CC BY
119
УДК 577
К. Фехтер
Университет Цинциннати, г. Цинциннати, штат Огайо, США
А. А. Поролло
Университет Цинциннати, г. Цинциннати, штат Огайо, США Научно-исследовательский центр при детском госпитале г. Цинциннати, штат Огайо, США
Анализ миссенс-мутаций в цитохромах Р450 человека
Геном человека содержит 57 генов, кодирующих цитохромы Р450 (СУР). Миссенс-мутации в соответствующих белках могут приводить к развитию различных болезней, таких как неправильное формирование органов и раковые опухоли. На сегодняшний день не существует метода, позволяющего с достаточной точностью предсказать, как повлияет та или иная мутация на организм человека. В данной работе проведен анализ всех известных мутаций в человеческих СУР с целью поиска возможных характеристик, позволяющих расчетным образом разграничить нейтральные мутации от злокачественных.
Ключевые слова: анализ миссенс-мутаций, цитохром Р450, СУР, предсказание эффекта мутации, характеристика мутации.
Цитохромы Р450 (СУР) составляют суперсемейство ферментов (гемопротеинов), которые катализируют широкий спектр реакций, включая гидроксилирование, эпоксидирование, окислительное деалкилирование и др. [1]. В организме человека ферменты этого семейства выполняют разнообразные функции от биосинтеза стероидных гормонов, обмена жирных кислот до биотрансформации различных ксенобиотиков, в том числе и лекарств. Поскольку СУР участвуют в различных биологических процессах (формирование и развитие органов, скелета и т. д.), неправильная или несбалансированная работа этих ферментов, например в результате мутации в их белковой структуре, может привести к различным болезням, а также определять индивидуальную восприимчивость к факторам окружающей среды, будь то сигаретный дым или лекарство [2].
Несмотря на огромное разнообразие первичной структуры ферментов этого суперсемейства, на сегодня состоящего из нескольких тысяч белков (только в человеческом геноме присутствует 57 генов, кодирующих СУР, принадлежащих 18 семействам), все они имеют сходные вторичные и третичные структурные характеристики [3]. Так, в каждой трехмерной структуре СУР присутствует полость разной величины. В ней всегда располагается гем, который и катализирует реакцию окисления. Помимо гема, в полость проникают субстраты, где они подвергаются окислению. Размер полости и вид аминокислот, расположен-
ных внутри полости, определяют эффективность и специфичность фермента: химический класс(ы) субстратов, их размер, стерео- и региоспеци-фичность и скорость реакции. Всем CYP требуется белковый партнер, который передает на гем электрон, необходимый для прохождения окислительно-восстановительной реакции с субстратом. В зависимости от расположения фермента в клетке, этим партнером выступает или ферре-доксин (FDX) или P450 оксид оредуктаза (POR). Во многих структурах встречается четко определенный канал доступа субстрата к активному центру фермента (полости с гемом) и отвода продуктов реакции.
Очевидно, что миссенс-мутации могут происходить в любой части гемопротеина и иметь различный эффект на функцию белка. Мутации, приходящиеся на полость фермента могут: (1) препятствовать связыванию белка с гемом, что приведет к полной потери ферментативной функции, (2) изменить аффинность связывания субстрата и его ориентации относительно иона железа в геме, что приведет или к частичной потере функции или смене места окисления на субстрате или даже смене классов окисляемых субстратов. Мутации в канале доступа субстрата к активному центру фермента могут изменить скорость продвижения субстрата по каналу или полной блокировке этого доступа. Мутации могут также влиять на трехмерную структуру фермента и на его взаимодействие с белковым
партнером, указанным выше, что тоже может снизить или совсем прекратить функцию гемо-протеина. Следует отметить, что некоторые мутации могут увеличить скорость протекания ферментативной реакции, что также может привести к негативным последствиям на физиологическом уровне организма, если не будет доступно каких-либо компенсаторных механизмов.
С бурным ростом технологий секвенирования полного генома и экзома человека происходит активное развитие персональной медицины, когда, например, новорожденным проводят генетический анализ для выявления потенциальных рисков развития генетических болезней и проведения превентивных мер или пациентам, требующим сложного медикаментозного лечения, проводят предварительный анализ мутаций CYP, отвечающих за метаболизм ксенобиотиков, для подбора индивидуальных режимов по скорости и объему принимаемых лекарств в соответствии с индивидуальной фармакологической картиной пациента. В то время как базы данных по мутациям постоянно пополняются, аннотация мутаций по ассоциированным болезням значительно отстает. Кроме того, далеко не все мутации приводят к негативным последствиям. В связи с этим, существует острая необходимость в разработке предсказательной системы для оценки влияния новой мутации на функцию CYP. Данная работа представляет анализ всех опубликованных мутаций в CYP и их эффектов, аннотированных и доступных в базах данных на сегодняшний день с тем, чтобы выявить характеристики гемопротеинов и их мутаций, которые можно было бы использовать в качестве ввода в математическую модель предсказания эффекта мутаций на функцию цитохромов P450.
Методы и материалы. Канонические аминокислотные последовательности CYP были взяты из базы данных UniProt (http://www.uniprot.org/). Информация о мутациях в CYP и ассоциированных болезнях получена из таблицы UniProt humsavar [4]. Для предсказания стуктурных характеристик белков использовались следующие методы: SABLE для вторичной структуры белка и относительной доступности аминокислотных остатков к растворителю (воде) [5]; MINNOU — мембранных участков белка [6]; SPPIDER — аминокислотных остатков, участвующих в белок-белковом взаимодействии [7].
Третичные структуры ферментов (если доступны) были получены из Protein Databank
(PDB, http://www.pdb.org/). Для неполученных экспериментально структур использовались трехмерные модели из депозитария SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/). Анализ трехмерных структур на предмет активного центра (полости), межатомных контактов с гемом и субстратами (если доступно) проводился с помощью веб-сервера POLYVIEW-3D (http ://polyview.cchmc. org/polyview3 d.html).
Эволюционный профиль всех ферментов был получен с помощью PSI-BLAST [8] на основе NCBI nr базы белковых последовательностей (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/) после трех итераций множественного выравнивания.
Результаты. В версии таблицы UniProt humsavar от 31 октября 2012 г., использованной в этой работе, содержалась информация о 562 мутациях в 51 из 57 CYP человека. При внимательном просмотре этой информации обнаружилось, что 36 ферментов содержат информацию только о нейтральных или, скорее, о еще непро-аннотированных мутациях. Выборочный литературный поиск показал, что в недавних работах уже показан ряд негативных последствий этих миссенс-мутаций. Например, мутация I462V в CYP1A1, хотя и аннотирована в таблице как нейтральная, уже ассоциирована с раковыми заболевания и другими физиологическими нарушениями [9; 10]. В связи с неопределенностью статуса мутаций в 36 CYP, они были исключены из дальнейшего рассмотрения в этой работе. Таким образом, анализ проводился на основе 15 CYP и 270 мутаций, из которых 73 были аннотированы как нейтральные и 197 как злокачественные.
Таблица 1 содержит структурную информацию о выбранных для анализа 15 CYP. Сначала была проведена оценка попадания злокачественных мутаций DM в разные категории C с учетом условной вероятностиP(DM\C) по следующей формуле:
P(DM n C) = P(C)(DM|C),
где категории основаны на структурной информации, например мембранная часть белка, интерфейс белок-белкового взаимодействия, полость активного центра и др. В таблице 2 сведены все полученные вероятности.
Как видно из таблицы 2, использование вероятностей злокачественных мутаций для предсказания эффекта новых миссенс-мутаций не представляется практичным. Например, совершенно очевидно, что хотя большинство мутаций, приходящихся на полость активного центра и контакты
с гемом (91 и 97 % соответственно), имеют значительный эффект на функцию белка, таких мутаций только 18 и 5 % соответственно, среди всех найденных при секвенировании СУР. В этой связи, представляется более перспективным рассмотреть количественные характеристики СУР и их распределение между нейтральными и злокачественными миссенс-мутациями.
Таблица 1 — Информация о СУР и их лигандах, использованных для анализа мутаций
Символ гена UniProt ID* РББ ГО** Лиганды Число мутаций
CYP1B1 Q16678 3РМ0 Гем, а-нафтофлавон 58
CYP2R1 Q6VVX0 3С7И Гем, витамин D2 1
CYP4F22 Q6NT55 Модель 7
CYP4V2 Q6ZWL3 Модель 14
CYP7B1 O75881 Модель Гем 4
CYP11A1 P05108 3Ы9У Гем, холестерин 7
CYP11B1 P15538 Модель Гем 24
CYP11B2 P19099 4БУд Гем, дезоксикортикостерон 17
CYP17A1 P05093 Гем, ингибитор (3а,8а)-17-(1Н-бензими- дазол-1-ил) андроста-5,16-диен-3-ол (условное название TOK-001) 22
CYP19A1 P11511 3Б79 Гем, ингибитор 4-андростен-3,17-дион 8
CYP21A2 P08686 Модель Гем 63
CYP24A1 Q07973 Модель Гем 6
CYP26B1 Q9NR63 Модель Гем 11
CYP27A1 Q02318 Модель 9
CYP27B1 O15528 Модель Гем 19
Примечапния: * — код доступа к аннотации белка в базе данных ишРго!; ** — код доступа к структуре белка в базе данных РББ.
Таблица 2 — Вероятности попадания злокачественных мутаций в разные структурные категории СУР
Категория, С P(C) P(DM\C) P(DMHC)
Мембранная часть белка 0,05 0,78 0,04
Немембранная структура 0,95 0,73 0,69
Интерфейс белок-белкового взаимодействия 0,24 0,78 0,19
Вне интерфейса белок-белкового взаимодействия 0,76 0,75 0,57
Полость активного центра 0,18 0,91 0,16
Вне полости активного центра 0,82 0,71 0,58
Аминокислоты в контакте с гемом 0,05 0,97 0,05
В этой работе было рассмотрено 9 количественных характеристик, которые условно можно сгруппировать в следующие категории: на основе аминокислотной последовательности, на основе третичной структуры белка, на основе эволюционной информации. Их определения приведены ниже.
Характеристики на основе аминокислотной последовательности отражают изменение физико-химических свойств (гидрофобность, HP и размер аминокислотного остатка, V) при замене исходной аминокислоты (WT) на мутацию (M):
dHP = HPwt - HPm= dV Vwt - VM.
Сюда же относятся характеристики, предсказанные на основе первичной структуры белка методами, указанными выше: вероятность типа вторичной структуры белка (pSS) и относительная доступность аминокислотных остатков к растворителю (pRSA).
В характеристики на основе третичной структуры белка вошли относительная доступность аминокислотных остатков к растворителю (RSA), разница между ней и предсказанной величиной (dRSA = pRSA - RSA), предсказанная вероятность того, что этот аминокислотный остаток вовлечен в белок-белковое взаимодействие (pint).
Из эволюционной информации помимо значений замещения аминокислот (SimSc) из полученных матриц схожести (PSSM), точнее их разницы (dSimSc = SimScWT - SimScM) между исходной аминокислотой (WT) и мутацией (M), также использовалась нормализованная информационная энтропия (S) как мера эволюционной консервативности отдельно взятой позиции в белке:
1 20
S =-ц2й) 5 p ( Pj )•
где Si — энтропия позиции i; pj — вероятность аминокислоты типа j в позиции i; 20 — число типов природных аминокислот.
Распределение этих количественных характеристик между нейтральными (0) и злокачественными (1) мутациями представлено на рисунке. Как видно из соответствующих распределений, большинство характеристик (dHP, dV, pSS, RSA, dRSA, pint) практически одинаково распределено между обоими типами мутаций. Однако три характеристики (pRSA, dSimSc, S) показывают определенное смещение распределения. В частности, злокачественные мутации (1 ) имеют более низкие значения предсказанной относительной
Распределение количественных характеристик CYP между нейтральными (0)
доступности аминокислотных остатков к растворителю, большую разницу между значениями замещения и пониженную энтропию (более консервативные позиции в первичной стуктуре белка).
Заключение. Анализ мутаций в СУР генома человека в контексте взаимосвязи между местонахождением и эффектом мутации на функцию фермента показал, что предсказание на основе вероятностей (с использованием категориальных структурных характеристик) имеет ограниченное практическое применение, т. к. высокая вероятность (порядка 90 %) злокачественной мутации может быть определена только для приблизительно 15 % от общего числа всех известных миссенс-мутаций. В то же время, некоторые количественные структурные характеристики, такие как предсказанная относительная доступ-
ность аминокислотных остатков к растворителю, разница значений замещения аминокислот и энтропия, могут служить входными данными для предсказательной модели на основе алгоритмов машинного обучения.
—т—-
1. Sono M., Roach M. P., Coulter E. D., Dawson Y. H., Heme-Containing Oxygenases, Chem Rev 96 (1996) 28412888.
2. Nebert D. W, Wikvall K., Miller W. L., Human cytochromes P450 in health and disease, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 368 (2013) 20120431.
3. Mestres Y, Structure conservation in cytochromes P450, Proteins 58 (2005) 596-609.
4. Yip Y. L., FamigliettiM., Gos A., DuekP. D., DavidF. P., Gateau A., Bairoch A., Annotating single amino acid polymorphisms in the UniProt/Swiss-Prot knowledgebase, Hum Mutat 29 (2008) 361-366.
K. 0EXTEP, A. A. noponno
27
5. Adamczak R., Porollo A., Meller Y., Accurate prediction of solvent accessibility using neural networks-based regression, Proteins 56 (2004) 753-767.
6. Cao B., Porollo A., Adamczak R., Yarrell M., Meller Y., Enhanced recognition of protein transmembrane domains with prediction-based structural profiles, Bioinformatics 22 (2006) 303-309.
7. Porollo A., Meller Y., Prediction-based fingerprints of protein-protein interactions, Proteins 66 (2007) 630-645.
8. Altschul S. F., Madden T. L., Schaffer A. A., Zhang Y., Zhang Z., Miller W., Lipman D. Y., Gapped BLAST and
PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs, Nucleic Acids Res 25 (1997) 3389-3402.
9. Kisselev P., Schunck W. H., Roots I., Schwarz D., Association of CYP1A1 polymorphisms with differential metabolic activation of 17beta-estradiol and estrone, Cancer Res 65 (2005) 2972-2978.
10. Schwarz D., Kisselev P., Chernogolov A., Schunck W. H., Roots I., Human CYP1A1 variants lead to differential eicosapentaenoic acid metabolite patterns, Biochem Biophys Res Commun 336 (2005) 779-783.
K. Fechter
University of Cincinnati, Cincinnati, OH, USA
A. A. Porollo
University of Cincinnati, Cincinnati, OH, USA Cincinnati Children's Hospital Research Foundation, Cincinnati, OH, USA
Analysis of Missense Mutations in Human Cytochromes P450
Human genome contains 57 genes encoding cytochromes P450 (CYPs). Missense mutations in these genes may cause various diseases, such as organ malformation or cancer development. Currently, there are no computational methods available to reliably predict the effect of a mutation in CYPs. In this work, we conducted a large scale analysis of known mutations in CYPs to identify characteristics that can be used for prediction of newly found mutations to have a benign or deleterious effect.
Key words: analysis of missense mutations, cytochrome P450, CYP, prediction of mutation effect, characteristics of mutations.
