CC BY
59
УДК 619 : 616.98:579.84:636.95(078)
Яненко У. М., к.вет.н., ст. науковий ствроб1тник © Яненко В. М., науковий сшвроб1тник 1нститут ветеринарногмедициниНААН, м. Кигв
АНАЛ13 МЕТОД1В Д1АГНОСТИКИ ПАСТЕРЕЛЬОЗУ ВЕЛИКО! Р0ГАТ01ХУДОБИ I СВИНЕЙ
У статт1 висвтлеш методы д1агностики пастерел тд велико! рогато! худоби I свиней при бронхопневмотях та тфекщиному атроф1чному ришт1, також дослгдження патолог1чного матер1алу в/д вимушено забитих / загиблих тварин з попередтм Ыагнозом - бронхопнеемошя. Провели пор1вняння м1ж ПЛР, 1ФА / класичними бактерюлог1чними дослгдженнями по /золяцп Р. тикера в1д стъсъкогосподарсъких тварин.
Ключое1 слова: пастерелъоз, д1агностика, пол1меразна ланцюгова реакц1я, гмуноферментнии анал1з, бактерюлог1чш дослгдження, серовари, штам.
У структур! шфекцшних хвороб пастерельоз тварин в Укра!ш до 2000 року посщав п'яте мкце теля кол1бактерюзу, дизентери, сальмонельозу, бешихи. У перюд 2005-2011 рр. пастерельоз часто супроводжуе ресшраторш хвороби I займае серед шфекцшних захворювань трете м1сце.
Лабораторна д1агностика пастерельозу сшьськогосподарських тварин на даний момент е досить складною через те, що як моношфекщя не рееструеться на територп Украши I вш переб1гае в асощацп з шшими збудниками. Пастерельозна шфекщя часто перебшае в асощацп з шфекцшним ринотрахе!том ВРХ, класичною чумою свиней, цирков1русною шфекщею другого типу (РЯОС 2), репродуктивно-ресшраторним синдромом свиней (РЛК£), мшоплазмозами ВРХ 1 свиней, бордетельозом. Хвороби змшано! етюлоги зумовлюють непередбачувану загибель сшьськогосподарських тварин. Частота видшення пастерел вщ тварин, яю мають ктшчш ознаки пневмонш, досягае 75-87 % [1, 2, 3, 4].
Сдиним поширеним методом лабораторно! д1агностики пастерельозу тварин е бактерюлопчний метод. На жаль, ус1 щ дослщження досить гром1здк1 та тривал1 [5,6].
Лабораторна д1агностика шфекцшних захворювань сшьськогосподарсь-ких тварин I людини поповнюеться сучасними методами, такими як ¿муно-ферментний анал1з (1ФА) та пол1меразна ланцюгова реакщя (ПЛР), проте щ методи ще не набули широкого застосування в Украшг Необхщно враховувати, що головним аспектом серед заход1в боротьби пастерельозу е своечасна д1агностика та виявлення тварин-пастерелоносив.
© Яненко У. М., Яненко В. М., 2012
397
Мета - пор1вняння метод1в ¿золяци збудника пастерельозу велико! рогато! худоби i свиней та впровадження !х у схему оздоровчо-профшактичних заход1в проти пастерельозно! шфекци.
Матер1али та методи.
У робот! використовували клшжо-ешзоотолопчш бактерюлопчш, серолопчш (РА, РНГА та 1ФА), молекулярно-генетичш (ПЛР) та статистичш методи Microsoft Excel.
Робота виконувалась протягом 1997-2010 рр. у лаборатори ветеринарно-caHiTapHoi' експертизи 1нституту ветеринарно! медицини НААН, лаборатори бaктepioлoгii Центрально! державно! лаборатори ветеринарно! медицини, в лаборатори молекулярно! д!агностики i 1ФА ДНК1БШМ, м. Киева.
Для проведения наукових дocлiджeнь були використаш референтш та eni300TH4Hi штами иастерел.
Для д!агностики пастерельозу в ПЛР нами були проведет дослщження ¿з розробленими парами праймер1в: для P. multocida серовару А CAPA-FWD CAPA-REV; для серовару В CAPB-FWD CAPD -REV; для серовару D CAPD-FWD CAPD-REV, також спшьну пару праймер1в, що кодуе рщ P. multocida КМТ-1. ПЛР проводили в три основш етапи: вид1лення ДНК i3 6ionpo6n, безпосередньо ПЛР (ампл!ф!кацй') та реестраци результат1в за допомогою електрофорезу.
Бактер!олог1чн1 досл1дження проводили зг1дно з "Настановою з лабораторно! д1агностики пастерельоз1в тварин та птиц1" [7] i включали в себе м1кроскоп1ю мазк1в та мазк1в-в!дбитк1в ¿з патолог1чного матер1алу, культуральн1 (пасажування вид1лених культур на поживних середовищах (4-5 раз1в)) та вивчення 6ioxiMi4HHx властивостей, трипанофлав1нова проба, бюпроби та cepoTHni3an;ii на бших мишах (за Картером).
Проводили непрямий вар1ант твердофазного 1ФА з використанням набору д1агностикум1в. Застосовувалась тест-система НД1 еп1дем!олог1! та м1кроб!олог1! ¿м. М. Ф. Гамале! (Рос1я), де використовуються ¿муноглобул1ни проти IgG тварин, м1чеш пероксидазою. Фон, або р1вень порогу, вище якого сироватку оц1нювали як позитивну для P. multocida, становив 575 (Каширин В. В., 1989).
Реакцш аглютинац1! (РА) та реакцш непрямо! гемаглютинац1! (РНГА) ставили з метою виявлення антит1л до пастерельозного антигену в сироватц1 кров! телят i свиней. Використовували антиген, який виготовляли з референтних музейних штам!в P. multocida, одержаних ¿з ВДНК1 ветпрепарат!в МСГ РФ. Проводили гшер!мушзащю крол!в референтними штамами P. multocida трьох серовар!в: А, В i D, для одержання специф!чних сироваток для постановки РНГА.
Результата досл1джень. При виконанш роботи нами були дослщжеш тваринницьк! господарства р!зних областей Украши, як! вважались благополучними щодо пастерельозно! шфекцп. Але в них рееструються захворювання орган!в дихання як BipycHo!, так i бактер!ально! ет!олог!! (парагрип-3, респ!раторна форма хвороби AyecKi, шфекцшний в!русний
398
ринотрахе!т (IBP), цирков1русна шфекщя, мжоплазмоз, гемофшьоз, бордетельоз, шфекцшний атроф1чний ришт (IAP), легеневий прояв хламщюзу тощо).
У ход! нашо! багатор1чно! роботи пастерели видшялись вщ свиней з ознаками шфекцшного атроф1чного ришту, вщ ВРХ за бронхопневмонш, бурситах та абортах
Виявлення P. multocida у свиней з ознаками шфекцшного атроф1чного рин1ту. 3 метою шдикаци P. multocida з трьох господарств було в1д1брано зразки слизу hocoboi иорожнини та ироби з мигдалиюв (заглоткових) в1д загиблих та вимушено забитих свиней, хворих на шфекцшний атроф1чний рин1т (IAP) (по 30 проб кожного дослщженого матер1алу).
Рис. 1. Стввщношення к1лькост1 P. multocida з мигдалик1в вид1лених в1д загиблих тварин i слизу hocoboi иорожнини вщ хворих на IAP свиней
(1 - КСГАП «Новогригор1вка»; 2 - TOB «Союз»; 3 - TOB «Рута»).
У результат! проведених дослщжень було встановлено, що ¿ндикащя P. multocida з мигдалик1в та 3i слизово! оболонки hocoboi порожнини майже однакова (рис. 2). У КСГАП „Новогригор1вка" пастерелу вид1ляли бактерюлопчними методами з мигдалик1в у 38,0 % випадюв, ¿з слизу hocoboi порожнини - 37,0 % випадюв; у TOB "Союз" пастерелу видшено з мигдалиюв i слизу hocoboi порожнини у 35,0 % випадюв; у СВК "Рута" вщповщно у 27,0 % i 28,0 % випадюв.
Дослщження кров1 свиней (n = 31), хворих на IAP, виявили в ПЛР присутн1сть ДНК P. multocida таких серовар1в: А - 5,7 ± 0,6 (90,12 %) випадюв та D у 6 ± 0,6 (92,6 %) випадюв.
За допомогою 1ФА антитша виявлен1 у 18 випадках (60,0 %), титри проб кров! в 1ФА були до 1 : 460. Отже, у досл!дних зразках концентрац!я антит!л
□ Мигдалики
■ Слиз з носовоТ порожнини
399
була низькою вщносно порогу патогенност1, що пщтверджуе циркуляцш збудника серед сприйнятливих тварин.
Застосування ПЛР для прижиттевого виявлення збудника пастере-льозу ввд велико? рогатоУ худоби. 3 метою виявлення присутност1 збудника пастерельозно! шфекци проводили дослщження проб кров1 вщ 125 гол1в телят з 5 господарств чотирьох областей Украши (Кшвсько!, Микола1всько1, Чершпвсько! та Херсонсько!). Ус1 тварини мали ознаки ресшраторних захворювань р1зного ступеня тяжкост1, тод1 як обстежеш господарства офщшно були благополучними щодо пастерельозу. Результата ПЛР-анал1зу свщчать, що ¿з 125 проб слизу носово1 порожнини були виявлеш у 97 (77,6 %) випадках пастерели, бшьшкть з яких належали до серовару А - 52 (53,6 %) та до серовару Б - 39 (40,2 %) випадк1в (р > 0,005).
3 метою пор1вняння чотирьох метод1в д1агностики пастерельозу було вадбрано 20 проб кров1 вщ телят з СТОВ "Промшь" Арбузинського району Миколшвсько! области Цей матер1ал дослщжено у ПЛР, бактерюлопчним методом, 1ФА , РА 1 РИГА. В результат! отримали таю даш: в 19 (95,0 %) випадках виявлено ДНК-фрагмент Р. тикера за допомогою ПЛР; при бактерюлопчному метод! - 14 випадках (70,0 %), виявлення антитш до Р. тикера в 1ФА - 13 (65,0 %) випадках , а в РА - 10 випадках (50,0 %) 1 РНГА -14 випадках (70,0 %) (рис. 4).
Рис. 2. По|Мвняльна ефектившсть метод1в ¡нднкацп Р. тыкоеМа в пробах кров! телят, хворих на бронхопневмошю.
Дослщженнями кров1 телят (п = 20), хворих на бронхопневмошю, виявили в ПЛР-тест1 присутшсть Р. тикера таких серовар1в: А - 8 (40,0 %) випадюв та Б - 12 (60,0 %) випадюв.
За методом Картера, у хворих телят було визначено Р. тикеЫёа серовару А - у 4 випадках (20,0 %), а серовару Б - у 8 випадках (40,0 %), що свщчить про нижчу чутливють проведено! д1агностики, шж ПЛР. Таким чином, проведения
400
внутршньовидово1 диференщаци серовар1в P. multocida за допомогою ПЛР досить швидке i ефективне.
Застосування методу ПЛР для прижиттевого виявлення збудника пастерельозу вщ свиней, хворих на бронхопневмошю.
Для пор1вняння ефективност1 чотирьох метод1в д1агностики пастерельозу, було ввдбрано 20 проб кров1 вщ поросят на вщгод1вл1 з КСП „Труб1ж" Бариш1вського району Кшвсько1 облает^ хворих на бронхопневмошю (рис.5).
Отримаш результата свщчать, що застосування ПЛР для виявлення ДНК збудника пастерел при ресшраторних захворюваннях у свиней становить 91,0 %, ¿ндикащя бактерш бактерюлопчним методом дослщжень становить - 80,0 %, виявлення антитш в 1ФА - 53,3 % (титри вщ 1 : 128 до 1 : 412), РНГА - 75,0 % та РА - 46,7 % позитивних проб.
При проведенш за допомогою ПЛР внутршньовидово1 диференщаци пастерел, видшених при бронхопневмони свиней, отримали таку картину: до серовару А вщнесено 11 (55,0 %) штам1в, серовару D -9 (45,0 %) i3 загально! к1лькост1 20 штам1в.
Пор1вняння метод1в ¡ндикацй' P. multocida в патолоНчному матер1ал1 ВРХ i свиней. Протягом 2001-2004 pp. провели 248 бактерюлопчних досл1джень патолопчного матер1алу в1д загиблих i вимушено забитих тварин (ВРХ - 104 i свиней - 140 проб) i3 попередшм д1агнозом - ураження орган1в дихання. У цьому pa3i вид1лено 177 культур м1кроорган1зм1в. 3 них до P. multocida вщнесено 62 культури (35,5 %).
Найбшьший в1дсоток пастерел при бактер1олог1чному дослщженш вид1лявся з легень (94,7 %) та л1мфатичних вузл1в (38,8 %) (шдщелепових,
заглоткових, бронх1альних, середост1нних), рщше - з серця i печшки (22,3 - 23,0 %).
При дослщженш патолопчного матер1алу в1д ВРХ (n = 50) позитивний результат 1ндикаци P. multocida за допомогою ПЛР одержали у 49,3 випадках (98,6 %), а вщ свиней (n = 50) - у 49,7 випадках (99,4 %); в той час за допомогою бактерюлопчних дослщжень P. multocida видшялась вщповщно у 41 (82,0 %) та 44 (89,4 %) випадках. У процес1 проведения серотишзаци видшених штам1в пастерел на бших мишах одержали результата, що зб1гаються з даними ПЛР-анал1зу. Було встановлено, що до P. multocida серовару А належить 38 (61,3 %) культур, а до P. multocida серовару D - 24 (38,7 %). Таким чином, обидва методи серотишзаци виявились ефективними, але результати за допомогою ПЛР одержали за 5 годин, тод1 як для проведения серотишзаци на бших мишах треба до трьох д1б.
Результати, одержан! при виконанш робота, дають можливють провести паралель м1ж класичними методами д1агностики пастерельозу тварин, якими оперують державн1 ветеринарн1 лаборатор^, а саме: культурального, м1кроскоп1чного, 6ioxiMÎ4Horo й серолопчного в1д РА та сучасними методами 1ФА та пол1меразно1 ланцюгово! реакци у р1зних аспектах. Це дае можлив1сть пор1вняти ïx та оцшити.
401
У Bcix лабораторних довщниках, настановах, рекомендациях i пщручниках наводиться метод видшення та культивування пастерел на живильних середовищах, вивчення i'xHix 6ioxiMi4HHx властивостей (проведения через строкатий ряд), серотитзащя на бших мишах. Усе це ми враховували при проведенш дослщження клмчного та патолопчного матер1ал1в вщ тварин (ВРХ i свиней).
Висновки.
Метод бактерюлопчних дослщжень (мжроскотя, культивування, 6ionpo6a, стафшококовий тест, серозахист на бших мишах) досить трудомкткий. До того ж на кожну пробу патолопчного матер1алу треба використовувати до п'яти мишей. Результата бактер1альних дослщжень за своею ефектившстю практично не вщр1знялись вщ ПЛР, але значно дешевшг
Об'ектившсть лабораторного дослщження P. multocida залежить вщ ¿золяци та щентифжаци пщозрших колонш бактерш за допомогою мжроскопи й 61ох1м1чних дослщжень. П1д час польових досл1джень стану нос1йства ¿золяц1я P. multocida досить складна, коли зразки беруть i3 контам1нованого органа тварини, наприклад, i3 носа, горла. Екстенсивне субкультивування необх1дне для отримання чисто! культури збудника. KpiM того, складшсть отримання антисироваток i час, необхщний для процедури серотипування P. multocida, свщчать, що серолопчне визначення не практичне для 61льшост1 лаборатор1й краши. Це призводить до зб1льшення перюду м1ж в1дбиранням патолог1чного матер1алу та серолопчною ¿дентиф1кац1ею, особливо, якщо матер1ал тривалий час транспортують до лаборатори.
При пор1внянн1 ПЛР i бактер1альних досл1джень найб1льшою перевагою першого методу е швидке отримання к1нцевого результату, але перев1рений часом класичний бактерюлопчний метод д1агностики дае повну шформацш про збудник пастерельозу: патогенний чи апатогенний, визначення ЛД50 який титр у РИГА чи РА, визначення персистенци i резистенц11 P. multocida до антибютичних та дез1нф1куючих препарат1в, тощо.
Л1тература
1. Волинець Л. К. Поширення, економ1чн1 збитки та профшактика пастерельозу свиней/ Л. К. Волинець, Т. В. Мазур, В. I. Москалюк // Вет. медицина Украши. - 1997. - № 8. - С. 16-17.
2. Факторш хвороби с1льськогосподарських тварин / В. П. Литвин [та ш.] ; заред. В. П. Литвина, Л. £. Корн1енка. - К.: Аграр. наука, 2002. - С. 292 -363.
3. Carty D. H. Preventing atrophic rhinitis, erysipelas and pasteurellosis in pigs / D. H. Carty, D. B. Porter, J. J Duglass, C. A. Slusser // Vet. Med. (Edwardvi-lle). -1986. - Vol. 81, № 12. - P. 1169 - 1174.
4. Thomson R. Investigation of Factors of Probabl signiticance in Patogenesis of Pneumonic Pasteurellosis in Catte / R. Thomson // Can. T. Comp. Mol. - 1975. -Vol. 39, № 2. - P. 205 - 207.
5. Leesley B. A. Saline - extracted antigens of Past. multocida: separation by chromatofotusing, preliminary characterization and evaluation of immuno-geniticity /
402
B. A. Leesley, A. W. Cofner, D. F. Vosier // Vet. Immunopathol. - 1985. - Vol. 7, № 23. - P. 279 - 296.
6.Foged, N. T. Pasteurella multocida toxin. The characterization of the toxin and its significance in the diagnosis and prevention of progressive atrophic rhinitis in pigs / N. T. Foged // Acta Pathol. Microbiol. Immunol. Scand. - 1992. - № 100 (Suppl. 25). - P. 1 - 56.
7. Настанова з лабораторно! д1агностики пастерельозу тварин та птищ/ О. I. Сосницький, В. П. Заболотна , А. А. Руденко, А. Ф. Руденко, Б. Т. Сте-гнш ,
A. Ф. Бабкш, В. О. Ушкалов, А. М. Головко, В. Г. Скрипник, Л. М. Да-видовська, П. П. Cîmox, В. I. Скачина, А. В. Абрамов, Г. М. Данисюк, Л. К. Волинець, У. М. Яненко, В. Ю. КасЫч, Г. О. Мшанко, Н. О. Авраменко. -Харюв, 2007. - 12 с.
8. Каширин В. В. Иммуногенные свойства штаммов Pasteurella multocida /
B. В. Каширин // Ветеринария. - 1989. - № 5. - С. 25 - 27.
Summary
In this article the methods of diagnostics of Pasteurella from cattle and pigs with bronchopneumonia and infectious atrophic rhinitis are described, as well as the study of pathologic material from the killed and succumbed animals with a preliminary diagnosis - bronchopneumonia. The comparison between PCR, ELISA and conventional bacteriological methods of isolation of P. multocida from farm animals was carried out.
Key words: Pasteurellosis, diagnostics, polymerase chain reaction, enzyme-linked immunosorbent assay, bacteriological studies, serovars, strain
Рецензент - д.вет.н., професор Сл1вшська Л.Г.
403
