Научная статья на тему 'АНАЛИЗ МИКРОБНОГО РАЗНООБРАЗИЯ КАЗЕОЗНОГО НЕКРОЗА ТУБЕРКУЛЕЗНЫХ ОЧАГОВ'

АНАЛИЗ МИКРОБНОГО РАЗНООБРАЗИЯ КАЗЕОЗНОГО НЕКРОЗА ТУБЕРКУЛЕЗНЫХ ОЧАГОВ Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
78
9
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
МИКРОБИОМ КАЗЕОЗНОГО ОЧАГА

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Орлова Е.А., Огарков О.Б., Суздальницкий А.Е., Хромова П.А., Синьков В.В.

Введение. В настоящем исследовании получены новые данные о специфической микробиоте казеозного содержимого туберкулезных очагов. Сформулировано новое понимание гипотезы о микробиоте, формирующей полимикробный биофильм, повышающий устойчивость к используемым в лечении противотуберкулезным препаратам. Цель исследования. Анализ микробного разнообразия казеозного некроза туберкулезных очагов молекулярно-биологическими методами. Материал и методы. Хирургический материал (388 образцов) за 2018-2019 гг. был исследован ПЦР-методом (GeneXpert) на наличие ДНК микобактерий и мутаций устойчивости к рифампицину. Результаты. По результатам исследования GeneXpert, устойчивость к рифампицину присутствовала в 131 (34%) случае, чувствительность к рифампицину обнаружена в 222 (57%) образцах, ДНК микобактерий туберкулеза не была обнаружена в 35 (9%) случаях. В подавляющем большинстве случаев исследуемым хирургическим материалом были туберкуломы. На основе известных эубактериальных праймеров EUB335L/EUB775R и разработанных самостоятельно TaqMan зондов, создан ПЦР тест. Он пригоден для сравнительного определения концентрации микобактериальной ДНК (мбтДНК) в очаге относительно тотальной эубактериальной (эубДНК). Полученные результаты свидетельствуют, что исследуемые сообщества микроорганизмов в туберкулезных очагах делятся как минимум на 2 типа: (i) микобактериальная казеома (туберкулома), в которой 70% геномов и более соответствует микобактериям туберкулеза; (ii) полимикробное сообщество, в котором концентрация микобактерий туберкулеза варьирует от 0 до 10%. Метагеномный анализ ампликонов проведен для 2 образцов. Пять образцов из коллекции были подвергнуты молекулярному клонированию и секвенированию по Сэнгеру. Около 2/3 идентифицированных родов сателлитной микробиоты казеом отнесены к грамотрицательным палочкам, и около 1/3 - к грамположительным коккам. Заключение. Микробное обсеменение некротического содержимого туберкулом оценено в 104-108 бактериальных геномов на 1 г. Предполагается, что общее количество микробной ДНК, в том числе микобактериальной, в некротическом содержимом туберкулом не превышает 10% от общего состава.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Орлова Е.А., Огарков О.Б., Суздальницкий А.Е., Хромова П.А., Синьков В.В.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

ANALYSIS OF MICROBIAL DIVERSITY IN THE CASEOUS NECROSIS OF THE TUBERCULOSIS FOCI

Introduction. In this study, new data on the specific microbiota of the tuberculomas caseous foci were obtained. A further understanding of the hypothesis about microbiota, which forms a polymicrobial biofilm, increasing resistance to the anti-TB drugs used in treatment, is formulated. Purpose of the study. Analysis of microbial diversity of caseous necrosis of tuberculous foci by molecular biological methods. Material and methods. Surgical material (388 samples) for 2018-2019 was studied by PCR method (GeneXpert) for the presence of mycobacterial DNA and mutations of rifampicin resistance. Results. According to the results of the GeneXpert study, rifampicin resistance was present in 131 cases (34%), rifampicin sensitivity was found in 222 samples (57%), tuberculosis DNA was not detected in 35 cases (9%). Tuberculomas were in the vast majority of the studied surgical material. Based on the well-known eubacterial primers EUB335L/EUB775R and new TaqMan probes a PCR test was designed. It is appropriate for comparative determination of the concentration of mycobacterial DNA (mbtDNA) in the locus, relative to total eubacterial (eubDNA). The results indicate that the studied microbial communities in tuberculomas foci are divided into at least two types: (i) mycobacterial caseoma (tuberculoma), in which 70% or more of the genomes correspond to MBT; (ii) a polymicrobial community, in which the MBT concentration ranges from 0 to 10%. Metagenomic analysis of amplicons was performed for two samples; five samples from the collection were subjected to molecular cloning and Sanger sequencing. About two-thirds of the identified genera of satellite microbiota caseomas belonged to Gram (-) genera, and nearly one-third ones were Gram (+) cocci. Conclusion. Microbial contents in tuberculomas were estimated at 104-108 bacterial genomes per 1 g. It is assumed that the total amount of microbial DNA, including mycobacterial, in the necrotic content in tuberculomas, does not exceed 10% of the total composition.

Текст научной работы на тему «АНАЛИЗ МИКРОБНОГО РАЗНООБРАЗИЯ КАЗЕОЗНОГО НЕКРОЗА ТУБЕРКУЛЕЗНЫХ ОЧАГОВ»

https://doi.org/10.17116/molgen20213903118

Анализ микробного разнообразия казеозного некроза туберкулезных очагов

© Е.А. ОРЛОВА1, О.Б. ОГАРКОВ1, А.Е. СУЗДАЛЬНИЦКИЙ2, 3, П.А. ХРОМОВА1, В.В. СИНЬКОВ1, А.О. ПЛОТНИКОВ4, Н.Л. БЕЛЬКОВА1, С.Н. ЖДАНОВА1

1ФГБНУ «Научный Центр проблем здоровья семьи и репродукции человека», Иркутск, Россия; 2ОГБУЗ «Иркутская областная клиническая туберкулезная больница», Иркутск, Россия; 3ФГБОУ ВО «Иркутский государственный медицинский университет», Иркутск, Россия;

4ФГБУН «Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УРО РАН, ЦКП «Персистенция микроорганизмов», Оренбург, Россия РЕЗЮМЕ

Введение. В настоящем исследовании получены новые данные о специфической микробиоте казеозного содержимого туберкулезных очагов. Сформулировано новое понимание гипотезы о микробиоте, формирующей полимикробный биофильм, повышающий устойчивость к используемым в лечении противотуберкулезным препаратам.

Цель исследования. Анализ микробного разнообразия казеозного некроза туберкулезных очагов молекулярно-биологи-ческими методами.

Материал и методы. Хирургический материал (388 образцов) за 2018—2019 гг. был исследован ПЦР-методом (GeneXpert) на наличие ДНК микобактерий и мутаций устойчивости к рифампицину.

Результаты. По результатам исследования GeneXpert, устойчивость к рифампицину присутствовала в 131 (34%) случае, чувствительность к рифампицину обнаружена в 222 (57%) образцах, ДНК микобактерий туберкулеза не была обнаружена в 35 (9%) случаях. В подавляющем большинстве случаев исследуемым хирургическим материалом были туберкуломы. На основе известных эубактериальных праймеров EUB335L/EUB775R и разработанных самостоятельно TaqMan зондов, создан ПЦР тест. Он пригоден для сравнительного определения концентрации микобактериальной ДНК (мбтДНК) в очаге относительно тотальной эубактериальной (эубДНК). Полученные результаты свидетельствуют, что исследуемые сообщества микроорганизмов в туберкулезных очагах делятся как минимум на 2 типа: (i) микобактериальная казеома (туберкуло-ма), в которой 70% геномов и более соответствует микобактериям туберкулеза; (ii) полимикробное сообщество, в котором концентрация микобактерий туберкулеза варьирует от 0 до 10%. Метагеномный анализ ампликонов проведен для 2 образцов. Пять образцов из коллекции были подвергнуты молекулярному клонированию и секвенированию по Сэнгеру. Около 2/3 идентифицированных родов сателлитной микробиоты казеом отнесены к грамотрицательным палочкам, и около 1/3 — к грамположительным коккам.

Заключение. Микробное обсеменение некротического содержимого туберкулом оценено в 104—108 бактериальных геномов на 1 г. Предполагается, что общее количество микробной ДНК, в том числе микобактериальной, в некротическом содержимом туберкулом не превышает 10% от общего состава.

Ключевые слова: M. tuberculosis, микробиом казеозного очага.

ИНФОРМАЦИЯ ОБ АВТОРАХ:

Орлова Е.А. — https://orcid.org/0000-0003-2169-0242

Огарков О.Б. — https://orcid.org/0000-0002-3168-1983; e-mail: obogarkov@mail.ru

Суздальницкий А.Е. — https://orcid.org.0000-0002-5132-5417

Хромова П.А. — https://orcid.org/0000-0002-6449-5060

Синьков В.В. — https://orcid.org/0000-0003-3396-9590

Плотников А.О. — https://orcid.org/0000-0001-6830-4068

Белькова Н.Л. — https://orcid.org/0000-0001-9720-068X

Жданова С.Н. — https://orcid.org/0000-0001-7160-9700

Автор, ответственный за переписку: Огарков О.Б. — e-mail: obogarkov@mail.ru КАК ЦИТИРОВАТЬ:

Орлова Е.А., Огарков О.Б., Суздальницкий А.Е., Хромова П.А., Синьков В.В., Плотников А.О., Белькова Н.Л., Жданова С.Н. Анализ микробного разнообразия казеозного некроза туберкулезных очагов. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2021;39(3):18-24. https://doi.org/10.17116/molgen20213903118

Analysis of microbial diversity in the caseous necrosis of the tuberculosis foci

© E.A. ORLOVA1, O.B. OGARKOV1, A.E. SUZDALNITSKIY2,3, P.A. KHROMOVA1, V.V. SINKOV1, A.O. PLOTNIKOV4, N.L. BELKOVA1, S.N. ZHDANOVA1

1 Scientific Centre «Family Health and Human Reproduction Problems», Irkutsk, Russia;

2Irkutsk Regional TB-prevention Hospital, Irkutsk, Russia;

3Irkutsk State Medical University, Irkutsk, Russia;

4Institute for Cellular and Intracellular Symbiosis, Ural Branch of Russian Academy of Sciences, Center of Shared Scientific Equipment «Per-

sistence of microorganisms», Orenburg, Russia

ABSTRACT

Introduction. In this study, new data on the specific microbiota of the tuberculomas caseous foci were obtained. A further understanding of the hypothesis about microbiota, which forms a polymicrobial biofilm, increasing resistance to the anti-TB drugs used in treatment, is formulated.

Purpose of the study. Analysis of microbial diversity of caseous necrosis of tuberculous foci by molecular biological methods. Material and methods. Surgical material (388 samples) for 2018—2019 was studied by PCR method (GeneXpert) for the presence of mycobacterial DNA and mutations of rifampicin resistance.

Results. According to the results of the GeneXpert study, rifampicin resistance was present in 131 cases (34%), rifampicin sensitivity was found in 222 samples (57%), tuberculosis DNA was not detected in 35 cases (9%). Tuberculomas were in the vast majority of the studied surgical material. Based on the well-known eubacterial primers EUB335L/EUB775R and new TaqMan probes a PCR test was designed. It is appropriate for comparative determination of the concentration of mycobacterial DNA (mbtDNA) in the locus, relative to total eubacterial (eubDNA). The results indicate that the studied microbial communities in tuberculomas foci are divided into at least two types: (i) mycobacterial caseoma (tuberculoma), in which 70% or more of the genomes correspond to MBT; (ii) a polymicrobial community, in which the MBT concentration ranges from 0 to 10%. Metagenomic analysis of amplicons was performed for two samples; five samples from the collection were subjected to molecular cloning and Sanger sequencing. About two-thirds of the identified genera of satellite microbiota caseomas belonged to Gram (-) genera, and nearly one-third ones were Gram (+) cocci.

Conclusion. Microbial contents in tuberculomas were estimated at 104—108 bacterial genomes per 1 g. It is assumed that the total amount of microbial DNA, including mycobacterial, in the necrotic content in tuberculomas, does not exceed 10% of the total composition.

Key words: M. tuberculosis, microbiome of caseous foci.

INFORMATION ABOUT THE AUTHORS: Orlova E.A. — https://orcid.org/0000-0003-2169-0242

Ogarkov O.B. — https://orcid.org/0000-0002-3168-1983; e-mail: obogarkov@mail.ru

Suzdalnitskiy A.E. — https://orcid.org.0000-0002-5132-5417

Khromova P.A. — https://orcid.org/0000-0002-6449-5060

Sinkov V.V. — https://orcid.org/0000-0003-3396-9590

Plotnikov A.O. — https://orcid.org/0000-0001-6830-4068

Belkova N.L. — https://orcid.org/0000-0001-9720-068X

Zhdanova S.N. — https://orcid.org/0000-0001-7160-9700

Corresponding author: Ogarkov O.B. — e-mail: obogarkov@mail.ru

TO CITE THIS ARTICLE:

Orlova EA, Ogarkov OB, Suzdalnitskiy AE, Khromova PA, Sinkov VV, Plotnikov AO, Belkova NL, Zhdanova SN. Analysis of microbial diversity in the caseous necrosis of the tuberculosis foci. Molekulyarnaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya (Molecular Genetics, Microbiology and Virology). 2021;39(3):18-24. (In Russ.). https://doi.org/10.17116/molgen20213903118

По оценкам ВОЗ, в 2018 г. во всем мире туберкулезом заболели 10 млн человек (диапазон значений 9,0—11,1 млн), и этот параметр в последнее время остается на стабильном уровне [1]. Несмотря на очевидные различия в вирулентности и трансмиссив-ности отдельных генотипов [2, 3], патогенез туберкулеза, особенно на поздних стадиях, по-прежнему остается малоизученным. Ранее нами было высказано предположение о том, что в процессе многомесячного лечения в казеозном содержимом туберкулезных очагов может развиваться специфическая микробиота, формирующая полимикробный биофильм (БФ), устойчивый к проводимой противотуберкулезной терапии и способствующий выживанию возбудителя [4]. Проведенные нами исследования свидетельствуют, что клинические штаммы туберкулеза исключительно редко способны к продукции поверхностных гидрофобных БФ [5], несмотря на то, что это достаточно хорошо описанное явление [6]. Однако модельные эксперименты на лабораторных животных не подтверждают наличие в очагах туберкулеза очевидных БФ [7], авторы описывают только микроскопические БФ-подобные структуры [7]. В предыдущем исследовании мы обнаружи-

ли, что от одного и того же больного могут выделяться штаммы, как неспособные к продукции БФ (мокрота), так и активно продуцирующие БФ (загру-динный холодный абсцесс) на жидкой питательной среде [4]. По всей видимости, таким медленно растущим микроорганизмам, как Mycobacterium tuberculosis, в условиях роста в верхних дыхательных путях достаточно затруднительно продуцировать БФ, в то же время условия роста в стерильных условиях загрудинного абсцесса, вызванного гематогенным заносом, могут быть более благоприятными для продукции БФ in vivo. Вполне возможно, что во многих случаях длительная персистенция туберкулеза в легких сопровождается формированием в очаге туберкулеза полимикробного БФ, как это было показано нами в модельном эксперименте [5]. Целью настоящего исследования являлся анализ микробного разнообразия казеозного некроза туберкулезных очагов молекулярно-биологическими методами.

Материал и методы

Соблюдение этических норм. Настоящее исследование одобрено Этическим комитетом ФГБНУ

Последовательность 5'—>3' Длина, ПЦР пн Отжиг

TCCTACGGGAGGCAGCAGT 437 бГ"

ACTACCAGGGTATCTAATCCT 62

[R6G]-TGCCAGCAGCCGCG[G-LNA]TAATAC-[BHQ1] 72

[FAM]-GAAGGTCCGGGTTCTCTC[G-LNA]GA-[BHQ1] 72

CGTGCCAGCAGCCGCGGTAA 472 58 CCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGC

Таблица 1. Список использованных праймеров и зондов

Праймеры/зонды EUB338Fmod EUB775Rmod EUB500prob MBTprobI EUB500F EUB1000R

Рис. 1. Калибровочная кривая, использованная для получения эмпирической формулы расчета отношения порогового значения Ct к десятичному логарифму количества геном-эквивалентов исследуемых бактерий.

«НЦ ПЗСРЧ». Исследуемый материал в подавляющем большинстве представлял иссеченные туберку-ломы. Для исключения избирательного размножения микрофлоры 12 биопсийных образцов собраны непосредственно после операции хирургом. Образцы в количестве 1—3 г материала помещались в пробирки с двумя объемами концентрата DNA/RNA Shield (2X concentrate, «Zymo Research»), в ряде случаев биопсийный материал собирали, как описано ранее, в 1% раствор CTAB в 50% изопропиловом спирте [8].

Выделение геномной ДНК из биоптатов. Экстракцию ДНК штаммов микобактерий туберкулеза (МБТ) проводили из образцов, фиксированных вышеназванными способами, из 100 мг нерастворимого субстрата. Для уменьшения влияния ингибиторов ПЦР проводили предварительную обработку образцов протеиназой K («AppliChem») и хлороформом, как описано ранее [4]. ДНК выделяли набором DNeasy Blood&Tissue Kits («Qiagen»).

ПЦР проводили в варианте с детекцией электрофорезом или с детекцией в реальном времени (ПЦР-РВ) на амплификаторе CFX-96 («БиоРад»). Олигону-клеотидные праймеры разработаны на основе известных структур (табл. 1) [9], зонды сконструированы в рамках данного исследования. Праймеры и зонды

синтезированы в НПФ «Синтол» и ЗАО «Евроген». Амплификацию для молекулярного клонирования вели на паре консервативных бактериальных прайме-ров EUB500F/EUB1000R для гена 16S рРНК. Целевой ампликон очищали и концентрировали с помощью набора Cleanup Mini (ЗАО «Евроген»). Молекулярное клонирование ПЦР продуктов проводили с помощью набора CloneJET™ PCR Cloning Kit («Thermo Scientific», США). Подготовку компетентных клеток и трансформацию проводили, используя стандартные методики [10]. Секвенирование по Сэнгеру выполняли в ЗАО «Евроген».

ПЦР с эубактериальными праймерами и TaqMan зондами (см. табл. 1) проводили в течение 40 циклов с AmpliTaq Gold 360 Master Mix («Applied Biosystems») в присутствии 1х раствора энхансера из того же набора на амплификаторе CFX-96 («Biorad»). Режим амплификации: 95° — 10 мин, активация полимеразы; 95° — 40 с; 56° — 10 с; 72° — 40 с. Ключевым вопросом этого раздела исследования стало достижение нулевого фона в отрицательном контроле на протяжении 40 циклов амплификации. Эта задача была достигнута применением AmpliTaq Gold 360 («Applied Biosystems») полимеразы и использованием других реактивов и воды максимальной чистоты.

Расчет общего количества эубактериальной ДНК (эубДНК) и количества микобактериальной ДНК (мбтДНК) в очаге выполняли по формуле y= —0,3065x+7,1774, полученной эмпирически по калибровочной кривой (рис. 1). В качестве стандартной матрицы использовалась ДНК штамма M. tuberculosis с известной концентрацией, как это было описано ранее [5].

Для полногеномного секвенирования (NGS) библиотека генов 16S рРНК подготовлена с помощью наборов Nextera DNA Flex Library Prep («NEB») и GS Júnior («Roche») в соответствии с рекомендациями производителей. Контроль качества ампликоновых библиотек проводили с помощью электрофореза. Высокопроизводительное секвенирование проведено на платформах Miseq («Illumina») и 454 GS Júnior («Roche»). Результаты секвенирования в виде стандартных файлов коротких прочтений (fastq формат) депонированы в базу данных NCBI, биопроект PRJNA609038 [11]. Для обработки метагеномных библиотек использовались алгоритмы платформы QIIME2 2019.4 [12].

Таблица 2. Сравнение количества геном-эквивалентов микобактерий в 1 г некротического содержимого туберкулезного очага относительно общего количества эубактериальной ДНК

№образца Количество геном-эквивалентов микобактериальной ДНК на 1 г некротического содержимого Количество геном-эквивалентов тотальной эубактери-альной ДНК на 1 г некротического содержимого

1 1,2105 1,2-105

2 2,8-108 2,8-108

3 0,0 1,1105

4 0,0 2,7-107

5 3,2-103 2,8-106

6 6,1-103 1,0105

7 0,0 1,0105

8 3,3-104 3,3-104

9 8,5-105 8,5-105

10 2,3-103 2,4105

11 2,8-103 5,4-104

12 1,0-106 1,0106

Качество последовательностей проверялось с помощью FastQC 0.11.8 [13].

Результаты и обсуждение

Исходной причиной, послужившей отправной точкой представленной работы, стал ретроспективный анализ клинических ПЦР-исследований хирургического материала, выполненных в Иркутской областной клинической туберкулезной больнице. В течение 2018—2019 гг. 388 образцов хирургического материала были исследованы ПЦР-методом (GeneXpert) на наличие ДНК МБТ и мутаций устойчивости к рифампицину. По результатам исследования GeneXpert, в 222 (57%) образцах не обнаружено устойчивости к рифампицину, в 131 (34%) случае устойчивость присутствовала, в 35 (9%) случаях ДНК МБТ не была обнаружена. Исследуемый материал в подавляющем большинстве представлял собой иссеченные туберкуломы.

Здоровые легкие исторически считались стерильными, однако за последнее десятилетие эта концепция изменилась. В здоровых легких человека описано достаточно разнообразное бактериальное сообщество [14, 15]. По всей видимости, присутствие небольшого количества бактерий в легких является признаком хорошего здоровья [16]. Большинство бактерий в нижних отделах легких происходит из верхних дыхательных путей и ротовой полости [17]. Вопрос о том, является ли колонизация легких бактериями стабильной и/или транзитор-ной, остается открытым до настоящего времени [16]. Во многом остаются неизвестными состав и роль ми-кробиоты легких. Известно, что микробиота легких имеет низкую плотность, 103—105 колониеобразую-щих единицы на 1 г ткани легких (КОЕ/г), как было показано в модельных экспериментах [18]. Легкие человека содержат около 2,2х103 бактериальных геномов на 1 см2 поверхности [19]. Плотность микробной популяции в легких значительно меньше,

чем плотность микробиоты толстой кишки, которая демонстрирует наиболее густонаселенный микробный пейзаж в организме человека, с общей численностью до 1011 КОЕ/г [14]. Популяция микроорганизмов в легких значимо не отличается количественно от популяции двенадцатиперстной кишки — около 104 микробов на 1 мл содержимого [20].

В табл. 2 приведены сравнительные оценки концентрации ДНК M. tuberculosis относительно общего бактериального обсеменения. Следует отметить, что в образцах 3, 4 и 7 не обнаружена ДНК M. tuberculosis, в образцах 5, 6, 10, 11 количество микобакте-риальной ДНК колеблется от 0,1 до 10% относительно общего количества бактериальных геномов. «Истинными» очагами туберкулезного некроза можно считать только образцы 1, 2, 8, 9 и 12. Другими словами, микробиота >'/2 из 12 исследуемых образцов состояла в 90% случаев из микроорганизмов, отличных от этиологического агента, вызвавшего образование туберкулезного очага. Широкое распространение крайне низких (10% и менее) концентраций ДНК возбудителя туберкулеза в очаге явилось достаточно неожиданным результатом для самих авторов исследования.

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что патологические процессы, вызванные M. tuberculosis, как и ряд других (бронхиальная астма, муковисцидоз) [16], драматически изменяют го-меостаз глубоких отделов респираторного тракта, в результате чего возможности к размножению микроорганизмов в легких (в первую очередь патологической микробиоты, включая МБТ) значимо возрастают. Можно предполагать, что исследуемые бактериальные сообщества в туберкулезных очагах делятся как минимум на 2 типа: 1) микобактериальная ка-зеома (туберкулома), в которой 70% геномов и более соответствуют МБТ; 2) полимикробное сообщество, в котором концентрация МБТ колеблется от 0 до 10%. Мы можем предположить, что туберку-ломы с малым количеством МБТ и большим разно-

Таблица 3. Таксономическая идентификация фрагментов гена 168 рРНК, полученных по результатам молекулярного клонирования и секвенирования по Сэнгеру, 5 образцов из некротических очагов больных туберкулезом

Грам(+)/ Грам(-) Тип/класс Семейство/Род Образец 1 Образец 2 Образец 3 Образец 4 Образец 5

Грам(+) Firmicutes/BaciUi Streptococcaceae/ Streptococcus 5/9 — — — —

Грам(+) Firmicutes/Negativicutes Veillonellaceae/ Veillonella 2/9 — — — —

Грам(+) Firmicutes/Bacilli Bacillales/ Gemella 1/9 — — — —

Грам(+) Actinobacteria/Actinobacteria Micrococcaceae/Rothia 1/9 — — — —

Грам(+) Actinobacteria/Actinobacteria Mycobacteriaceae/Mycobacterium (МБТ) — 5/9 — — —

Грам(+) Actinobacteria/Streptomycetales Streptomycetaceae/Streptomyces — 1/9 — — —

Грам(-) Proteobacteria/Betaproteobacteria Comamonadaceae/Pelomonas — 1/9 — — —

Грам(-) Alphaproteobacteria/Rhizobiales Hyphomicrobiaceae/Pedomicrobium — 1/9 — — —

Грам(-) Alphaproteobacteria/Sphingo-monadales Sphingomonadaceae/Sphingomonas — 1/9 — — —

Грам(-) Gammaproteobacteria/Pseudomo-nadales Pseudomonadaceae/Pseudomonas — — 4/10 — —

Грам(-) Alphaproteobacteria/Caulobacte-rales Alphaproteobacteria/Rhizobiales Caulobacteraceae/Brevundimonas — — 1/10 — —

Грам(-) Methylobacteriaceae/Methylobacte-rium Burkholderiaceae/Ralstonia — — 1/10 — —

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Грам(-) Betaproteobacteria/Burkholderiales — — 1/10 — —

Грам(-) Alphaproteobacteria/Sphingo-monadales Sphingomonadaceae/Sphingomonas — — 1/10 — —

Грам(-) Betaproteobacteria/Rhodocyclales Azonexaceae/Dechloromonas — — 1/10 — —

Грам(+) Actinobacteria/Micrococcales Brevibacteriaceae/Brevibacterium — — 1/10 — —

Грам(-) Alphaproteobacteria/Caulobacte-rales Caulobacteraceae/ Brevundimonas — — — 2/5 —

Грам(-) Proteobacteria/Betaproteobacteria Comamonadaceae/Pelomonas — — — 2/5 —

Грам(-) Alphaproteobacteria/Rhizobiales Brucellaceae/ Ochrobactrum — — — 1/5 —

Грам(-) Alphaproteobacteria/Caulobacte-rales Caulobacteraceae/Brevundimonas — — — — 3/6

Грам(-) Betaproteobacteria/Burkholderiales Burkholderiaceae/Ralstonia — — — — 1/6

Грам(+) Actinobacteria/Propionibacteriales Nocardioidaceae/Nocardioides — — — — 1/6

Грам(-) Gammaproteobacteria/Enterobac- Enterobacteriaceae/Enterobacter — — — — 1/6

1ега1еа

Примечание. Полужирным шрифтом выделены мажерные таксоны (преобладающие в образце).

образием сателлитной микробиоты могут отличаться более благоприятным течением и таких больных легче вылечить. В то же время нами обнаружена относительно небольшая концентрация бактериальных геномов в туберкулезных очагах (около 106 геном-эквивалентов на 1 г некротического содержимого туберкуломы). По всей видимости, основную массу казеозного содержимого исследуемых туберкулезных очагов составляли отмершие ткани легкого, а не распространенный полимикробный БФ, как ожидалось нами ранее [4]. При этом нельзя исключать, что в процессе формирования и успешной терапии туберкуломы в ходе организации казеозного некроза может происходить ряд процессов, сходных с сукцессией, наблюдаемых в природных микробных сообществах, т.е. последовательная смена состава микробного консорциума, вызванная изменениями в условиях существования, питающем субстрате и присутствием или отсутствием антибиотиков.

В табл. 3 приведены результаты секвенирования по Сэнгеру 39 клонов, полученных при молекуляр-

ном клонировании ампликонов фрагмента гена 16Б рРНК. ДНК выделена из 5 образцов некротического содержимого. Ограничением данного раздела исследования является то, что проанализированные пять образцов не совпадают с образцами из табл. 2. В силу утраты исходного материала (казеозного содержимого) проведение количественной оценки мбтДНК и эубДНК было невозможно. Как видно из табл. 3, около 2/3 идентифицированных родов сателлитной микробиоты казеом относились к грамотрицатель-ным палочкам и около 1/3 — к грамположительным коккам. Можно предполагать, что образец 2 (см. табл. 3) принадлежал к «истинным» микобактери-альным туберкуломам, в то время как в составе 4 других образцов обнаружено достаточно широкое микробное разнообразие.

Две случайным образом выбранные туберкуломы были подвергнуты N08 исследованию. Следует отметить, что эти образцы также отличны от всех описанных ранее. Основной причиной отсутствия взаимосвязи между разделами настоящего исследования

Рис. 2. Результаты метагеномного анализа ампликонов гена 16S рРНК содержимого двух туберкулом.

На диаграмме слева видно, что в составе микробиоты казеозного очага преобладали бактерии рода Staphylococcus, что значимо отличает ее от микробиоты казеозного очага справа, где доминирующим таксоном является род Mycobacterium.

стали большие затруднения, связанные с получением ампликонов гена 16S рРНК, в том числе для метагеномного NGS исследования. Эти затруднения, по всей видимости, связаны с присутствием высоких концентраций ПЦР ингибиторов в казеозном содержимом. В итоге авторам исследования удалось получить стабильно воспроизводящиеся результаты с использованием AmpliTaq Gold 360 Master Mix («Applied Biosystems»), описанные в первом разделе. На рис. 2 приведены результаты метагеномного анализа ампликоновых библиотек, полученных методом NGS для содержимого двух туберкулом. Если в одном случае преобладающим таксоном являются ми-кобактерии (см. рис. 2, справа), то во втором — представители рода стафилококков. Помимо микобак-терий, единственным общим таксоном, минорным в обоих случаях, являются анаэробные пропионово-кислые бактерии.

Заключение

В общей сложности в рамках представленного исследования изучены 19 образцов казеозного содержимого туберкулом легких. Несмотря на различия в примененных подходах, можно однозначно сделать выводы о том, что существует значительное количество случаев, когда оперируемые туберкуломы имеют относительно небольшую концентрацию микобакте-рий — 10% и менее. В настоящий момент это невозможно предсказать до проведения хирургического лечения. Подавляющее большинство случаев тубер-

кулеза легких, описанных в исследовании, было диагностировано с помощью рентгенологического исследования, а больные не имели бактериовыделения в окружающую среду. Нерешенным остался вопрос, является ли наблюдаемое различие в концентрации микобактерий внутри туберкулезного очага динамическим или статичным. Другими словами, происходит ли рост или снижение количества микобактерий по отношению к сателлитной микробиоте в процессе лечения при росте или регрессии туберкуломы. Следует также отметить, что полученные нами количественные оценки общего количества бактериальной ДНК на порядок и более ниже ожидаемой концентрации (109), полученной нами в модельных экспериментах [5]. При этом количество микобактериаль-ной ДНК было сравнимо или превышало количество, полученное в модели полимикробного БФ in vitro [5]. По всей видимости, на ранних этапах формирования хронического туберкулезного очага (туберкуло-ма) возникающий полимикробный БФ представлен микроскопическими образованиями, подобно описанным некротическим кластерам в модельном эксперименте на морских свинках [7].

Финансирование. Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект 20-015-00078А).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES

1. World Health Organization. Global tuberculosis report 2019. World Health Organization, Geneva; 2019.

https://www.who.int/tb/publications/global_report/en/

2. Синьков В.В., Савилов Е.Д., Огарков О.Б. Эпидемиология туберкулеза в России: эпидемиологические и исторические доказательства в пользу сценария распространения «Пекинского» генотипа M. tuberculosis в XX веке. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2010;6(55):23-28. Sinkov VV, Savilov ED, Ogarkov OB. Epidemiology of Tuberculosis in Russia: Epidemiological and Historical Evidences in Favor of the Scenario Distribution of Beijing Genotype M. tuberculosis in the XX Century. Epidemiology and Vaccinal Prevention. 2010;6(55):23-28. (In Russ.). https://elibrary.ru/download/elibrary_15541894_96495034.pdf

3. Синьков В.В., Савилов Е.Д., Огарков О.Б. Реконструкция эпидемической истории «Пекинского» генотипа Mycobacterium tuberculosis в России и странах бывшего СССР по результатам сполиготипирования. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2011;26(3):120-125.

Sinkov VV, Savilov ED, Ogarkov OB. Reconstruction of the epidemic history of the Beijing genotype of Mycobacterium tuberculosis in Russia and former Soviet countries using spoligotyping. Molecular Genetics, Microbiology and Virology. 2011;26(3):120-125. (In Russ.). https://doi.org/10.3103/S0891416811030050

4. Огарков О.Б., Суздальницкий А.Е., Хромова П.А., Цыренова Т.А., Сокольникова Н.А., Жданова С.Н. и др. Продукция биофильмов клиническими штаммами возбудителя туберкулеза. Инфекция и иммунитет. 2018;8(4):435-440.

Ogarkov OB, Suzdalnitsky AE, Khromova PA, Tsyrenova TA, Sokolniko-va NA, Zhdanova SN i dr. Biofilm formation induced by clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis. Russian Journal of Infection and Immunity. 2018;8(4):435-440. (In Russ.). https://doi.org/10.15789/2220-7619-2018-4-435-440

5. Огарков О.Б., Бадлеева М.В., Белькова Н.Л., Адельшин Р.В., Цыренова Т.А., Хромова П.А., и др. Феномен образования биопленок штаммами Brevibacillus spp. и Bacillus spp. в присутствии клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2017;35(3):98-103.

Ogarkov OB, Badleeva MV, Belkova NL, Adelshin RV, Tsyrenova TA, Khromova PA i dr. The phenomenon of the formation of biofilms by Brevibacillus spp. and Bacillus spp. in the presence of clinical strains of Mycobacterium tuberculosis. Molecular Genetics, Microbiology and Virology. 2017;35(3):98-103. (In Russ.).

https://doi.org/10.3103/S0891416817030065

6. Ojha AK, Baughn AD, Sambandan D, Hsu T, Trivelli X, Guerardel Y et al. Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria. Mol Microbiol. 2008;69:164-174. https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.2008.06274.x

7. Orme IM. A new unifying theory of the pathogenesis of tuberculosis. Tuberculosis (Edinb). 2014;94(1):8-14. https://doi.org/10.1016/j.tube.2013.07.004

8. Ogarkov O, Mokrousov I, Sinkov V, Zhdanova S, Antipina S, Savilov E 'Lethal' combination of Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype and human CD209 -336G allele in Russian male population. Infect Genet Evol. 2012;12(4):732-736.

https://doi.org/10.1016/j.meegid.2011.10.005

9. Wallner G, Amann R, Beisker W. Optimizing fluorescent in situ hybridization with rRNA-targeted oligonucleotide probes for flow cytometric identification of microorganisms. Cytometry. 1993;14(2):136-143.

10. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989. https://doi.org/10.1016/0092-8674(90)90210-6

11. PRJNA609038 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/study/?acc=PR-JNA609038&o=acc_s%3Aa

12. Bolyen E, Rideout JR, Dillon MR, Bokulich NA, Abnet CC, Al-Ghalith GA et al. Reproducible, interactive, scalable, and extensible microbiome data science using QIIME 2. Nat Biotechnol. 2019;37(8):852-857. https://doi.org/10.1038/s41587-019-0209-9

13. FastQC 0.11.8 https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/

14. Charlson ES, Bittinger K, Haas AR, Fitzgerald AS, Frank I, Yadav A. Topographical continuity of bacterial populations in the healthy human respiratory tract. Am JRespir Crit Care Med. 2011;184:957-963. https://doi.org/10.1164/rccm.201104-0655OC

15. Erb-Downward JR, Thompson DL, Han MK, Freeman CM, McCloskey L, Schmidt LA, et al. Analysis of the lung microbiome in the «healthy» smoker and in COPD. PLoS One. 2011;22;6(2):e16384. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0016384

16. Mathieu E, Escribano-Vazquez U, Descamps D, Cherbuy C, Langella P, Riffault S, et al. Paradigms of Lung Microbiota Functions in Health and Disease, Particularly, in Asthma. Front Physiol. 2018;21(9):1168. https://doi.org/10.3389/fphys.2018.01168

17. Bassis CM, Erb-Downward JR, Dickson RP, Freeman CM, Schmidt TM, Young VB, et al. Analysis of the upper respiratory tract microbiotas as the source of the lung and gastric microbiotas in healthy individuals. mBio. 2015;6(2):e00037.

https://doi.org/10.1128/mBio.00037-15

18. Remot A, Descamps D, Noordine ML, Boukadiri A, Mathieu E, Robert V et al. Bacteria isolated from lung modulate asthma susceptibility in mice. ISME J. 2017;11(5):1061-1074. https://doi.org/10.1038/ismej.2016.181

19. Hilty M, Burke C, Pedro H, Cardenas P, Bush A, Bossley C, et al. Disordered microbial communities in asthmatic airways. PLoS One. 2010;5(1):e8578. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0008578

20. Aron-Wisnewsky J, Doré J, Clement K. The importance of the gut micro-biota after bariatric surgery. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2012;9(10):590-598.

https://doi.org/10.1038/nrgastro.2012.161

Поступила в редакцию 09.04.2020 Received 09.04.2020 После доработки 22.05.2020 Revised 22.05.2020 Принята к публикации 29.05.2020 Accepted 29.05.2020

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.