глубины погружения наконечника дозируемому объему, % 0,2-0,4 0,2-0,4 0,2-0,4 0,2-0,4
Нагревание дозатора рукой лаборанта, % 0,1 0,1 0,1 0,1
Несоответствие условий работы в лаборатории условиям помещения для калибровки дозаторов и т. п., % 0,2-0,4 0,2-0,4 0,2-0,4 0,2-0,4
Общая погрешность дозирования, % 0,9-6,2 1,3-8,8 1,6-10,7 1,8-12,4
(сжатия/расширения воздуха внутри дозатора) объем дозируемой жидкости изменится. По нашим данным, при нагревании дозатора рукой лаборанта ошибка дозирования может составлять около 0,1%. Дозаторы положительного перемещения лишены этого эффекта, поэтому они считаются более точными.
При заборе жидкости глубина погружения наконечника пипетки должна соответствовать дозируемому объему. Рекомендуемая глубина погружения наконечника в жидкость представлена в табл. 1 [10].
Если наконечник погружен в жидкость слишком глубоко, ее избыток на внешней стороне наконечника приведет к значительному завышению отмеряемого объема. Под действием капиллярных сил в наконечник также может попасть дополнительное количество жидкости. Если наконечник недостаточно погружен в жидкость, внутрь наконечника может попасть воздух, что приведет к непредсказуемому снижению объема дозирования. Ошибки дозирования, связанные с глубиной погружения наконечника в дозируемую жидкость, могут составлять 0,2-0,4% [14].
Однозначного мнения по поводу возможности протирания наконечника с целью снятия висящей капли нет. Как правило, авторы считают возможным удаление избытка жидкости снаружи наконечника фильтровальной бумагой (салфеткой). Однако необходимо избегать прикосновения бумаги (салфетки) к кончику наконечника во избежание возможного вытягивания из него части жидкости, а также риска загрязнения наконечника и дозируемой жидкости [11].
Вклад в общую погрешность дозирования могут вносить ошибки, связанные с неравномерностью ритма пипетирова-ния и разной силой нажима на кнопку дозатора. Резкое отпускание поршня может приводить к попаданию жидкости внутрь дозатора. Жидкость остается внутри дозатора и может служить источником перекрестного загрязнения, а также порчи дозатора.
Учитывая все вышесказанное, внесем возможные погрешности дозирования в табл. 2, где представлена количественная оценка величин факторов, влияющих на общую погрешность дозирования, а также общая погрешность дозирования в зависимости от этапов дозирований в ходе выполнения методики.
Количество дозирований определяется методикой (пипе-тирование образца и реагентов, разведение образца и т. д.). Как видно из таблицы, значение погрешности увеличивается пропорционально числу дозирований. Таким образом, чем больше этапов пипетирования предусматривает методика, тем выше значение общей погрешности дозирования.
Если предположить, что составляющие погрешности анализа (погрешности реактивов, посуды, перемешивания, прибора, термостатирования и т. п.) минимальны и не превышают 0,5%, а погрешность дозирования составляет 3%, формула (1) приобретает вид
Данализа = V (0,5- + (0,5)2 + (0,5)2 + (0,5- + 32 + ... + Д2П> 3% (2).
Таким образом, значение погрешности анализа при минимальных значениях погрешности ее составляющих может достигать более 3%, тогда как предельно допустимые коэффициенты общей аналитической вариации для определения некоторых показателей [4] не должны превышать 2%.
Выводы. Погрешность дозирования включает не только значение погрешности, указанное в паспорте к дозирующему устройству, но и значения всех погрешностей, допущенных при дозировании. Иными словами, неправильное положение дозатора, неплотно надетый наконечник, разная температура наконечника и жидкости, несоответствующая глубина погружения наконечника в жидкость и другие факторы приводят к тому, что значительно возрастает погрешность дозирования и как следствие общая погрешность анализа. Устранение ошибок и минимизация погрешностей при дозировании способствует повышению качества лабораторных исследований и эффективности диагностики и лечения больных.
ЛИТЕРАТУРА
1. ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81). Межгосударственный стандарт. Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Ч. 1. Общие требования. - М., 1991.
2. Инструкция пользователя к дозатору «Biohit Proline».
3. Клиническая лабораторная аналитика. Т. 1. Основы клинического лабораторного анализа / Под ред. В. В. Меньшикова. - М., 2002.
4. Приказ Минздрава РФ от 07.02.2000 № 45 «О системе мер по повышению качества клинических лабораторных исследований в учреждениях здравоохранения Российской Федерации». - М., 2000.
5. Проценко В. Н. Основы обеспечения качества клинических лабораторных исследований: Учебное пособие. - Харьков, 2009.
6. Стандарт ISO/IEC 17025. Требования к метрологическому обеспечению системы качества лабораторий.
7. Шибанов А. Н. Метрология в клинической-лабораторной диагностике - цели и средства // Медицинский алфавит. Лаборатория. - 2009. - № 4.
8. Bio-Tek Services, Inc. 2008-2009 Pipette Standards Handbook Written By: Kenneth Bonnell Quality Manager Bio-Tek Services, Inc. Bio-Tek Services, Inc. 1160 Warwick Park Road Suite С Richmond, VA 23231.
9. Eppendorf. Applications. Liquid handling. No. 1. 1/00/. N 10.
10. Gilson guide to pipetting. - Gilson Inc., 2005.
11. Gilson SAS. January, 2004.
12. ISo 8655 Standard. Piston-operated volumetric apparatus.
13. MilletF., Barthlen Т. Securing accuracy and precision when pipetting hot and cold liquids with Microman. Nature Methods 4 (September 2007) doi:10.1038/nmethl086 Application Note.
14. Thermo scientific pipetting guide. - Thermo Fisher Scientific Inc., 2007.
15. Troemner. Pipette Standards Handbook. Raising The Standard.
Поступила 05.08.11
