Аналіз p53-імунореактивності в астроцитарних пухлинах головного мозку Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

КЛШ1ЧНА МЕДИЦИНА

УДК 616.831-006-036:612.017

Т.В. Шинкаренко, 1.С. Шпонька

АНАЛ1З Р53-1МУНОРЕАКТИВНОСТ1 В АСТРОЦИТАРНИХ ПУХЛИНАХ ГОЛОВНОГО МОЗКУ

ДЗ «Днтропетровська медична академiя МОЗ УкраИни»

кафедра патологiчноi анатома i судовоХ медицини

(зав. - д. мед. н., проф. 1.С. Шпонъка)

вул. Дзержинсъкого, 9, Днтро, 49044, УкраХна

SE «Dnipropetrovsk medical academy of Health Ministry of Ukraine»

Department of Pathological Anatomy and Forensic Medicine

Dzerzhinsky str., 9, Dnipro, 49044, Ukraine

e-mail: Timash3061990@gmail.com

Ключовi слова: пухлина головного мозку, iмуногiстохiмiя, дiагностика, p53, Ki-67 Key words: brain tumor, immunohistochemistry, diagnostics, p53, Ki-67

Реферат. Анализ р53-иммунореактивности в астроцитарных опухолях головного мозга. Шинкаренко Т.В., Шпонька И.С. Р53 - антионкоген, мутации которого часто встречаются в опухолевых клетках человека, что приводит к сверхэкспрессии соответствующего белка, который может быть обнаружен с помощью иммуногистохимии. Исследования, посвященные возможностям использования этого метода, предоставили противоречивые результаты. Авторы исследовали особенности экспрессии протеина p53 в астроцитарных опухолях головного мозга различной степени злокачественности (пилоцитарных, диффузных, анапластичных астроцитомах, глиобластомах), а также проанализировали связь уровня экспрессии p53 опухолевыми клетками с клиническими параметрами и индексом пролиферации. Было исследовано операционный материал 52 пациентов с диагнозом астроцитарных опухолей головного мозга. При иммуногистохимическом исследовании были использованы первичные антитела против р53 и Ki-67. Для каждого маркера подсчитывали процент иммунореактивных клеток с учетом статуса 1000 опухолевых клеток, используя пакет программного обеспечения ImageJ 1,47v. Статистическую значимость различия результатов в группах исследуемых опухолей было проверено с помощью теста Фишера; с целью определения силы связи между показателями использовался коэффициент корреляции Спирмана. p53-иммунореактивные опухолевые клетки были обнаружены в 25% (1/4) пилоцитарних астроцитом, 33,3% (2/6) диффузных астроцитом, 53,8% (7/13) анапластичных астроцитом, 58,6% (17/29) глиобластом. Высокая доля p53-иммунореактивных клеток (>30%) наблюдалась только в глиобластомах. p53-иммунопозитивность опухолей не показала зависимости от возраста, пола пациентов и уровня злокачественности по ВОЗ (р>0,05). Коэффициент корреляции Спирмана между относительными количествами ki-67- и p53-иммунореактивных ядер показал слабую прямую корреляцию (0,023), которая однако не была статистически достоверной (р>0,05). Уровень p53-иммунореактивности - критерий, не зависящий от возраста, пола больных, Grade по ВОЗ и пролиферативной активности (р> 0,05). Зависимость между относительными количествами ki-67 и p53-реактивныхядер слабая прямая статистически незначимая (р>0,05).

Abstract. Analysis of p53- immunoreactivity in astrocytic brain tumors. Shinkarenko T.V., Shpon'ka I.S. P53 is

an antioncogene with the frequently occured mutations in human tumor cells, leading to corresponding protein over expression which can be detected by immunohistochemistry. Researches dedicated to the investigation of possibilities of using this technique gave controversial results. The authors investigated features of p53 protein expression in astrocytic brain tumors with different degrees of malignancy. Analyzed the relationship of the expression level of p53 by tumor cells with clinical parameters and Ki-67 proliferation index (PI) as well. Tissues were collected from 52 cases with diagnosed astrocytic brain tumors. The sections were immunohistochemically stained with p53 and Ki-67. For each marker, 1000 tumor cells were counted and the ratio of positive tumor cells was calculated using software package ImageJ 1,47v. In normal brain tissue p53- expression was not identified. p53-immunoreactive tumor cells were detected in 25% (1/4) pilocytic astrocytomas, 33.3% (2/6) of diffuse astrocytomas, 53.8% (7/13) anaplastic astrocytomas, 58.6% (17/29 ) glioblastomas. A high proportion of p53-immunoreactive cells (> 30%) was observed only in glioblastomas. The level of p53-imunoreactivity was not related to the age, gender and Grade WHO (p> 0,05). Spearman correlation coefficient between the relative quantity of ki-67- and p53-immunoreactive nuclei showed weak direct correlation (0.023), but the one was not statistically significant (p> 0,05). The level of p53-imunoreactivity is not dependent from age and sex of patients, Grade (WHO) and proliferative activity (p>0,05) but the high level of p53-immunoreactive cells (>30%) is found in glioblastoma specimens only, that may be due to the accumulation of mutations in DNA of tumor cells. There is insignificant weak relationship between relative quantities of ki-67- and p53-immunoreactive tumor cells (p>0,05).

Дослщження виконано в рамках науково-дослщно! роботи «Патоморфолопчна дiагности-ка та прогноз переб^у новоутворень рiзних лока-лiзацiй з урахуванням маркерiв бюлопчних вла-стивостей» (номер держреестраци 0112Ш06965).

р53 - бiлок-супресор пухлинного росту з масою 43,7 кДа, кодусться геном ТР53, розташо-ваному в локус 17р13.1. У випадку незначного ушкодження ДНК р53 стимулюе 11 репарацiю, призупиняе подiл клiтини, а при неможливост вiдновлення структури ДНК запускае мехашзми апоптозу. Ц ди запобiгають накопиченню по-милок i таким чином блокують онкогенез. Бшьшють TP53-мутацiй - мюенс-мутацп в екзонах 5-8 домену зв'язування ДНК призводять до збшьшення експреси протешу р53 iз втратою частини його властивостей, що у свою чергу вщзначаеться порушеннями адаптаци клiтини та репараци ДНК, накопиченнями протоонкогенних мутацiй з пришвидшенням онкогенезу.

Деградацiя протешу р53 стимулюеться убш-вiтiн лiгазою MDM2 та 11 гомологом MDMX [11]. Також непрямий вплив (через MDM2) на три-валiсть iснування проте1ну мае iнгiбiтор клггин-ного циклу АЯБ [5]. Дикий тип р53 iснуе в ядрi з середшм термiном напiврозпаду 6-30 хв у рiзних тканинах, який збiльшуеться при клггинному стресi [7].

У б^ мутацiй ТР53 налiчуеться бiльше 45000 мутацш вiдповiдного гена, частина з них характерна для глюм [6]. Для виявлення мутацш ТР53 використовуються методи молекулярного аналiзу. Е. Gillet et а1. [10], Н. Takami et а1. [8] показали значну позитивну корелящю мюенс-мутацш гена ТР53 та визначеного iмуногiсто-хiмiчним методом рiвнем експреси протешу р53, зокрема у глiомах головного мозку, що дозволяе використовувати бшьш дешевий метод iмуно-гiстохiмiчного аналiзу. Однак треба враховувати неiдентичнiсть мутацп гена вiд надекспреси проте!ну: полiмеразна ланцюгова реакцiя вста-новлюе вс мутацп (якi можуть призводити не тшьки до пiдвищення кiлькостi р53 у клiтинах), а iмуногiстохiмiчне дослщження може виявити пiдвищення експреси незмшеного (дикого) по-лiпептиду у випадках розладiв ешгенетично! регуляци нормального гена - змш концентраци регулюючих проте!шв (наприклад MDM2, MDMX, чи АЯБ), тому що найбшьш часто вживаний клон для iмуногiстохiмiчного аналiзу р53-iмунореактивностi (DO-7) виявляе i дикий, i мутантний полiпептид [8].

Хоча р53^мунореактившсть, на B^MiHy вiд мyтацiй TP53, зус^чаеться i при деяких за-хворюваннях, що супроводжуються реактивними змiнами гли (глюз^ [7], наявнiсть виражено! p53-iмyнореактивнiстi дозволяе вiдрiзнити глiомy та непухлинш процеси, а рiвень експреси, вищий за 10%, частiше зyстрiчаеться в дифузних, анапла-стичних астроцитомах i вторинних глюбла-стомах (стyпенi злояюсност II, III i IV за ВООЗ вщповщно) порiвняно з пшоцитарними астроци-томами (стyпiнь злоякiсностi I за ВООЗ) та пер-винними глюбластомами, що корелюе з даними про частоту мутацш TP53 у вщповщних пухли-нах. Вiдомо, що мутащя гена TP53 негативно корелюе з тривалютю життя пацiентiв, хворих на глiоми [3].

Мyтацiя TP53 у статевих кттинах та на ран-нiх етапах ембрiогенезy пов'язана з виникненням спадкового захворювання - синдрому Л>Фрау-менi, що характеризуеться розвитком у дитячому вщ остеосарком, м'якотканинних сарком, пух-лин ЦНС, а також раку молочно! залози i м'якотканинних сарком у дорослих. Дiагностика цього синдрому базуеться на виявленнi клiнiчних ознак, але тiльки в 70% хворих шдтверджуеться за допомогою молекулярного аналiзy гена TP53. При цьому синдромi мутаци супроводжуються шдвищенням рiвня протешу p53, що виявляеться iмyногiстохiмiчно навiть у немал^шзованих тканинах [4].

Подальший розвиток таргетно! терапи глiобластом може бути пов'язаний не тшьки з антианпогенним бевацизумабом, що блокуе фактор росту ендотелда судин VEGF, а й з1 створенням препарату, що реактивуе p53.

Мета роботи - дослщити особливосп експреси проте!ну p53 в астроцитарних пухлинах головного мозку рiзного ступеня злояюсносп.

МАТЕР1АЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛ1ДЖЕНЬ

Дослщжено 52 зразки пухлин астроцитарного походження, як було отримано шляхом бюпси або оперативного втручання переважно в ней-рохiрyргiчномy вiддiленнi ДОКБМ та шдлягали iмyногiстохiмiчномy дослiдженню в морфолопч-ному вщдш лiкyвально-дiагностичного центру ТОВ «Аптеки медично! академи» (м. Дшпро-петровськ) протягом 2006-2015 рр. Гiстологiчний дiагноз був встановлений, спираючись на сучасш гiстологiчнi та iмyногiстохiмiчнi критери [12]. Ктшко-нозолопчна характеристика вiдiбраних зразкiв наведена в таблиц 1.

КЛ1Н1ЧНА МЕДИЦИНА

Таблиця 1

Розпод1л астроцитом за кл1шчними показниками та нозолопями (n, %)

КритерН Кшьюсть вс1х випадк1в, (n) %

Стать

Чолов1ча 27 51,9

Ж1ноча 25 48,1

Bík

<50 34 65,4

>50 18 34,6

Гемкфера

Л1ва 8 17,8

Права 16 35,6

Нев1домо 25 55,6

Локал1зац1я

Лобна 9 20,0

Скронева 7 15,6

Тм'яна 2 4,4

Потилична 1 2,2

2 частки 7 15,6

Стовбур 1 2,2

Нев1домо 25 55,6

Пстолопчний д1агноз

Шлоцитарна астроцитома (Grade I*) 4 7,7

Дифузна астроцитома (Grade II) 6 11,5

Анапластична астроцитома (Grade III) 13 25

Гл1областома (Grade IV) 29 55,8

Всього 52 100%

Примака. * — тут i дат за ВООЗ [23].

1муног1стох1м1чний метод. lMyHoricroxÍMÍ4He дослiдження проводилось зпдно з протоколами компани TermoScientific (TS), (США): для визна-чення експреси p53 (клон sp-5, р. 1:200 (TS,США)) та Ki-67 (клон sp6, р. 1:400 (TS,США)) у зрiзaх завтовшки 4 мкм використовували систему вiзуa-лiзaцil Lab Vision Quanto (TS, США) з виявлен-ням бшкового ланцюга за допомогою DAB Quanto Chromogen (TS, США).

Морфометричний метод. Дослщження включало тдрахунок кiлькостi позитивно та негативно забарвлених ядер клггин пухлини, виклю-чаючи ядра нейронiв, мaкрофaгiв та клггин ендотелiю, у зонах найбшьшо! щiльностi штра-нуклеарно! реакци трьома незалежними досвщ-ченими патоморфологами. Визначали вiдносну кiлькiсть Ki-67 (iндекс пролiферaцil) та p53-iмунореaктивних глiомоцитiв. При вщноснш кiлькостi p53-iмунореaктивних ядер бшьше 10% робили висновок про позитившсть пухлини за маркером p53 (р53^мунопозитивнють).

Для аналiзу цифрових фотографiй «гарячих» зон та найточнiшого пiдрахунку ядер були отримаш зображення за допомогою камери ZEISS Axiocam 105 color на свпловому мiкроскопi Axio Scope.Al при збiльшеннi об'ективу ><40. Кожний зразок був шюстрований 1-4 зображен-нями з найбiльшою щiльнiстю iмунореактивних пухлинних клiтин. Для пiдрахунку кл^ин ви-користовувався ImageJ 1.49v з його plug-шом PointPicker. Визначали вщносну кiлькiсть Ki-67 (iндекс пролiферацil) та р53^мунореактивних глiомоцитiв. Серед отриманих результат оби-рався найбiльший [2].

Статистичний анал1з був проведений за допомогою онлайн-сервюу http://medstatistic.ru/. Статистичну значущють вiдмiнностi результатiв у групах дослщжуваних пухлин було перевiрено за допогою теста Фiшера, з метою визначення сили зв'язку мiж показниками використовувався коефщент кореляци Спiрмана. Значення p<0,05 було прийнято статистично значущим [1].

РЕЗУЛЬТАТИ ТА IX ОБГОВОРЕННЯ

Нормальна тканина головного мозку показала експресда р53 у незначнiй кiлькостi ядер (до 0,5%). В якост внутрiшнього позитивного контролю було використано р53^мунореактив-нють частини ядер ендотелiальних клiтин (рис. 1 А-В). Типовим для астроцитарних пухлин з дифузним ростом (ГГ-ГУ рiвнiв злоякiсностi за ВООЗ) була шфшьтращя р53-негативно! нормально! мозково! тканини p53-iмунопозитивними пухлинними клiтинами з бшьшими ядрами (рис. 1 С), тому частка p53-iмунореактивних клiтин

у пухлинах астроцитарного походження була неоднаковою в полях зору рiзних частин зразку -вщ повно! вщсутносп до 83,2% (рис. 1 D). Дiлянки навколо некротизовано! тканини у глюбластомах за вiдносною кiлькiстю р53-iмунореактивних пухлинних клiтин суттево не вiдрiзнялися вiд iнших частин пухлини, що аналогiчно спостереженням за Ю67^муно-реактивнiстю, яка вiдображае пролiферативну актившсть.

Рис. 1. А-В, ГлiобластомаWHO2oo7. А (г-е), велика щшьнкть клiтин, судин переважно дрiбного калiбру, дiлянки крововм. ппив (□), В (той же випадок, велике збшьшення, р53), одиничнi ендотелiальнi клiтини

з ядерною iмунореактивнiстю (►). С, Анапластична астроцитомата02007 (р53), межа пухлини: значна щшьнкть iмунореактивних кл^ин у центральнiй частинi пухлини ^воруч), шфшьтращя одиничними iмунореактивними клiтинами мозковоТ тканини (праворуч). D, Глюбластома-^гом-/ (велике збшьшення, р53) в1дсоток iмунореактивних ядер у цьому випадку- 83,2%

КЛШ1ЧНА МЕДИЦИНА

AHani3 р53^мунопозитивносп поданий у таблиц 2. Спiввiдношення чоловiкiв i жшок серед хворих на астроцитоми дорiвнювaло 1,08:1, середнiй BiK становив 41,0 (дiaпaзон 9-72) piK. При aнaлiзi за статтю та вшом була проде-монстрована piвнiсть частоти зустpiчaeмостi p53-iмунопозитивних астроцитарних пухлин, а також окремо глюбластом, у пaцieнтiв чоловiчоï i жшочо1 стaтi, пaцieнтiв молодого i похилого вiку (р>0,05).

p53-позитивнiсть пухлини була зафшсована у 25% (1/4) тлоцитарних астроцитом, 33,3% (2/6) дифузних астроцитом, 53,8% (7/13) анапластич-них астроцитом, 58,6% (17/29) глюбластом. Ста-тистично вaгомоï зaлежностi дiaгнозу вiд p53-iмунопозитивностi не зaфiксовaно (р>0,05).

p53 «—» (n=14)

p53 «+» (n=31)

Всього (n=52)

p p > 0,05 p > 0,05

Прим1тка. Вщмшшсть статистично значуща при р<0,05.

Коефiцiент кореляци Спiрмана мiж вщносною кiлькiстю К>67- та p53-iмунореактивних ядер показав слабку пряму корелящю (0,023), що однак не була статистично достовiрною (р>0,05).

Сшввщношення чоловшв i жшок у нашому дослщженш вiдповiдае епiдемiологiчним даним про гендерну рiвнiсть у захворюваностi на астроцитоми. Менший середнiй вiк хворих можна пояснити малою кшьюстю випадкiв та наявшстю переважно матерiалу, отриманого при оперативних втручаннях, якi доцiльнiшi при лшуванш пацiентiв бiльш молодого вшу.

ВИСНОВКИ 1. р53^мунопозитившсть астроцитарних пухлин головного мозку не залежить вщ вiку, статi пацiентiв, рiвня злоякiсностi за ВООЗ та про-лiферативноl активностi (р>0,05). При дiагности-

Усi p53-iмунопозитивнi зразки ми розпо-дiлили на 2 групи: 1) вщносна кiлькiсть iмуно-реактивних кл^ин вiд 10 до 30% та 2) вщносна кшьюсть iмунореактивних кл^ин бiльше 30%. Перша група була представлена пухлинами всiх рiвней злояюсносп, а друга - тiльки гл> областомами.

Зразок пгантокттинно! глiобластоми був р53-позитивним, при цьому переважна бшьшють багатоядерних гiгантських клiтин мiстила тшьки р53-реактивш ядра, незначна частина подiбних багатоядерних клiтин мала тiльки р53-негативш ядра; клiтини, якi б мютили p53-реактивнi i р53-негативнi ядра, не виявлялися.

Таблиця 2

IV

12 41,4%

17

58,6%

29 100%

p i,ii>0,05 p i-ii, iii >0,05 p i-ii, iii-iv >0,05

щ пухлин астроцитарного походження слщ враховувати, що висока вiдносна кшьюсть iмунореактивних клiтин (>30%) спостерiгаеться тшьки у глюбластомах, у той час, як в шших пухлинах вщповщна вiдносна кiлькiсть ста-новить не вище 30%.

2. Не виявлено статистично вагомого зв'язку мiж вщносними кiлькостями ki-67- та p53-iмуно-реактивних ядер (р>0,05).

Перспективи подальших розробок.

З метою удосконалення дiагностики глiальних пухлин головного мозку необхщш подальшi до-слiдження, присвяченi вивченню рiзноманiтних клшко-морфолопчних, у тому числi 1ГХ характеристик, !хнього взаемозв'язку та визна-ченню можливостей використання у щоденнш лiкарськiй практицi.

Анал1з р53-1мунореактивност1 астроцитарних пухлин головного мозку за клшжо-морфолопчними ознаками (n, %, p)

Стать BiK Стутнь злояюсносп за ВООЗ

Ч Ж <50 >50 I II III

13 12 17 8 3 4 6

48,1% 48% 50% 44,4% 75% 66,7% 46,2%

14 13 17 10 1 2 7

51,9% 52% 50% 55,6% 25% 33,3% 53,8%

27 25 34 18 4 6 13

100% 100% 100% 100% 100% 100% 100%

СПИСОК Л1ТЕРАТУРИ

1. Антомонов М.Ю. Математическая оброботка и анализ медико-биологических даннях / М.Ю. Антомонов. - Киев, 2006. - 558 с.

2. Пославська О.В. Методолопя використання про-грамного забезпечення для аналзу цифрових мкрофото-графiй на баз1 курсу патоморфологи з метою щдвищен-ня професшного ршня студенпв i науковщв / О.В. Пославська // Morphologia.-2015.-T. 9, № 3.- С. 122-126.

3. Apoptosis therapy in cancer: the first single-molecule co-activating p53 and the translocator protein in glioblastoma / S. Daniele, S. Taliani, E. Da Pozzo [et al.] //Scientific reports. - 2014. - T. 4.

4. Expression of p53, epidermal growth factor receptor, Ki-67 and O6-methylguanine-DNA methyltransferase in human gliomas / X. Hu, W. Miao, Y. Zou [et al.] // Oncology letters. - 2013. - Vol. 6, N 1. - P. 130-134.

5. Ganguly A. Li-Fraumeni Syndrome / A. Ganguly, Z. Chen //Molecular Pathology in Clinical Practice. -Switzerland: Springer International Publishing, 2016. -С. 377-383.

6. Kruiswijk F. p53 in survival, death and metabolic health: a lifeguard with a licence to kill / F. Kruiswijk, C. F. Labuschagne, K.H. Vousden // Nature Reviews Molecular Cell Biology. - 2015. - Vol. 16, N 7. - P. 393-405.

7. Leroy B. TP53 mutations in human cancer: database reassessment and prospects for the next decade / B. Leroy, M. Anderson, T. Soussi // Human Mutation. -2014. - Vol. 35, N 6. - P. 672-688.

8. Nuclear interactor of ARF and Mdm2 regulates multiple pathways to activate p53 / S. M. Reed, J. Hagen, V. S. Tompkins [et al.] //Cell Cycle. - 2014. - Vol. 13, N 8. - P. 1288-1298.

9. Revisiting TP53 mutations and immunohisto-chemistry - a comparative study in 157 diffuse gliomas / H. Takami, A. Yoshida, S. Fukushima [et al.] //Brain Pathology. - 2015. - Vol. 25, N 3. - P. 256-265.

10. Tanboon J. The Diagnostic use of immunohisto-chemical surrogates for signature molecular genetic alterations in gliomas / J. Tanboon, E. A. Williams, D. N. Louis // J. Neuropathol. & Experim. Neurology. - 2016. -Vol. 75, N 1. - P. 4-18.

11. Transcriptional control of human p53-regulated genes / T. Riley, E. Sontag, P. Chen [et al.] // Nature Reviews Molecular Cell Biology. - 2008. - Vol. 9, N 5. -P. 402-412.

12. WHO Classification of tumours of the central nervous system / D.N. Louis, H. Ohgaki, O.D. Wiestler [et al.]. - 4-е изд. - Lyon: IARC, 2007. - 312 р.

REFERENCES

1. Antomonov M. [Mathematical processing and analysis of medical and biological data.] Kyiv: FMD. 2006;558. Russian.

2. Poslavska OV. [Methodology for the use of software for the analysis of digital micrographs on the base of pathomorphology course in order to increase the professional level of students and scientists]. Morphologia. 2015;9(3):122-6. Ukrainian.

3. Daniele S, Taliani S, Da Pozzo E et al. Apoptosis therapy in cancer: the first single-molecule co-activating p53 and the translocator protein in glioblastoma. Scientific reports. 2014 Apr 23;4. doi:10.1038/srep04749.

4. Hu X, Miao W, Zou Y, et al. Expression of p53, epidermal growth factor receptor, Ki-67 and O6-methyl-guanine-DNA methyltransferase in human gliomas. Oncology letters. 2013 Jul 1;6(1):130-4. doi:10.3892/ol.2013.1317.

5. Ganguly A, Chen Z. Li-Fraumeni Syndrome. InMolecular Pathology in Clinical Practice 2016 (pp. 377383). Springer International Publishing.

6. Kruiswijk F, Labuschagne CF, Vousden KH. p53 in survival, death and metabolic health: a lifeguard with a licence to kill. Nature reviews Molecular cell biology. 2015 Jul 1;16(7):393-405. doi:10.1038/nrm4007.

7. Leroy B, Anderson M, Soussi T. TP53 mutations in human cancer: database reassessment and prospects for the next decade. Human mutation. 2014 Jun 1;35(6):672-88. doi: 10.1002/humu.22552.

8. Reed SM, Hagen J, Tompkins VS et al. Nuclear interactor of ARF and Mdm2 regulates multiple pathways to activate p53. Cell cycle. 2014 Apr 15;13(8):1288-98. doi:10.4161/cc.28202.

9. Takami H, Yoshida A, Fukushima S et al. Revisiting TP53 mutations and immunohistochemistry - a comparative study in 157 diffuse gliomas. Brain Pathology. 2015 May 1;25(3):256-65. doi:10.1111/bpa.12173.

10. Tanboon J, Williams EA, Louis DN. The Diagnostic use of immunohistochemical surrogates for signature molecular genetic alterations in gliomas. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 2016 Jan 1;75(1):4-18. doi:10.1093/jnen/nlv009.

11. Riley T, Sontag E, Chen P, Levine A. Transcriptional control of human p53-regulated genes. Nature reviews Molecular cell biology. 2008 May 1;9(5):402-12. doi:10.1038/nrm2395.

12. Louis DN, Ohgaki H, Wiestler OD, Cavenee WK (eds) (2007) WHO Classification of tumours of the central nervous system. IARC, Lyon.

CraTra Hagmm^a go pega^ii 10.10.2016

♦