CC BY
55
УДК 576.8.077.37:577.1:547.96:616-006-097 © О.А. Князева, 2009
О.А. Князева
АНАЛИЗ КОМПЛЕМЕНТСВЯЗЫВАЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ G ЧЕЛОВЕКА ПРИ НЕОПЛАСТИЧЕСКИХ
ПРОЦЕССАХ
ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава», г. Уфа
С помощью специфических моноклональных антител методами иммуноферментного анализа и реакции связывания комплемента проведена количественная оценка взаимодействия C1q (субкомпонента первого фактора комплемента) с иммуноглобулинами G, выделенными из сывороток крови больных (ходжкинские и неходжкинские лимфомы, хронический лимфолейкоз, рак молочной железы) и здоровых лиц. Сопоставляя и анализируя полученные результаты с литературными данными, доказывается, что снижение комплементфиксирующей функции IgG при неопластических процессах может происходить за счет их взаимодействия с амфифильными лигандами, количество которых при неопластических процессах увеличивается вследствие повышенной деструкции опухолевых клеток и тканей.
Ключевые слова: комплемент, иммуноглобулины, ходжкинские и неходжкинские лимфомы, хронический лимфолей-коз, рак молочной железы.
О.А. Кnyzeva
ANALYSIS OF COMPLEMENT-BONDING ACTIVITY OF G ANTIBODIES OF MAN
DURING NEOPLASTIC PROCESSES
With the help of specific monoclonal antibodies using methods of immune-enzyme analysis and the reaction of complement bonding there has been assessed the interaction of C1q (subcomponent of the first factor of complement) with G antibodies obtained from blood serums of patients (Hodgkin's lymphomas and non-Hodgkin's lymphomas, chronic lymphatic leukemia, breast cancer) and healthy people. Comparing and analyzing the results obtained with the existing literature it is proved that lowering of complement-fixing IgG function during neoplastic processes may occur due to their interaction with amphiphilic ligands the number of which within neoplastic processes increases as a result of increased destruction of tumorous cells and tissues.
Key words: complement, antibodies, Hodgkin's lymphomas and non-Hodgkin's lymphomas, chronic lymphatic leukemia, breast cancer.
В основе нарушения механизмов реализации противоопухолевой защиты организма может лежать изменение характера взаимодействия между различными звеньями иммунитета и их составляющими [5]. Среди гуморального звена врожденного иммунитета наиболее сложным и многогранным действием обладает система комплемента. Активация системы комплемента по классическому пути чаще всего начинается с взаимодействия субкомпонента первого фактора комплемента СЦ с в составе комплекса антиген-
антитело. Данная реакция является ключевой и решающей для всего последующего каскада биохимических реакций. Поэтому является актуальным исследование тонких взаимоотношений между этими двумя макромолекулами, которые представляют две различные и тесно взаимодействующие системы иммунитета (врожденный и приобретенный), при неопластических процессах.
Как было нами показано ранее [8], при неопластических состояниях: хроническом
лимфолейкозе (ХЛЛ), ходжкинских (ХЛ) и неходжкинских лимфомах (НХЛ), раке молочной железы (РМЖ) происходит ослабление силы связывания между СЦ и ^О, выражающееся в увеличении константы диссоциации (Ы) комплекса С1д-^О. Так, значение
Ы для доноров составляло (1,91±0,42)10-7 М, для ХЛЛ - (13,16 ± 3,29)10-7 М (р < 0,01), ХЛ
- (6,68±1,22)10-7 М (р < 0,01), НХЛ -(5,76±1,25)10-7 М (р < 0,02), РМЖ -(3,88±0,7)10-7 М (р < 0,05). При этом аффинность специфических моноклональных антител (МкАТ) к антигенным детерминтам, расположенным в области Бе фрагмента ^О, снижалась примерно на 30% [7, 8].
На основании данных результатов была предложена гипотеза о стерическом «экранировании» центра связывания СЦ с ^О метаболитами, образующимися вследствие повышенной деструкции опухолевых клеток, доказательство которой и обусловило цель настоящего исследования.
Материал и методы
В работе были использованы чистые препараты иммуноглобулинов О (^О) человека, выделенные нами методом ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-Трисакриле М из сывороток крови больных с неопластическими процессами и здоровых доноров. Больные хроническим лимфолейкозом опухолевой формы (ХЛЛ, п=10) находились на лечении в отделении гематологии городской клинической больницы №13 г. Уфы. Больные с диагнозом лимфогранулематоз/ходжкинские лимфомы 11-1У стадий (ХЛ, п=10), неходжкинские
лимфомы II-IV стадий (НХЛ, n=10), рак молочной железы II-IV стадий (РМЖ, n=10) - в Башкирском республиканском клиническом онкологическом диспансере г. Уфы. Кровь здоровых людей (n=50) получали на станциях переливания крови при этих клиниках.
Чистый препарат человеческого субкомпонента комплемента - C1q был получен в Государственном научном центре РФ Гос-НИИ особо чистых биопрепаратов, Санкт-Петербург.
Были использованы полученные нами с помощью гибридомной технологии мышиные моноклональные антитела (МкАТ) к IgG человека [10-13; 15-17] и мелиттину - пептиду из яда пчелы [14], а также МкАТ, полученные в Центральном научно-исследовательском рентгенорадиологическом институте МЗ РФ, Санкт-Петербург [6].
Определение константы диссоциации (Kd) комплекса C1q-IgG проводили по разработанной методике [2, 8].
Реакцию связывания комплемента (РСК) с IgG определяли с помощью модифицированного метода [19].
Долю C1q, взаимодействующих с IgG, определяли с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). Чтобы молекулы IgG находились в ассоциированном состоянии, на первом этапе ими сенсибилизировали полистироло-вый планшет (концентрация IgG во всех образцах составляла 20 мкг/мл). В качестве источника C1q использовали смесь свежей однократно размороженной сыворотки крови здоровых лиц (n=50), раститрованной в физиологическом растворе от 1:100 до 1:12.800. Связавшиеся с IgG молекулы C1q выявляли с помощью поликлональных кроличьих антител против C1q человека. Для приготовления субстрата использовали 0,05% раствор ОФД в
0,05 М цитратном буферном растворе, содержащем 0,01% перекиси водорода. Реакцию останавливали через 30 минут 5% серной кислотой. Результаты учитывали на спектрофотометре “Reader” при длине волны 492 нм и строили график зависимости экстинкции (Е) от величины разведения сыворотки крови, выраженной натуральным логарифмом со знаком «-» (-logn).
Фиксацию комплемента (С %) ЕА рассчитывали по формуле:
С % = (Е без IgG - Е с IgG)/E без IgG^ 100 %
Лигандирование IgG осуществляли путем его инкубации с фосфатидилхолином в течение суток при +4оС в молярном соотно-
шении 1:5, после чего проводили диализ в течение пяти суток в 0,005 М фосфатном буферном растворе, рН=7,4.
Статистическую обработку результатов проводили методом вариационной статистики. Достоверность различий между группами оценивали в соответствии с критерием Стью-дента.
Результаты и обсуждение
В отличие от ^О мономеров, образующих е СЦ сильно диссоциирующий комплекс [9; 22], молекулы ^О, объединенные в кластер, обеспечивают множественность точек прикрепления СЦ, благодаря чему комплекс ^О-СЦ значительно стабилизируется [23]. Близко расположенные молекулы ^О, связанные с какой-либо поверхностью, ассоциируют друг с другом через (Ре-Ре) - взаимодействия [21], наличие которых лежит в основе модифицированной ассоциативной теории связывания комплемента [20]. Известно, что при взаимодействии белка с лигандом возможно два типа связывания: 1) когда конформация белка не меняется и Ка остается постоянной и 2) когда первая молекула лиганда увеличивает сродство белка к следующему лиганду, открывая новые центры взаимодействия. Так как в наших экспериментах Ка изменялась, мы исходили из второго типа. В таком случае метаболит - лиганд (Ь), соединяясь с ^О, открывает на нем дополнительные центры взаимодействия лиганду СЦ. Так как мономер ^О больше двух центров связывания с СЦ иметь не может, то для более наглядного сравнения количества СЦ, присоединяющегося к ^О, нужно, чтобы молекулы ^О находились в ассоциированном состоянии, при котором количество этих центров резко возрастает. При взаимодействии ^О в таком состоянии с СЦ могут образовываться различные комплексы: ^О-Ь-СЦп, ^О-Ь-СЦп+1, ^О-Ь-СЦп+2, ^О-Ь-СЦп+3 и т.д. При отсутствии связывания ^О с лигандом количество СЦ в комплексе с ^О будет меньше, и такой комплекс будет выглядеть, например, как ^О-СЦп_ь Константы диссоциации этих комплексов будут изменяться под влиянием стохастических факторов, то есть, чем больше лигандов присоединяется к ^О, тем больше диссоциация образовавшегося комплекса. Если процесс диссоциации образующихся комплексов выразить в форме реакций:
^о-С1*и ^ ^О-СЦП.2 + СЦ (као
^о-ь-с% ^ ^о-с + сц (ка2)
^о-ь-с%+! ^ ^о-ь-сцп + сц (ка3)
^О-Ь-С%+2 ^ ^О-Ь-С%+1 + СЦ (К^4)
IgО-L-C1qn+з ^ IgО-L-C1qn+2 + СЦ (Ка5), то значения констант расположатся в таком поряд-
ке: Ка5 > Ка4 > Ка3 > ка2 > каь Соответственно, количество C1q в этих комплексах будет уменьшаться следующим образом: ^О-Ь-СЦп+3 > ^О-Ь-СЦп+2 > IgО-L-Clqn+1 > ^О-L-C1qn > IgО-C1qn-1.
Следовательно, если наша гипотеза верна, то наряду с ослаблением взаимодействия между СЦ и IgО при патологии должно возрастать количество СЦ, связывающихся с ассоциированными ^О. Поэтому с помощью методов РСК и ИФА была проведена количественная оценка доли СЦ, взаимодействующей с ^О в ассоциированном состоянии, выделенных из сывороток крови больных при неопластических процессах и здоровых лиц.
3
| ^Сдон И IgGхлл |
Рис. 1. Фиксация комплемента (С %) ^О доноров (^О дон) и ^О больных хроническим лимфолейкозом (^О хлл) в растворе 0,6 М сахарозы.
По оси X - разведение сыворотки: 1 - 1/4, 2 - 1/8, 3 - 1/16; по оси У - С %: с ДО дон: 1 - 11,3±1,09; 2 - 45,5±3,41; 3 -61,1±0,56; с ДО хлл: 1 - 34,5±3,57**; 2 - 62,6±5,28*; 3 -100±8,13**.
Примечание. В сравнении с ^О дон: * - р < 0,05; ** - р < 0,001.
По РСК с сенсибилизированными рецепторами эритроцитов барана (ЕА) в присутствии ^О можно косвенно судить о количестве СЦ, связавшихся с исследуемыми ^О. Например, если наблюдается полный гемолиз ЕА, значит взаимодействия с ^О не произошло, отсутствие гемолиза, наоборот, означает полное взаимодействие СЦ с IgО. Разная степень задержки гемолиза свидетельствует о различном количестве молекул СЦ, связанных с ^О. Определение РСК в присутствии ^О, выделенных из крови больных и здоровых лиц показало, что фиксация комплемента молекулами IgО в 0,6 М растворе сахарозы, способствующей их ассоциации, при патологии происходит на 20-40% сильнее (р < 0,05 -р < 0,001), чем у здоровых доноров. В качестве примера на рис. 1 продемонстрирована разница в фиксации комплемента ^О, выделенных из сыворотки крови больных ХЛЛ и здоровых лиц. При этом константы диссоциации комплекса СЦ-^О при патологии оста-
вались более высокими, чем у здоровых доноров, что свидетельствовало об их большем взаимодействии и с другими лигандами.
Методом ИФА было обнаружено, что ассоциированные на полистироловом планшете ^О больных с неопластическими процессами связывают СЦ в 4,8-6,7 раза больше, чем ^О здоровых лиц. Так, на рис. 2 для сравнения показано определение доли СЦ, связавшихся с ^О больных ХЛЛ и здоровых лиц.
-1(^П
Рис. 2. Результаты ИФА по определению доли СЦ, взаимодействующей с ^О донора (1) и ^О больных хроническим лимфолейкозом (2, 3). По оси Х - разведение сыворотки, выраженное величиной натурального логарифма со знаком «-» (-^п); По оси У - экстинкция (Е).
Возможность взаимодействия ^О с различными низкомолекулярными факторами показана достаточно давно [4,18]. Продемонстрирована также способность ^О присоединять липидные и пептидные компоненты (фосфатидилхолин, мелиттин), что приводит к ослаблению антигенсвязывающей функции антител [1,3]. Однако не было выяснено, вызывает ли подобное взаимодействие изменения комплементфиксирующей функции ^О.
Следует заметить, что обе молекулы (фосфатидилхолин и мелиттин) имеют сходную структуру: гидрофобный «хвост», который у мелиттина сформирован преимущественно двадцатью гидрофобными аминокислотными остатками, и гидрофильную «головку », состоящую из шести положительно заряженных аминокислот у мелиттина, а также обладают свойствами поликатиона. При злокачественном росте клеток, сопровождающемся усиленной деградацией неопластических и других окружающих опухоль клеток, в кровяном русле циркулируют различные метаболиты - лиганды, имеющие в своем составе катионные компоненты, которые, подобно мелиттину и фосфатидилхолину, способны к взаимодействию с Ре-фрагментами ^О. Поэтому для подтверждения нашей гипотезы мы включили изучение влияния взаимодействия
фосфатидилхолина как модельного лиганда (одного из основных компонентов клеточных мембран) с ^О здоровых доноров на констан -ту диссоциации комплекса СЦ-^О.
В результате было обнаружено, что ли-гандирование ^О фосфатидилхолином вызывает увеличение Ы [СЦ-^О] более чем в 10 раз: с 1,6-10-7 М до 16,8-10-7 М. Наряду с этим было также показано, что происходит снижение на 30% аффинности специфических МкАТ к антигенным детерминтам в области Бе-фрагмента ^О, связанного с фосфатидилхолином.
Заключение
Таким образом, анализ полученных результатов свидетельствует о том, что снижение комплементфиксирующей функции ^О при неопластических процессах происходит за счет взаимодействия с метаболитами - ам-фифильными лигандами, количество которых при неопластических процессах значительно увеличивается вследствие повышенной деструкции опухолевых и окружающих опухоль клеток.
Сведения об авторах статьи Князева Ольга Александровна, д.б.н., доцент кафедры биологической и биоорганической химии; 450059, г.Уфа, ул. Р.Зорге, д. 24/1, кв. 34, e-mail: olga_knyazeva@list.ru
ЛИТЕРАТУРА
1. Ефетов, К. А. Конформационный переход в иммуноглобулине при взаимодействии с амфи-фильными соединениями / К.А. Ефетов, Г.В. Троицкий // Докл. АН Украины. Математика, естествознание, технические науки. - 1993. - № 1. - С. 89- 93.
2. Ефетов, К. А., Использование моноклональных антител для определения комплементфиксирующей активности иммуноглобулинов G человека в норме и при хроническом лимфолейкозе / К.А. Ефетов, О.А.Князева // Украинский биохимический журнал. - 1994. - Т.66, № 6. - С. 106111.
3. Ефетов, К.А. Изменение антигенсвязывающей функции антител в присутствии мелиттина из яда пчелы (Apis mellifera L.) / К.А. Ефетов, Н.В. Ширяев // Таврический медико-биологический вестник. - 2001. - Т. 4, № 1-2. - С. 108-114.
4. Завьялов, В.П. Регуляторные функции антител в иммуногенезе / В.П. Завьялов // Молекулярная биология. - Киев: Наук.думка, 1984. - С. 70-78.
5. Иммунологические параметры и уровень продукции цитокинов у больных с пролиферативными заболеваниями и раком молочной железы / Н.Н. Бабышкина, М.Н. Стахеева, Е.М. Слонимская [и др.] // Цитокины и воспаление. - 2006. - Т. 5, № 1. - С. 37-43.
6. Климович, В.Б. Моноклональные антитела против иммуноглобулинов человека: Автореф. дис ... д-ра мед. наук. - Санкт-Петербург, 1996. - 36 с.
7. Князева, О.А. Исследование молекулярных механизмов снижения комплементфиксирующей фиксации IgG при хроническом лимфолейкозе с помощью моноклональных антител / О.А. Князева, В.А. Вахитов // Современные проблемы естествознания на стыке наук. - Уфа, 1998. - Т. 2.
- С. 120-122.
8. Князева, О.А. Особенности взаимодействия субкомпонента комплемента C1q с IgG при неопластических процессах / О.А. Князева, Ф.Х. Камилов // Иммунология. - 2007. - № 4. - С. 231-233.
9. Механизм активации комплемента человека иммуностимуляторами из клеточных стенок бактерий / Л.В. Козлов, А.А. Зинченко, Л.С. Соляков [и др.] // Биоорганическая химия. - 1983. -Т.9, № 8. - С.1047-1055.
10.Патент РФ № 2002803, МКИ5 С 12 N 5/00, С 12 P 21/08. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L., используемый для получения моноклональных антител к IgG1,3,4 человека / К.А. Ефетов, С.Ю. Тэтин, О.А. Князева. - Опубл. 15.11.93. Бюл. 1993, № 4142.
11.Патент РФ № 2003679, МКИ5 С 12 N 5/00, С 12 P 21/08. Штамм гибридных культивируемых клеток Mus musculus L., используемый для получения моноклональных антител к IgG1,2,3 человека / К.А. Ефетов, С.Ю. Тэтин, О.А. Князева, Г.В. Троицкий. - Опубл. 30.11.93. Бюл. 1993, № 43-44.
12.Патент РФ № 2003681, МКИ5 С 12 N 5/00, C 12 P 21/08. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L., используемый для получения моноклональных антител к %-цепям IgG человека / О.А. Князева, К.А. Ефетов, С.Ю. Тэтин, Г.В. Троицкий. - Опубл. 30.11.93. Бюл. 1993, № 43-44.
13.Патент РФ № 2003682, МКИ5 С 12 N 5/00. Штамм гибридных культивируемых клеток Mus musculus L. - продуцент моноклональных антител к ^-легким цепям иммуноглобулинов человека / К.А. Ефетов, О.А. Князева, С.Ю. Тэтин, Г.В. Троицкий. - Опубл. 30.11.93. Бюл. 1993, № 43-44.
14.Патент РФ № 2003683, МКИ5 C 12 N 5/00, C 12 P 21/08. Штамм гибридных культивируемых
клеток животных Mus musculus L. - продуцент моноклональных антител к мелиттину из яда пчелы (Apis mellifera L.) / О.А. Князева, К. А. Ефетов, С. Ю. Тэтин. - Опубл. 30.11.93. Бюл.
1993, № 43-44.
15.Патент РФ N 2003686, МКИ5 С 12 N 5/00, С 12 N 5/16. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. - продуцент моноклональных антител к IgG человека / О.А. Князева, К.А. Ефетов, С.Ю. Тэтин, Г.В. Троицкий. - Опубл. 30.11.93. Бюл. 1993, № 43-44.
16.Патент РФ № 2008350, МКИ5 С 12 N 5/00, С 12 Р 21/08. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L., используемый для получения моноклональных антител к IgG человека / К.А. Ефетов, С.Ю. Тэтин, О.А. Князева. - Опубл. 28.02.94. Бюл. 1994, № 4.
17.Патент РФ № 2010856, МКИ5 С 12 N 5/00, C 12 P 21/08. Штамм гибридных культивируемых клеток Mus musculus L., используемый для получения преципитирующих моноклональных антител к IgG человека / О. А. Князева, К. А. Ефетов, С. Ю. Тэтин, Г. В. Троицкий. - Опубл. 15.04.94. Бюл. 1994, № 7.
18.Троицкий, Г.В. Спектральные проявления связывания детергентов иммуноглобулином G и альбумином / Г.В. Троицкий, П.Э., Неверодский, С.Ю. Тэтин // Докл.АН УССР. - 1991. - № 10.
- С.157-161.
19.Штельцнер, А. Реакция связывания комплемента / А. Штельцнер // Иммунологические методы. Под ред. Г. Фримеля. - М.: Медицина, 1987. - С. 73-88.
20.Burton D.R., Woof J. M. Human antibody effector function // Adv. Immunol. - 1992. - V. 51. - P. 1-84.
21.H chain C domains influence the strength of binding of IgG for streptococcal group A carbohydrate / L.J.N. Cooper, J.C. Schimenti, D.D. Glass, N.S. Greenspan // J. Immunol. - 1991. - V. 146, № 8. -P. 2659-2663.
22.Metzger, H. Effect of antigen binding on the propertiesof antibody / H. Metzger // Adv. Immunol. -1974. - V. 18. - P. 169-207.
23.The structure and function of immunoglobulin domains. IV. The distribution of some effector functions among C 2 and C 3 homology regions of human immunoglobulin G / D. Yasmeen, J.R. Ellerson, K.J. Dorrington, R. Painter // J. Immunol. - 1976. - V. 116. - P. 518-526.
УДК 617-089 Д44
© Р.З. Латыпов, В.В. Плечев, А.В. Чабин, Н.К. Сунагатуллин, 2009
Р.З. Латыпов, В.В. Плечев, А.В. Чабин, Н.К. Сунагатуллин ДИАГНОСТИКА И ХИРУРГИЧЕСКОЕ ЛЕЧЕНИЕ ХРОНИЧЕСКИХ ДИСФУНКЦИЙ ТОЛСТОЙ КИШКИ У БОЛЬНЫХ С ВИСЦЕРОПТОЗОМ
ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава», г. Уфа ГОУ ВПО ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава,
клиника БГМУ» г. Уфа
В статье отражены механизмы патогенеза, клиники и вопросы диагностики и хирургического лечения нарушений флексуральной проходимости толстой кишки у больных, страдающих висцероптозом.
Ключевые слова: висцероптоз, толстая кишка, проходимость флексур, поперечник, индекс.
R.Z. Latypov, V.V. Plechev, A.V.Chabin , N.K.Sunagatullin DIAGNOSTICS AND THE SURGICAL TREATMENT OF THE CHRONIC DISFUNCTIONS OF GUTS IN PATIENTS WITH VISTSEROPTOZ
In the article are reflected mechanisms of pathogenesis, clinic, and questions of diagnostics and surgical treatment of the disturbances of the flexures passability of thick gut in patients, who suffer vistseroptozis.
Key words: vistseroptoz, thick gut, the passability of the flexures, diameter, index.
