CC BY
27
Анализ люминесценции в мутных биологических средах
Гусева ИЛЛ 2 • Рогаткин ДАЛ 3 • Бувалая Е.С.1, 4
Гусева Ирина Андреевна - техник лаборатории медико-физических исследований1, аспирант факультета экспериментальной и теоретической физики2
* 129110, г. Москва, ул. Щепкина, 61/2-9, Российская Федерация. Тел.: +7 (495) 681 89 84. Е-таИ: [email protected] Рогаткин Дмитрий Алексеевич - д-р техн. наук, заведующий лабораторией медико-физических исследований1, научный руководитель программ и проектов3
Бувалая Екатерина Сергеевна -
лаборант лаборатории медико-физических исследований1, магистр физического факультета4
Актуальность. Количественный люминесцентный анализ широко используется в биологии, лабораторной диагностике и клинической медицине для исследования объектов на различных уровнях. Однако существующие упрощенные алгоритмы расчета концентрации люминофоров в разбавленных линейных растворах не могут быть применены к условиям мутных сред с сильным светорассеянием, к которым относятся большинство живых биологических тканей. Сегодня развитие люминесцентного анализа в медицине идет по пути создания неразрушающих и неинвазивных методик контроля in vivo. В этой связи вопрос о постановке задачи исследования и разработки алгоритмов вычислений концентрации люминофоров по регистрируемым спектрам люминесценции в условиях мутных сред представляется актуальным. Цель - формулировка и обоснование задачи разработки алгоритмов вычислений концентрации люминофоров по регистрируемым спектрам люминесценции в условиях оптически мутных сред. Материал и методы. Рассматривалось физико-математическое моделирование процесса формирования вынужденного излучения флюоресценции в светорассеивающей среде на основе модифицированной двухпотоковой модели Кубелки -Мунка. Проводилась серия лабораторных
экспериментов с макрооднородными светорас-сеивающими модельными средами на основе натуральных препаратов крови для выяснения характера реальной зависимости регистрируемой с поверхности оптически мутной биологической среды интенсивности флюоресценции от фактора светорассеяния и концентрации флюорофора в среде. Результаты. И теоретические, и экспериментальные результаты демонстрируют сложную нелинейную зависимость регистрируемой интенсивности флюоресценции от оптических свойств среды и концентрации флюорофора в среде. Эта зависимость сильно отличается от известного линейного решения Паркера для прозрачных сред, что приводит к невозможности его применения в условиях оптически мутных сред. Заключение. Необходимо дальнейшее развитие исследований в направлении поиска замкнутого аналитического решения обратной задачи оптики светорассеивающих и флюоресцирующих сред для вычисления по регистрируемому потоку люминесценции концентрации люминофора в светорассеивающей среде.
Ключевые слова: спектроскопия, люминесценция, концентрация, оптически мутная среда
doi: 10.18786/2072-0505-2017-45-2-163-169
1 ГБУЗ МО «Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского»; 129110, г. Москва, ул. Щепкина, 61/2, Российская Федерация
2 ФГАОУ ВПО «Национальный исследовательский ядерный университет «МИФИ»; 115409, г. Москва, Каширское шоссе, 31, Российская Федерация
3 ООО «Центр исследований и разработок ЭОС-Медика»; 117246, г. Москва, Научный проезд, 8/1, Российская Федерация
4 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова (МГУ); 119991, г. Москва, ГСП-1, Ленинские горы, 1-2, Российская Федерация
Явление люминесценции основано на возбуждении атомов и/или молекул, возникающем в среде вследствие перехода электронов на новый энергетический уровень после поглощения энергии падающих фотонов и переизлучения квантов света с большей длиной волны при переходе возбужденных атомов и/или молекул назад в основное состояние [1]. В зависимости от энергетического уровня, с которого атом или молекула переходит в основное состояние, люминесценцию принято разделять на флюоресценцию и фосфоресценцию [2]. Регистрируя излучение люминесценции, можно получать информацию о содержании и динамике накопления различных люминофоров в клетках и тканях [3, 4]. Методы люминесцентного анализа нашли широкое применение в области исследования биологических сред на различных уровнях благодаря их высокой чувствительности [1, 3]. Самые простые качественные методы анализа используются для визуального определения факта наличия тех или иных веществ в объекте [1, 5]. Но современные компьютеризированные лабораторные спектральные приборы позволяют осуществлять и количественный анализ состава исследуемых сред, для чего используют различные калибровочные кривые и/или аналитические модели расчета концентраций люминофоров в растворах [3-6].
Сегодня развитие люминесцентного анализа в медицине идет уже по пути создания неразру-шающих и неинвазивных методик мониторинга и контроля in vivo [4, 7]. В частности, такие методики лазерной флюоресцентной спектроскопии находят свое применение в диагностике при процедурах фотодинамической терапии, во флюоресцентной навигации при хирургическом
Рис. 1. Геометрия измерения флюоресценции с поверхности модельных растворов с помощью оптоволоконного зонда в режиме регистрации обратно рассеянного излучения
удалении опухолей головного мозга, в контроле потребления лекарственных препаратов, оценке содержания коллагена в тканях, порфирина при гипоксических состояниях и т.д. [7-11]. Однако существующие упрощенные алгоритмы калибровки и расчета концентрации люминофоров в разбавленных линейных растворах in vitro не могут быть применены к условиям мутных сред с сильным светорассеянием. А к таким средам относятся большинство живых биологических тканей. В этой связи важным представляется вопрос о постановке задачи исследования и разработки алгоритмов вычислений концентрации люминофоров по регистрируемым спектрам люминесценции в условиях мутных сред. Особенно актуален количественный анализ при определении содержания витаминов, гормонов, антибиотиков в таких биологических объектах, как кровь, моча, мягкие ткани и др. [5, 6].
В данной статье формулируется и обосновывается проблема количественного определения концентрации люминесцирующих веществ в мутных биологических тканях и средах на примере лазерной флюоресцентной спектроскопии в режиме регистрации обратно рассеянного света.
Материал и методы
Проводилась серия лабораторных экспериментов с модельными средами для выяснения характера существующей зависимости регистрируемой с поверхности оптически мутной биологической среды интенсивности флюоресценции от фактора светорассеяния. В качестве модельной среды использовались гомогенные растворы разных концентраций в диапазоне 0-350 нг/мл фтало-цианина алюминия в физиологическом растворе
Рис. 2. Лазерный диагностический комплекс ЛАКК-М
Персональный компьютер
Лазер
Спектрометр А
Оптический обрезающий фильтр
Осветительное оптоволокно i Приемное оптоволокно
Объект
Рис. 3. Упрощенная блок-схема измерений на основе лазерного спектроскопического комплекса ЛАКК-М
1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0
600
Максимум в линии обратного рассеяния j(0)
Максимум в линии флюоресценции J(0)
650 700
Длина волны, нм
750
Рис. 4. Регистрируемый суммарный спектр вторичного излучения
(стандартный флюоресцирующий препарат-фотосенсибилизатор Фотосенс, разрешенный для клинического применения), в которые добавлялись различные небольшие объемы крови группы 1 - 0,6, 1,15 и 2,3% от общего объема раствора. Полученные модельные среды-суспензии помещались в микропробирку объемом 1,5 мл. К ее поверхности подводился дистальный конец диагностического оптоволоконного зонда регистрирующей лазерной спектроскопической системы ЛАКК-М. В отличие от использовавшихся в нашей предыдущей теоретической работе [12] искусственных светорассеивающих модельных мер с одной большой неоднородностью внутри, которые моделировали опухоль, в данном исследовании изучалась макрооднородная светорассе-ивающая модельная среда на основе натуральных препаратов крови.
Измерения спектров флюоресценции проводились с помощью многофункционального лазерного спектроскопического комплекса ЛАКК-М [8], который имеет в своем составе канал регистрации флюоресценции (рис. 1). Комплекс ЛАКК-М разрешен к применению в медицине именно для целей неинвазив-ной лазерной клинической диагностики in vivo. Режим работы комплекса в данном исследовании - «Флюоресценция» (рис. 2).
Для возбуждения флюоресценции в исследуемых объектах комплекс оснащен тремя маломощными непрерывными лазерами с разными длинами волн. В нашем исследовании для возбуждения флюоресценции фталоцианина алюминия в модельной среде использовался полупроводниковый лазер с длиной волны
\е = 635 нм, мощность которого была порядка 5 мВт с выхода оптического волокна. Блок-схема измерений в режиме регистрации обратно рассеянного излучения приведена на рис. 3.
Излучение от лазера доставляется к поверхности исследуемого объекта по осветительному оптическому волокну - одной из жил многожильного оптоволоконного зонда. Другая жила - приемное оптическое волокно. Оно собирает от объекта обратно рассеянное вторичное излучение и излучение флюоресценции и доставляет их совместно через обрезающий оптический фильтр в спектрометр. Обрезающий оптический фильтр необходим для ослабления обратно рассеянного излучения лазера на длине волны генерации до уровней, соизмеримых с уровнями излучения флюоресценции. В противном случае слабое излучение флюоресценции не будет видно на фоне яркого излучения лазера (коэффициент ослабления фильтра примерно равен к = 1000). Далее в спектрометре происходит разложение прошедшего фильтр излучения в оптический спектр, и весь этот спектр одномоментно регистрируется линейным фотоприемником, преобразуясь в электрический сигнал, который затем усиливается и через стандартное устройство сопряжения подается для обработки в управляющий персональный компьютер. Спектр вторичного излучения, включая спектр флюоресценции, в этой схеме можно сразу наблюдать на экране монитора компьютера в реальном времени (рис. 4). При обработке результатов измерений диапазон длин волн флюоресценции выбирался равным области максимума флюоресценции фталоцианина алюминия в районе длины волны ^ = 680 нм.
В теоретическом плане рассматривалось физико-математическое моделирование процесса распространения оптического излучения в мутных флюоресцирующих биологических тканях и средах. Использовалась одномерная модифицированная модель Кубелки - Мунка [12]. Приведем постановку задачи. В качестве модели биологической ткани была взята однослойная полубесконечная среда с равномерным распределением внутри нее флюорофора, рассе-ивателей и поглотителей света. Возбуждающий поток лазерного излучения Ф0 с длиной волны возбуждения флюоресценции Хе падает на левую границу среды (х = 0) (рис. 5). Внутри среды этот поток распространяется слева направо вдоль оси х (обозначен как 1(х)), поглощается хромофорами ткани и рассеивается на неодно-родностях, формируя таким образом поток обратно рассеянного излучения )(х). Часть суммарно распространяющегося в среде излучения (1(х) + }(х)), поглощенная флюорофором, индуцирует вынужденную флюоресценцию флюорофо-ра на длине волны флюоресценции Хр. Излучение флюоресценции также распространяется в среде в обоих направлениях (потоки флюоресценции обозначены 1(х) и ](х)), рассеивается и поглощается. Рассеивающие и поглощающие свойства среды на любой длине волны Х задаются коэффициентами затухания и обратного рассеяния в1(Х) [мм-1] и в2(Х) [мм-1] соответственно. Флюорофор, распределенный внутри биологической среды, характеризуется своей относительной объемной концентрацией Ср выраженной в относительных единицах (0 < Ср< 1), а также коэффициентом поглощения излучения у.ар который зависит от длины волны излучения Х. Требуется найти явный вид зависимости регистрируемых
х=0
Рис. 5. Постановка задачи моделирования распространения света в светорассеивающей и флюоресцирующей биологической среде (объяснения в тексте)
с внешней поверхности среды потоков j(x = 0) и J(x = 0) как функций оптических свойств среды распространения излучения и концентрации флюорофора в ней.
Результаты и обсуждение
Полученные теоретические результаты наиболее наглядно могут быть продемонстрированы в сравнении с классическим решением для прозрачной среды без рассеяния. В среде без рассеяния излучение распространяется прямолинейно, обратно рассеянного потока не образуется, поэтому измерение обычно проводится на просвет. Для этой ситуации еще в 1968 г. C. Parker в своей классической книге [13] подробно описал и проанализировал решение задачи для регистрируемого излучения флюоресценции. С использованием введенных нами в предыдущем разделе обозначений это решение в режиме измерения «на просвет» может быть записано в виде:
Цх = Н) = 2,3 • Ф0 • р(ЛЛ> • МЛ) -Cf-Ht (1)
где I(x) - регистрируемое излучение флюоресценции, f(Xe,Xf) - квантовый выход флюоресценции, H - толщина просвечиваемого раствора, обычно равная 1 см.
Концентрация С, отн. ед.
Рис. 6. Расчетное семейство нелинейных соотношений согласно уравнению (2). Исходные данные для расчета при С= 0:
1) К/= 200 мм-1; в,(Х) = 4,1 мм-1; в2(^ = 3,1 мм-1; вА) = 4,1 мм-1; в2(Л) = 3,1 мм-1,
2) цаГ = 200 мм-1; вА) = 13,3 мм-1; в2(Л) = 13,0 мм-1; вД) = 2,5 мм-1; в2(Л) = 1,5 мм-1,
3) ¡Аа,= 150 мм-1; в,(Х) = 6,1 мм-1; в2(^ = 3,1 мм-1; вА) = 4,1 мм-1; в2(Л) = 3,1 мм-1,
4) цаГ = 200 мм-1; вД) = 43,8 мм-1; в2(Х) = 43,5 мм-1; вД) = 12,2 мм-1; в2(Л) = 10,2 мм-1,
5) ¡Аа, = 150 мм-1; вА) = 18,0 мм-1; в2(Л) = 13,0 мм-1; вД) = 2,5 мм-1; в2(Х) = 1,5 мм-1,
6) цаГ = 100 мм-1; вД) = 48,5 мм-1; в2(Л) = 43,5 мм-1; вД) = 22,8 мм-1; в2(Л) = 20,8 мм-1.
Подход Паркера фактически сегодня признан «золотым стандартом» в лабораторной клинической диагностике. Он до сих пор излагается как базовый в различных учебных материалах (см., например, [5]), а уравнение (1) неизменно используется во многих биологических и медицинских исследованиях. Несмотря на то что применимость формулы (1) ограничена условием малой оптической плотности раствора и решение (1) не учитывает нелинейные эффекты (нелинейные члены разложения экспоненты уравнения Бугера - Ламберта - Бира, лежащего в основе решения Паркера, в ряд по малому параметру показателя степени), ее широкое применение на практике вполне оправдано. Оно обусловлено тем, что на основании формулы (1) легко решить обратную задачу, а именно: выразить из нее и вычислить концентрацию флюо-рофора в среде Ср зная (регистрируя) мощность излучения флюоресценции 1(х).
К сожалению, для оптически мутных сред и для излучения флюоресценции ¡(0), регистрируемого в режиме обратного рассеяния с передней (освещаемой) поверхности ткани, это решение неприменимо. На основе модифицированной модели Кубелки - Мунка для случая мутных сред в рамках данной работы нами было получено и проанализировано следующее более общее решение [12]:
т=Фа-<р{К,куАлкуу,
(2)
где у.
(! + 0(1 +
- тю-А(Л)}С/.о - {Д(Л) - А(Л)}С/.о . (3)
Как видно, структура этого решения (уравнение (2)) аналогична уравнению Паркера, но имеются и существенные отличия. Первое значимое отличие заключается в том, что коэффициент у с размерностью [мм], представляющий собой вместо Н некую эффективную толщину среды, с которой снимается полезный сигнал флюоресценции в случае мутной среды, в отличие от фиксированного и известного значения Н, здесь является сложной функцией оптических свойств среды и заранее не известен. Второе отличие обнаруживается в описании количества поглощенного флюорофором возбуждающего излучения. Если в (1) это количество определяется известной
1400 1200 1000 800 600 400 200 0
Объем добавленной крови, %
- 0,6
---- 1,15
_ 2,3
1 1 V 1
50
100
150 200 С, нг/мл
250
300
350
Рис. 7. Экспериментальные зависимости регистрируемой интенсивности флюоресценции ](0) от концентрации фотосенсибилизатора Фотосенс при различных объемах добавленной крови
константой флюорофора у.ар то в (2), как было показано в [12], доля поглощенного возбуждающего излучения определяется выражением (3) по разности оптических свойств среды распространения излучения с учетом и без учета наличия флюорофора в среде (для концентраций, соответственно, Ср= 0 и СрФ 0). Это различие небольшое, порядка 5-10%, но оно есть и усложняет задачу.
В целом оба эти отличия приводят к тому, что вместо одной простой линейной зависимости регистрируемого сигнала флюоресценции от концентрации флюорофора Ср в виде (1) для мутной биологической среды мы получаем семейство сложных нелинейных соотношений, определяемых оптическими свойствами в(А) и в2(\) среды распространения излучения (рис. 6).
Полученные экспериментальные данные подтверждают сделанные теоретические выкладки и расчеты. Семейство полученных экспериментальных зависимостей регистрируемой интенсивности флюоресценции от концентрации флюорофора в модельной светорассеива-ющей среде при разных объемах добавленной крови представлено на рис. 7.
Качественное сходство двух графиков очевидно. Следовательно, для мутных биологических тканей и сред, в которых большое влияние на процессы распространения света оказывает многократное внутреннее рассеяние, вопрос количественного определения концентрации флюорофора в среде по регистрируемому сигналу флюоресценции существенно усложняется. Если неизвестны оптические параметры среды,
0
а они априори точно неизвестны, то, регистрируя сигнал флюоресценции с поверхности исследуемых образцов, как показано на рис. 7, например, в 700 усл. ед., концентрация фотосенсибилизатора будет определена в диапазоне от 160 (примерно) до 260 нг/мл. Разброс (погрешность) оценки составит порядка 50%, что нельзя считать приемлемым. Именно поэтому необходимо более точное решение обратной задачи на основе уравнения (2) с учетом дополнительных измерений оптических свойств конкретного исследуемого образца. Собственно, такая постановка задачи в оптической неинвазивной диагностике известна: устройства для такой диагностики строятся с учетом реализации принципа решения обратных задач оптики светорассеивающих сред [14, 15]. Однако применительно к уравнению (2) авторам сегодня такое конкретное аналитическое решение задачи относительно концентрации флюорофора не известно. Оно должно быть дополнительно получено, обосновано, исследовано на точность, линейность, на соответствие результатам эксперимента и т.д. прежде, чем задача может считаться решенной. Безусловно, сегодня можно сделать определенные выкладки на основе уравнений (2) и (3). Тем не менее представляется, что это тема отдельного исследования в продолжение приведенных выше экспериментальных результатов и сформулированных теоретических положений.
Заключение
В проведенном исследовании на примере лазерной флюоресцентной спектроскопии в режиме регистрации обратно рассеянного света рассматривалась проблема определения концентрации флюоресцирующих компонентов в биологических тканях и средах по результатам измерения излучения флюоресценции. Экспериментально на модельных средах на основе натуральных препаратов крови и фотосенсибилизатора Фотосенс изучался реальный характер зависимости регистрируемой с поверхности оптически мутной биологической среды интенсивности флюоресценции от фактора светорассеяния и концентрации флюорофора в среде. В теоретическом плане были получены аналитические уравнения, описывающие формирование потока излучения флюоресценции на поверхности среды в условиях сильного светорассеяния. И экспериментальные, и теоретические результаты показали некорректность использования классических вычислительных алгоритмов, предназначенных для прозрачных сред, в ситуации биологических тканей, в которых нельзя пренебречь процессами многократного рассеяния света. Таким образом, необходимо дополнительное решение задачи поиска аналитического алгоритма определения концентрации люминофора по регистрируемым спектрам люминесценции в условиях оптически мутных сред. ф
Литература
1. Гладков АА. Люминесцентный анализ в медицине. Кишинев: КГУ; 1958. 389 с.
2. Lakowicz JR. Principles of fluorescence spectroscopy. New York: Plenum Press; 1983. 488 p.
3. Udenfriend S. Fluorescence assay in biology and medicine. New York, London: Academic Press; 1962. 517 p.
4. Рогаткин ДА. Физические основы лазерной клинической флюоресцентной спектроскопии in vivo. Медицинская физика. 2014;(4): 78-96.
5. Шмидт В. Оптическая спектроскопия для химиков и биологов. М.: Техносфера; 2007. 368 с.
6. Siraj N, El-Zahab B, Hamdan S, Karam TE, Haber LH, Li M, Fakayode SO, Das S, Valle B, Strongin RM, Patonay G, Sintim HO, Baker GA, Powe A, Lowry M, Karolin JO, Geddes CD, Warner IM. Fluorescence, phosphorescence, and chemiluminescence. Anal Chem. 2016;88(1): 170-202. doi: 10.1021/acs.analchem.5b04109.
7. Mycek MA, Pogue BW, editors. Handbook of biomedical fluorescence. New York: Marcel Dekker Inc.; 2003. 665 p.
8. Rogatkin D, Shumskiy V, Tereshenko S, Polya-kov P. Laser-based non-invasive spectrophotometry - an overview of possible medical applications. Photonics & Lasers in Medicine. 2013;2(3):225-40. doi: 10.1515/ plm-2013-0010.
9. Smirnova OD, Rogatkin DA, Litvinova KS. Collagen as in vivo quantitative fluorescent bio-markers of abnormal tissue changes. J Innov Opt Health Sci. 2012;(5):250010. doi: http:// dx.doi.org/10.1142/S1793545812500101.
10. Rogatkin DA, Tereschenko SG, Lapaeva LG, Gorenkov RV. Complex therapeutic-diagnostic endoscopy with laser irradiation and in-Situ spectrophotometry of erosive-ulcerative impairments of upper part of the gastrointestinal tract. Proc. SPIE 4613. Optical Biopsy IV; 286 (May 7, 2002). doi: 10.1117/12.465257.
11. Sunar U, Rohrbach DJ, Morgan J, Zeitouni N, Henderson BW. Quantification of PplX concentration in basal cell carcinoma and squa-mous cell carcinoma models using spatial frequency domain imaging. Biomed Opt
Express. 2013;4(4):531 -7. doi: 10.1364/ B0E.4.000531.
12. Rogatkin D, Guseva I, Lapaeva L. Nonlinear behavior of the autofluorescence intensity on the surface of light-scattering biotissues and its theoretical proof. J Fluoresc. 2015;25(4): 917-24. doi: 10.1007/s10895-015-1572-7.
13. Parker CA. Photoluminescence of solutions. Amsterdam: Elsevier; 1968. 510 p.
14. Rogatkin DA, Sokolovski SG, Fedorova KA, Stewart NA, Sidorov VV, Rafailov EU. Basic principles of design and functioning of multifunctional laser diagnostic system for non-invasive medical spectrophotometry. Proc. SPIE 7890. Advanced Biomedical and Clinical Diagnostic Systems IX, 78901H (February 21, 2011). doi: 10.1117/12.874258.
15. Рогаткин ДА. Базовые принципы организации системного программного обеспечения многофункциональных неинвазивных спектрофотометрических диагностических приборов и комплексов. Медицинская техника. 2004;(2):8-12.
Almanac of Clinical Medicine. 2017 March-April; 45 (2): 163-169
References
1. Gladkov AA. Luminescent analysis in medicine. Kishinev: KGU; 1958. 389 p. Russian.
2. Lakowicz JR. Principles of fluorescence spectroscopy. New York: Plenum Press; 1983. 488 p.
3. Udenfriend S. Fluorescence assay in biology and medicine. New York, London: Academic Press; 1962. 517 p.
4. Rogatkin DA. Physical foundations of laser clinical fluorescence spectroscopy in vivo. Medical Physics. 2014;(4):78-96. Russian.
5. Shmidt V. Optic spectroscopy for chemists and biologists. Moscow: Tekhnosfera; 2007. 386 p.
6. Siraj N, El-Zahab B, Hamdan S, Karam TE, Haber LH, Li M, Fakayode SO, Das S, Valle B, Strongin RM, Patonay G, Sintim HO, Baker GA, Powe A, Lowry M, Karolin JO, Geddes CD, Warner IM. Fluorescence, phosphorescence, and chemiluminescence. Anal Chem. 2016;88(1): 170-202. doi: 10.1021/acs.analchem.5b04109.
7. Mycek MA, Pogue BW, editors. Handbook of biomedical fluorescence. New York: Marcel Dekker Inc.; 2003. 665 p.
8. Rogatkin D, Shumskiy V, Tereshenko S, Polya-kov P. Laser-based non-invasive spectropho-tometry - an overview of possible medical applications. Photonics & Lasers in Medicine. 2013;2(3):225-40. doi: 10.1515/ plm-2013-0010.
9. Smirnova OD, Rogatkin DA, Litvinova KS. Collagen as in vivo quantitative fluorescent bio-markers of abnormal tissue changes. J. Innov. Opt. Health Sci. 2012;(5):250010. doi: http:// dx.doi.org/10.1142/S1793545812500101.
10. Rogatkin DA, Tereschenko SG, Lapaeva LG, Gorenkov RV. Complex therapeutic-diagnostic endoscopy with laser irradiation and in-Situ spectrophotometry of erosive-ulcerative impairments of upper part of the gastrointestinal tract. Proc. SPIE 4613. Optical Biopsy IV; 286 (May 7, 2002). doi: 10.1117/12.465257.
11. Sunar U, Rohrbach DJ, Morgan J, Zeitouni N, Henderson BW. Quantification of PpIX concentration in basal cell carcinoma and squamous cell carcinoma models using spatial frequen-
cy domain imaging. Biomed Opt Express. 2013;4(4):531-7. doi: 10.1364/BOE.4.000531.
12. Rogatkin D, Guseva I, Lapaeva L. Nonlinear behavior of the autofluorescence intensity on the surface of light-scattering biotissues and its theoretical proof. J Fluoresc. 2015;25(4): 917-24. doi: 10.1007/s10895-015-1572-7.
13. Parker CA. Photoluminescence of solutions. Amsterdam: Elsevier; 1968. 510 p.
14. Rogatkin DA, Sokolovski SG, Fedorova KA, Stewart NA, Sidorov VV, Rafailov EU. Basic principles of design and functioning of multifunctional laser diagnostic system for non-invasive medical spectrophotometry. Proc. SPIE 7890. Advanced Biomedical and Clinical Diagnostic Systems IX, 78901H (February 21, 2011). doi: 10.1117/12.874258.
15. Rogatkin DA. Basic principles of organization of system software for multifunctional non-invasive spectrophotometric diagnostic devices and systems. Biomedical Engineering. 2004;38(2):61-5.
Analysis of luminescence in turbid biological media
Guseva I.A.1' 2 • Rogatkin D.A.1' 3 • Buvalaya E.S.1' 4
Background: Quantitative luminescent analysis is widely used in biology, laboratory diagnostics and clinical medicine to study objects at various levels. However, the existing simplified algorithms for calculation of the luminophore concentration in diluted linear solutions cannot be applied to the turbid media with strong light scattering, which include the majority of living biological tissues. Today, the development of luminescence analysis in medicine goes towards the creation of nondestructive and non-invasive methods of in vivo monitoring. Therefore, the urgent question is about a formulation of the research purpose and the development of algorithms to compute the luminophore concentration based on the luminescence spectra recorded in the turbid media. Objective: To formulate and justify the tasks of elaboration of the algorithms to compute the luminophore concentration based on the luminescence spectra recorded under conditions of the optically turbid media. Materials and methods: We looked upon the physico-mathematical simulation of the process of formation of the induced fluorescence emission in the light-scattering medium based on the modified 2-flux Kubelka-Munch model. We
conducted a series of laboratory experiments with macro-homogenous light-scattering model media to determine characteristics of the dependence of the fluorescence intensity detected from the surface of an optically turbid biological medium upon the factor of light scattering and the concentration of the fluorophore in the medium. Results: Both theoretical and experimental results demonstrate complex nonlinear dependence of the fluorescence intensity detected upon the optical properties and a concentration of a fluorophore in the turbid media. This dependence is very different from the known linear C. Parker's solution for transparent media, which makes it impossible to use it in the optically turbid media. Conclusion: Further studies searching a closed-form analytical solution of the inverse optical problem for light-scattering and fluorescent media are necessary to calculate the luminophore concentration in a light-scattering media based on the recorded luminescence spectra.
Key words: spectroscopy, luminescence, concentration, optically turbid media
doi: 10.18786/2072-0505-2017-45-2-163-169
Guseva Irina A. - Technicist, Laboratory of Medical and Physics Research1; Postgraduate Student, Faculty of Experimental and Theoretical Physics2 * 61/2-9 Shchepkina ul., Moscow, 129110, Russian Federation. Tel.: +7 (495) 681 89 84. E-mail: [email protected]
Rogatkin Dmitriy A. - PhD (in Engineering), Head of Laboratory of Medical and Physics Research1; Director of the Research Programs and Projects3 Buvalaya Ekaterina S. - Laboratory Assistant, Laboratory of Medical and Physics Research1; Master of Faculty of Physics4
1 Moscow Regional Research and Clinical Institute (MONIKI); 61/2 Shchepkina ul., Moscow, 129110, Russian Federation
2 National Research Nuclear University MEPhI (Moscow Engineering Physics Institute);
31 Kashirskoe shosse, Moscow, 115409, Russian Federation
3 Research & Development Center EOS-Medica Ltd.; 8/1 Nauchnyy proezd, Moscow, 117246, Russian Federation
4 Lomonosov Moscow State University; 1-2 Leninskie gory, Moscow, 119991, Russian Federation
