CC BY
105
УДК 615.322:582+633.88
АНАЛИЗ ОРГАНИЧЕСКИХ КИСЛОТ И ТРИТЕРПЕНОВЫХ САПОНИНОВ В ИЗВЛЕЧЕНИЯХ ИЗ ТРАВЫ КОПЕЕЧНИКА КУСТАРНИКОВОГО
Власова Ю. С., Коган Е.Г., Кисилёва А.Н.
Научный руководитель - к.фарм.н., доцент Кисилёва А.Н.
Смоленский государственный медицинский университет, Россия, 214019, Смоленск, ул. Крупской, 28.
[email protected] - Коган Евгений Геннадьевич
Резюме. В статье представлены результаты определения органических кислот и тритерпеновых сапонинов в водном и водно-спиртовом извлечениях из травы копеечника кустарникового. Изучение состава органических кислот включало в себя проведение качественного обнаружения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и количественного определения методом титриметрии; обнаружение тритерпеновых сапонинов основывалось на методе тонкослойной хроматографии (ТСХ) и количественном определении содержания сапонинов методом спектрофотометрии. В траве копеечника кустарникового выявлено наличие ряда органических кислот и сапонинов преимущественно тритерпенового ряда. Установлено количественное содержание данных групп биологически активных веществ. Используемый метод количественного определения сапонинов прошел процесс валидаци. Так как относительная ошибка результатов опытов с добавками не превысила относительную ошибку единичного определения и имеет отклонения в сторону как положительных, так и отрицательных значений, это свидетельствует об отсутствии систематической ошибки в предлагаемой методике количественного анализа сапонинов.
Ключевые слова: копеечник кустарниковый, астрагалозид, тритерпеновые сапонины, органические кислоты, аскорбиновая кислота.
ANALYSIS OF ORGANIC ACIDS AND TRITERPENE SAPONINS IN THE EXTRACT OF HEDYSARUM FRUTICOSUM Vlasova Y.S., Kogan E.G., Kisilyova A.N.
Scientific adviser: assistant professor Kisilyova A.N., Candidate of Pharmacy Smolensk State Medical University, Russia, 214019, Smolensk, Krupskoy St., 28. Summary. The article presents the results of determination of organic acids and triterpene saponins in water and water-alcohol extracts of Hedysarum fruticosum. The study of the composition of organic acids consisted of conducting qualitative detection by high performance liquid chromatography (HPLC) quantification method titrimetry. The detection of triterpene saponins was based on the method of thin layer chromatography (TLC) and quantitative determination of saponins by the method of spectrophotometry. In Hedysarum fruticosum we revealed the presence of several organic acids and saponins predominantly those of the triterpene series. The quantitative content of biologically active substances in these groups was determined. The method used for the quantitative determination of saponins passed the validation process, as the relative error of the results of the experiments with additives did not exceed the relative error of a single determination and had a deviation to both positive and negative values, indicating the absence of systematic errors in the proposed method for the quantitative analysis of saponins. Keywords: Hedysarum fruticosum, astragaloside, triterpene saponins, organic acids, ascorbic acid.
Введение. Копеечник
кустарниковый (Hedysarum fruticosum Pall.) - вид из семейства Бобовые (Fabaceae) - это полукустарник, обширно произростающий на территории Сибирского федерального округа. Выбор объектов работы обусловлен тем, что
копеечник кустарниковый практически не исследован. Однако, предположительно, он также может содержать комплекс важных БАВ. Следовательно, необходимо провести комплексный
фармакогностический анализ копеечника кустарникового [6].
Предварительный фитохимический скрининг извлечений из травы копеечника кустарникового показал наличие таких групп биологически-активных соединений, как флавоноиды, дубильные вещества, аминокислоты, углеводы, каротиноиды и др. [3, 4].
Целью настоящей работы явилось изучение качественного и количественного состава органических кислот и тритерпеновых сапонинов в извлечении из травы копеечника кустарникового.
Методика. Объектом исследования служили надземные части копеечника кустарникового, собранные на территории района Южный лагерь в окрестностях Улан-Удэ.
Органические кислоты определяли с помощью метода ВЭЖХ, используя хроматограф фирмы «GILSON» Франция. Полученные результаты обрабатывали на компьютере при использовании программы «Мультихром для Windows». В качестве подвижной фазы выступал 0,005 М раствор кислоты серной. В качестве неподвижной фазы выбрана металлическая колонка размером 6,5*300 мм ALTECH OA-1000 Organic Acids. Скорость подачи элюента 1 мл/мин. Температура колонки 200 °С. Детектирование проводилось с помощью УФ-детектора при длине волны 190 нм. В качестве образцов сравнения использовали серию растворов органических кислот: аскорбиновой, лимонной, щавелевой, яблочной, янтарной, виннокаменной [8].
Свободные органические кислоты в траве копеечника кустарникового определяли по методике ГФ XIII издания [2], в качестве титранта использовали раствор натрия гидроксида (0,1 моль/л), индикатором служил раствор, состоящий из 2 мл спиртового раствора метиленового синего 0,1% и 1 мл раствора фенолфталеина 1%. Количественное определение в траве копеечника кустарникового органических кислот вели в перерасчете на яблочную кислоту.
Аскорбиновую кислоту определяли количественно методом титриметрии согласно методики ГФ XIII издания [2].
Для определения тритерпеновых соединений в сырье копеечника кустарникового использовали водно-спиртовое и водное извлечения, в которых определяли их наличие с помощью качественных реакций: осаждение средним свинца ацетатом; реакцией Лафона; реакцией пенообразования; реакцией Фонтан-Канделя [7], а также методом ТСХ, в системе растворителей: толуол -этилацетат (93:7), далее хроматограмму высушивали и проявляли раствором ванилина в смеси спирта и серной кислоты
[5].
Тритерпеновые соединения
количественно определяли
спектрофотометрическим методом, в основе которого лежит реакция с концентрированной серной кислотой и дальнейшим измерением оптической плотности полученных комплексов [ 1 ].
Результаты исследования и их обсуждение. Качественное обнаружение органических кислот, проведенное методом ВЭЖХ позволило
идентифицировать в траве копеечника кустарникового 5 органических кислот: аскорбиновую (25,25%), янтарную (12,95%), щавелевую (6,73%), яблочную (3,57%) и винную кислоты (3,06%) (табл. 1).
Количественный анализ свободных органических кислот, проведенный методом титриметрии по методике ГФ XIII издания, позволил установить их содержание в траве копеечника кустарникового, которое составляет 3,58±0,11% в пересчете на яблочную кислоту.
В результате количественного анализа аскорбиновой кислоты, проведенного титриметрическим методом согласно ГФ XIII издания, установлено, что её содержание в траве копеечника кустарникового равно 0,0096±0,01%.
Таблица 1. Результаты ВЭЖХ-анализа органических кислот травы копеечника кустарникового_
№ Время, Высота, Площадь, Концентрация, Название соединения
мин шУ mV*сек %
1 2.902 117.35 4067.20 25.25 Аскорбиновая кислота
2 4.563 25.72 1084.59 6.73 Щавелевая кислота
3 5.891 15.03 492.07 3.06 Винная кислота
4 6.742 14.69 575.01 3.57 Яблочная кислота
5 7.853 29.60 2086.20 12.95 Янтарная кислота
6 9.209 13.18 552.43 3.43 Неидентифицировано
7 12.6 20.21 4559.24 28.31 Неидентифицировано
8 16.86 5.29 604.78 3.76 Неидентифицировано
9 20.69 14.40 1252.48 7.78 Неидентифицировано
Результаты анализа тритерпеновых соединений. В результате качественных реакций: осаждение средним свинца ацетатом, реакцией Лафона, реакцией пенообразования и реакцией Фонтан-Канделя, были определены сапонины в траве копеечника кустарникового, а также
установлено их отношение к тритерпеновой природе.
На хроматограмме испытуемого водно-спиртового извлечения из травы копеечника кустарникового
обнаруживаются зоны серовато-синего цвета с около 0,38, что соответствует зоне адсорбции астрагалозида (рис. 1).
фронт растворителя
Рис. 1. Схема тонкослойной хроматограммы водно-спиртового извлечения из травы
копеечника кустарникового
Количественный анализ,
проведенный методом спектрофотометрии показал, что содержание тритерпеновых
сапонинов в траве копеечника кустарникового составляет не менее 2,5% в пересчете на астрагалозид (табл. 2, 3).
Таблица 2. Результаты спектрофотометрического определения содержания суммы сапонинов в траве копеечника кустарникового
№ образца Содержание суммы сапонинов, %
1 2,50
2 2,57
3 2,58
4 2,61
5 2,63
6 2,59
Таблица 3. Метрологические характеристики количественного определения суммы тритерпеновых сапонинов в траве копеечника
п f Р, % КРЛ Хср, % S2 Sх А Хсс Eср, %
6 5 95 2,57 2,58 0,00200 0,0183 0,0469 1,82
Правильность аналитической
методики количественного определения доказывается на всем диапазоне применения, то есть методика должна давать отсутствие систематической ошибки и близость результатов (таблица
Таким образом, относительная ошибка результатов опытов с добавками не превышает относительную ошибку единичного определения и имеет отклонения в сторону как положительных, так и отрицательных значений, что свидетельствуют об отсутствии
систематической ошибки в предлагаемой методике анализа.
Выводы
1. Методом ВЭЖХ-анализа с использованием образцов сравнения в водных извлечениях травы копеечника кустарникового установлено наличие органических кислот: аскорбиновой (25,25%), янтарной (12,95%), щавелевой
(6,73%), яблочной (3,57%) и винной (3,06%).
2. Метод титриметрии установлено содержание органических кислот в траве копеечника кустарникового, которое составляет 3,58±0,11% в пересчете на яблочную кислоту.
3. В результате количественного анализа аскорбиновой кислоты, проведенного титриметрическим методом согласно ГФ XIII издания, установлено, что её содержание в траве
4). Проверка правильности исполнения методики заключается в отсутствии систематической ошибки измерений при добавке к испытуемому раствору известного количества стандартного образца астрагалозида.
копеечника кустарникового равно 0,0096±0,01%.
4. С помощью качественных реакций в траве копеечника кустарникового были обнаружены сапонины, а также установлено их отношение к тритерпеновой природе. На хроматограмме испытуемого водно-спиртового извлечения из травы копеечника кустарникового обнаруживаются зоны серовато-синего цвета с около 0,38, что соответствует зоне адсорбции астрагалозида.
5. Количественное определение тритерпеновых сапонинов, проведенное спектрофотометрическим методом, показало, что содержание их в траве копеечника кустарникового составляет не менее 2,5% в пересчете на астрагалозид.
6. Полученные данные могут быть использованы при разработке нормативной документации на новый вид лекарственного растительного сырья «Копеечника кустарникового трава».
Таблица 4. Определение правильности выполнения методики
спектрофотометрического определения суммы тритерпеновых сапонинов
Взято в сырье, г Добавлено СО, г Должно быть, г Найдено, г Ошибка
Абсолютная, г Относительная, %
2,58 0,645 3,225 3,214 - 0,011 - 0,34
2,58 1,29 3,87 3,96 + 0,090 + 2,3
2,58 1,935 4,515 4,498 - 0,017 - 0,38
2,58 2,58 5,16 5,19 + 0,030 + 0,58
Литература
1. Аль-Гифри С.К. Фармакогностическое изучение растений рода Дурнишник : дис. ... канд. фармацевт. наук. - Курск, 2010. - 174 с.
2. Государственная фармакопея РФ, XIII издание, том. 3. - М.: 2015. - 1292 с.
3. Кисилёва А.Н., Крикова А.В., Коган Е.Г. Изучение аминокислотного состава травы копеечника кустарникового (Hedysarum fruticosum Pall.). // Наука молодых (Eruditio Juvenium). - 2016. - №4. - С. 72-78.
4. Коган Е.Г., Кисилева А.Н., Власова Ю.С. и др. Изучение некоторых фенольных соединений травы копеечника кустарникового. В сб.: Сборник материалов XXIII Российского национального конгресса «Человек и лекарство», М., 11 апреля, 2016. - С. 237-238.
5. Кондратова Ю.А. Тритерпеновые соединения вероники австрийской. В сб.: Молодежная наука и современность. Мат-лы 74-й межвуз. итог. науч. конф. Курск, 21-22 апреля, 2009. - С.182-183.
6. Минаева В.Г. Лекарственные растения Сибири. - Новосибирск.: Наука, 1991. - С. 273-274.
7. Солохина И.Ю., Гнеушева И.А., Павловская Н.Е. Исследование тритерпеновых сапонинов, полученных из корней овса посевного Avena sativa L. // Вестник Орлов. гос. аграрного ун-та. - 2012. № 2 (35). - С. 48-50.
8. Шафикова С.Ф., Латыпова Г.М. Исследование содержания органических кислот в сырье хмеля обыкновенного. // Медицинский вестник Башкортостана. - 2013. - №1 (8). -С. 86-88.
