CC BY
38
УДК 630*161.4
А. В. Константинов, аспирант, младший научный сотрудник (Институт леса НАН Беларуси)
АНАЛИЗ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА СОМАКЛОНАЛЬНЫХ ГЕНОТИПОВ МЕЖВИДОВОГО ГИБРИДА BETULA PENDULA х PUBESCENS
Были изучены морфофизиологические особенности растений-регенерантов различных сомакло-нальных линий, полученных способом непрямого морфогенеза из листовых эксплантов гибрида B. pendula х pubescens. Показано различие ростовых характеристик микроклональных саженцев на последнем пассаже in vitro и после двух месяцев их выращивания ex vitro. Ряд новых генотипов характеризуется интенсивным кущением и формированием большого количества междоузлий.
Clonally propagated birch seedlings of 10 somaclonal lines derived from leaf explant of hybrid B. pendula х pubescens were acclimatized to soil conditions. Morphometric parameters of regenerated plants from different lines were studied in in vitro and ex vitro conditions. The difference of the growth characteristics of plantlets were observed both during the last passage in vitro and after two months of cultivation ex vitro. A number of genotypes characterized by intense bushing and the formation of a large number of internodes.
Введение. Виды рода Береза (Betula spp.) занимают важное место в лесной отрасли стран Северной и Восточной Европы. Особый интерес представляют мейотические триплоиды березы, получаемые путем скрещивания тетрап-лоидной (4n = 56) березы пушистой и диплоидной березы повислой (2n = 28). Получаемые в результате гибриды Betula pendula х pubescens, зачастую отличающиеся быстрым ростом, прочной устойчивой к гнилям древесиной, декоративностью и являются перспективным материалом для селекционной работы, в том числе с использованием биотехнологических методов [1].
Исследования по культуре тканей древесных растений объединяют фундаментальное и прикладное направления, позволяющие получать новые генотипы на основе исходного материала, культивируемого в условиях in vitro, в связи с усилением частоты и спектра генетической изменчивости в результате изменения гормонального баланса в тканях экспланта после его выхода из-под контроля организма. Ткани листа растения изначально содержат значительное число анеуплоидных и полиплоидных клеток, в связи с чем их дедифференциация и последующая регенерация растений из каллусной ткани эффективны для получения уклоняющихся форм (сомаклональных вариантов) [2, 3]. Самым простым методом, позволяющим обнаружить сомаклональные изменения у растений, является их морфологическая оценка.
Биоморфологические проявления сомакло-нальной изменчивости часто схожи с морфозами (ненаследуемыми эпигенетическими изменениями), являющимися обратимыми и выражающимися в изменении ростовых показателей, интенсивности ветвления и способности к укоренению. Часто подобные явления происходят в результате воздействия культуральных условий [4].
Существует необходимость различать морфозы и сомаклональную изменчивость. Сохранение признака в процессе микроклонирования и после выведения регенерантов из условий in vitro является подтверждением его устойчивого наследования [5].
В связи с вышесказанным, целью работы являлся анализ морфометрических показателей развития растений-регенерантов сомаклональ-ных линий березы.
Основная часть. Материалом для исследований служили линии сомаклональных регене-рантов гибридной березы № 52-84/8. Указанные культуры тканей были получены способом непрямого морфогенеза из соматических тканей листьев плюсового дерева, отобранного сотрудниками Института лесного хозяйства Литвы (Каунас). Культивирование развившихся регене-рантов после отделения от каллуса проводили раздельно на среде WPM (G. Lloyd & B. McCown, 1980) без регуляторов роста с присвоением номеров разным линиям. Материал культивировали на протяжении шести пассажей продолжительностью три месяца. Использование безгормональных сред для поддержания перевиваемой коллекции позволяло исключить влияние регуляторов роста на морфологию регенерантов. Визуально выделили 10 линий различной морфологии, одна из которых была принята за контроль (наиболее типичного для микропобегов березы морфотипа). Для каждой культуры был проведен RAPD-анализ полиморфных локусов с использованием пяти праймеров Oligo 1, 3, 5, 6, 8 и 9, в результате которого установили генетическую разнородность материала.
На последнем пассаже перед перенесением в почву растения выращивали два месяца для обеспечения высокой (94-98%) укореняемости регенерантов.
140
ISSN 1683-0377. Трулы БГТУ. 2014. № 1. Лесное хозяйство
Адаптацию микрорастений березы проводили в кассетах по 54 ячейки объемом 70 мл в субстрате, представляющем собой смесь нераскисленно-го торфа и песка в соотношении 3:1. Выращивание растений осуществляли под фитолампами марки Osram Fluora (освещенность 1,5-2,0 тыс. лк, фотопериод 16/8) при температуре 21-23°С. Процесс акклиматизации включал два этапа, на первом кассеты помещали в климатическую камеру, для обеспечения относительной влажности воздуха около 90-95% в течение 30 суток. После чего посадочный материал выращивался в сходных условиях, но без контроля влажности воздуха в течение месяца. Непосредственно перед высадкой растений в субстрат определяли высоту стволика и длину главного корня (мм), количество междоузлий, корней и боковых побегов. В конце периода адаптации проводили изучение аналогичных параметров, дополнительно определяли диаметр стволика (мм), сырую и сухую массу растений (мг) для расчета их оводненности (%). Статистическая обработка данных проводилась с использованием пакета анализа Microsoft Excel. Для определения достоверных различий между вариантами опыта и контролем использовали t-критерий Стьюдента.
В ходе визуальной оценки отмечено различие морфологических признаков линий сомаклональ-ных регенерантов, полученных на основе клона триплоидного гибридного генотипа березы. Значительные изменения морфотипа отмечались у регенерантов линий SC1, SC2 и SC9. На последнем пассаже in vitro перед перенесением в нестерильные условия ex vitro они характеризовались интенсивным ветвлением (до 11 побегов на 1 растение у линии SC1) и значительной утолщенно-стью, при этом отмечалось слабое развитие листовых пластинок по сравнению с другими вариантами. Так у линий SC1 и SC2 их длина не превышала 7 мм, а у растений линии SC9 наблю-
далась почти полная редукция листьев, кроме того они были практически лишены черешков. Особенности развития побега у растений были следующими: удлиненные междоузлия (10-15 мм и более) чередовались с укороченными (менее 0,5 см), при этом интенсивное ветвление наблюдалось
на укороченных междоузлиях. Сомаклоны гибридной березы линий SC1, SC2 и SC9 имели значительно большее количество междоузлий (от 15,8 ± 5,3 до 22,9 ± 7,5 шт.) по сравнению с контрольным вариантом (6,8 ± 2,4 шт.) и другими линиями. Средняя высота побега регене-рантов после двух месяцев культивирования in vitro была равна 38,8 ± 10,2 мм и 25,3 ± 5,5 мм у регенерантов линий SC2 и SC9 соответственно, что достоверно ниже показателей у растений линий SC4 и SC6 (65,5 ± 9,6 и 60,9 ± 14,5 мм). При этом в контрольном варианте (линия SC10) значение изучаемого показателя было равно 40,3 ± 9,8 мм, что свидетельствует о разнородности влияния сомаклональной изменчивости на ростовые характеристики растений-регенерантов.
Наряду с усиленным ветвлением растений отдельных линий наблюдались изменения показателей средней длины их главного корня. Так, значения данного показателя составляло 11,0 ± 3,0 мм, 13,0 ± 6,4 мм и 5,9 ± 2,5 мм для растений линий SC1, SC2, SC9, что достоверно ниже показателей контрольных растений (31,9 ± 17,9 мм). Количество корней, образованных после двух месяцев культивирования, достоверно не отличалось по вариантам. Кроме того, у регенерантов линий SC1 и SC9 наблюдали формирование каллуса у основания побегов, чего не отмечали в других вариантах.
Морфометрические показатели сомакло-нальных растений-регенерантов различных линий гибридной березы представлены в табл. 1.
Линия Длина главного Количество побегов Количество междоузлий Длина главного Количество корней
побега, мм на регенерант, шт. на регенерант, шт. корня, мм на регенерант, шт.
SC1 46,7 ± 11,0 8,6 ± 2,9 22,9 ± 7,5 11,0 ± 3,0 2,2 ± 0,8
SC2 38,8 ± 10,2 5,1 ± 1,7 16,9 ± 5,5 13,0 ± 6,4 2,0 ± 1,3
SC3 51,5 ± 9,2 1,5 ± 0,7 6,9 ± 2,5 20,7 ± 10,1 2,3 ±0,8
SC4 65,5 ± 9,6 1,3 ± 0,6 7,4 ± 2,2 24,2 ± 12,1 2,9 ± 1,0
SC5 57,8 ± 11,5 1,6 ± 0,6 7,0 ± 2,4 27,4 ± 16,2 2,9 ± 0,9
SC6 60,9 ± 14,5 1,5 ± 0,5 6,4 ± 2,3 28,3 ± 20,1 2,8 ± 1,2
SC7 52,5 ± 10,2 1,2 ± 0,4 6,7 ± 2,3 21,7 ± 15,8 2,1 ± 1,0
SC8 50,9 ± 12,1 1,5 ± 0,8 6,7 ± 1,8 19,9 ± 13,4 2,8 ± 1,1
SC9 25,3 ± 5,5 3,8 ± 1,4 15,8 ± 5,3 5,9 ± 2,5 2,0 ± 0,9
SC10 40,3 ± 9,8 1,1 ± 0,3 6,8 ± 2,4 31,9 ± 17,9 3,1 ± 1,3
Таблица1
Морфометрические показатели сомаклональных регенерантов гибридной березы различных линий
перед высадкой в почвенные условия
Таблица 2
Морфометрические и количественные показатели сомаклональных регенерантов гибридной березы различных линий после двух месяцев адаптации ex vitro
Линия Длина главного побега, мм Количество побегов на растение, шт. Количество междоузлий на растение, шт. Длина главного корня, мм Количество корней на растение, шт. Диаметр стволика, мм Сырая фитомасса, мг Сухая фитомасса, мг
SC1 127,6 ± 38,0 6,1 ± 2,8 45,9 ± 17,1 61,7 ± 27,8 4,3 ± 1,5 1,7 ± 0,5 533,3 ± 400,3 126,7 ± 81,6
SC2 114,5 ± 28,3 4,8 ± 2,2 36,7 ± 9,7 100,0 ± 26,7 3,2 ± 0,8 1,7 ± 0,4 745,0 ± 336,5 148,3 ± 100,]
SC3 128,9 ± 35,6 1,6 ± 0,8 14,1 ± 3,5 122,2 ± 40,3 6,0 ± 2,0 0,9 ± 0,4 541,7 ± 215,7 200,0 ± 82,0
SC4 154,4 ± 30,1 2,0 ± 0,9 16,2 ± 4,2 94,8 ± 32,0 8,2 ± 3,1 1,6 ± 0,5 598,3 ± 334,2 125,0 ± 48,1
SC5 121,8 ± 18,7 2,2 ± 0,8 19,6 ± 5,0 108,0 ± 33,7 6,2 ± 1,2 0,9 ± 0,2 638,3 ± 179,2 148,3 ± 84,0
SC6 128,8 ± 19,0 1,5 ± 0,6 13,2 ± 3,2 95,5 ± 27,3 5,3 ± 1,9 1,3 ± 0,4 456,7 ± 206,8 125,0 ± 31,5
SC7 124,9 ± 31,2 1,6 ± 0,8 16,1 ± 4,4 79,2 ± 33,8 5,0 ± 2,1 0,8 ± 0,3 331,7 ± 305,2 101,7 ± 45,4
SC8 118,3 ± 27,9 1,7 ± 0,8 17,1 ± 5,0 73,5 ± 24,2 7,7 ± 1,2 1,0 ± 0,9 356,7 ± 174,8 65,0 ± 78,2
SC9 53,2 ± 17,9 6,1 ± 2,5 32,9 ± 10,9 33,3 ± 19,2 5,7 ± 2,8 0,6 ± 0,1 201,7 ± 96,6 41,7 ± 29,9
SC10 113,3 ± 23,8 2,1 ± 1,0 22,7 ± 6,4 69,3 ± 37,9 7,2 ± 1,5 0,8 ± 0,3 500,0 ± 362,0 126,7 ± 81,6
Морфометрические и количественные показатели сомаклональных регенерантов гибридной березы различных линий после двух месяцев адаптации ex vitro представлены в табл. 2.
Показатели средней высоты стволика саженцев гибридной березы достоверно не отличались в большинстве вариантов (113,3 ± 23,8 мм в контроле), исключение составляли саженцы линии SC9 (53,2 ± 17,9 мм). Сохранилась тенденция к усиленному ветвлению растений линий SC1, SC2 и SC9 (4,8-6,1 шт. побегов на саженец) в то время как их количество в других вариантах варьировало от 1,6 ± 0,8 шт. до 2,2 ± 0,8 шт. Соответственно и среднее количество междоузлий растений указанных линий превышало показатели ряда других вариантов. Так, среднее значение показателя для линии SC1 в пересчете на одно растение составляло 45,9 ± 17,1 шт, а в контроле - 22,7 ± 6,4 шт. Среднее количество корней на растение варьировало от 4,3 ± 1,5 до 8,2 ± 3,1 шт. на саженец и достоверно не отличалось по вариантам, за исключением линии SC2 (3,2 ± 0,8 шт.). Аналогично не отмечено достоверных отличий показателей средних диаметров стволиков.
Максимальная приживаемость микрокло-нальных регенерантов (100%) отмечена для растений линий SC3, SC5 и SC6, а минимальная (44,4%) - для регенерантов SC9. В контроле данный показатель был равен 53,7%.
Содержание воды в растениях (соотношение разницы между сырой и сухой массой к сухой массе) после двух месяцев выращивания ex vitro колебалось по вариантам. Высокий уровень оводненности (80,1 и 81,8%) отмечен со-
ответственно для растений линий 8С2 и 8С8. Минимальный показатель получен для линии 8С3 и был равен 63,1%. Оводненность растений контрольной группы составила 74,7%, а в остальных вариантах 72,6-79,1%. Подобные отклонения говорят о выраженных различиях водного обмена у растений сомаклональных линий, что может определять их различную потребность в воде в естественных условиях.
Заключение. Таким образом, в ходе проведения эксперимента и изучения морфометриче-ских параметров сомаклональных растений триплоидного гибридного генотипа березы была выявлена значительная морфологическая изменчивость отдельных линий полученных способом непрямого морфогенеза.
Литература
1. Бородина Н. А. Полиплоидия в интродукции древесных растений. М.: Наука, 1982. 176 с.
2. Ветчинникова Л. В. Карельская береза и другие редкие представители рода Betula Ь. / отв. ред. А. Ф. Титов; Ин-т леса Карельского научного центра РАН. М.: Наука, 2005. 269 с.
3. Картель Н. А., Кильчевский А. В. Биотехнология в растениеводстве: учебник. Минск: Тэхналопя, 2005. 310 с.
4. Проявление сомаклональной изменчивости у микроразмноженных и трансгенных растений / В. Г. Лебедев [и др.] // Известия ТСХА, 2012. Вып. 1. С. 153-163.
5. Хон Б., Денис Э. М. Мобильность генома растений. М.: Агропромиздат, 1990. 271 с.
Поступила 05.02.2014
