CC BY
36
© А.Н. Суворов1,
A.M. Савичева2,
A.B. Глушанова1, К.А. Оганян2,
К.Б. Грабовская1,
О.В. Алайцева1,
С.Л. Зациорская2,
Д. Ферретти1,0.Н. Аржанова2
НИИ экспериментальной медицины1,
Санкт-Петербург;
НИИ акушерства и гинекологии
им. Д.О. Огга РАМН2,
Санкт-Петербург
АНАЛИЗ КЛИНИЧЕСКИХ ШТАММОВ СТРЕПТОКОККОВ ГРУППЫ В НА НАЛИЧИЕ ГЕНОВ ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ АДГЕЗИНОВ, ЛОКАЛИЗОВАННЫХ НА «ОСТРОВАХ ПАТОГЕННОСТИ»
■ В работе осуществлен генетический анализ коллекции штаммов стрептококков группы В (СГВ) на наличие потенциальных генов адгезии
и агрегации. Наличие генов, обозначенных как $ярВ1 и и/>А2, в геноме СГВ проверялось посредством ПЦР и ДНК гибридизации. Установлено, что штаммы СГВ существенно отличаются по содержанию и количеству в геноме данных генов, а сами гены гетерогенны. Установлена корреляция содержания генов ирВ/ и в геноме с развитием тяжелых СГВ патологий, сопровождающихся поражением мочевых путей. Корреляции наличия исследуемых генов с определенным серотипом СГВ не было обнаружено.
■ Ключевые слова: стрептококки группы В; гены яярВ 1 и 5$рВ2; ПЦР; ДНК гибридизация
Стрептококки группы В (СГВ), впервые обнаруженные в качестве возбудителей заболеваний крупного рогатого скота, стали рассматриваться в качестве патогенов человека относительно недавно [1, 2]. Однако исследования последних лет показали, что инфекция, вызванная СГВ, является наиболее частой причиной инфекционных заболеваний новорожденных, сопровождающейся такими осложнениями, как сепсис и менингит [6, 11]. В ряде стран мира СГВ вызывают смерть новорожденных чаще, чем другие бактериальные патогены [5]. Все это обусловливает интерес исследователей как к самому возбудителю, так и к путям предотвращения инфекции, вызванной СГВ. Одной из существенных проблем СГВ патологии является высокий процент бессимптомного носительства данного микроба во влагалище у женщин, который, по разным данным, варьирует от 30 до 60 [2]. Обнаружение СГВ в ампуле прямой кишки вообще рассматривается как вариант нормы. Причины, по которым в определенных случаях в организме новорожденных развертывается специфический инфекционный процесс, неизвестны. Этим вызван интерес исследователей к изучению микробных факторов, которые способствуют возникновению заболевания. Исторически основным фактором патогенности СГВ считается по-лисахаридная капсула [7]. Доказана роль капсулы в обеспечении защиты микроба от фагоцитоза. Продемонстрирована также корреляция между принадлежностью СГВ к определенному серо-типу по капсульному антигену (чаще всего III) и частотой возникновения инфекционных процессов у новорожденных. Однако наличие капсульного полисахарида определенного типа не может объяснить причин, по которым баланс взаимоотношений паразит—хозяин сдвигается в сторону тяжелой патологии. Изучение белковых факторов патогенности СГВ, таких как бета-и альфа-антигены и С5а-пептидаза, показало, что данные факторы, при всей своей значимости в формировании вирулентного фенотипа микроба не являются определяющими, так как либо содержатся у всех представителей стрептококков группы В (как С5а-пептидаза) [3], либо с их наличием не коррелирует степень тяжести СГВ патологий (как в случае с присутствием в геноме СГВ бета-С-белка) [1].
Проведенные в начале XXI века исследования по полному сек-венированию геномов трех штаммов СГВ различных серотипов позволили обнаружить значительное количество ранее неизвестных поверхностных белков стрептококков, потенциально важных для реализации вирулентных свойств микроорганизма [8,15]. Нео-
жиданностью явилось то, что большинство генов, кодирующих синтез данных белков, локализовались на «островах патогенности» — генетических структурах, которые за счет концевых повторяющихся последовательностей могут либо перемещаться из одного участка генома в другой, либо передаваться другим микроорганизмам.
В настоящей работе приводятся данные исследования клинических штаммов СГВ, на предмет содержания в их геноме двух генов потенциальных адгезинов, расположенных на «островах патогенности» sspBl и sspB2.
Материалы и методы исследования
В исследовании анализировались клинические штаммы стрептококков группы В, выделенные из влагалища и мочи беременных женщин, различных участков кожи или абортного материала, разных локусов новорожденных детей (носоглотка, конъюнктива, подмышечные впадины, поверхность кожи вокруг пупка, кал и др.). Всего в работе исследовано 118 штаммов СГВ. Большинство клинических штаммов СГВ, использованных
в работе, были получены из клиники НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН, 7 штаммов — из коллекции отдела молекулярной микробиологии НИИ экспериментальной медицины РАМН. 9 штаммов были получены из Пражского института микробиологии (6 ин-вазивных штаммов и 3 штамма от носителей). Штамм СГВ 090R использовался в качестве положительного контроля на наличие генов sspBl и sspB2. Штаммы СГВ выращивались на кровяном агаре на основе среды Todd-Hewitt (ТН), Oxoid, США, после чего выращивались на ТН бульоне. Культивирование микроорганизмов проводилось при 37 °С.
Все проанализированные штаммы СГВ проверялись на наличие группового полисахаридного антигена, а затем серотипировались. Распределение штаммов по наиболее распространенным се-ротипам СГВ представлено в табл. 1.
Для выделения ДНК штаммы СГВ выращивались в ТН бульоне, после чего ДНК выделялась фенол-хлороформым методом по [12] либо методом экспресс-ПЦР [13]. ДНК праймеры, использованные для анализа штаммов методом по-
Таблица I
Серотипы штаммов СГВ, использованных в работе
* Источник получения штаммов Серотип I (а и в) Серотип II Серотип III Серотип V и нетипируемые штаммы
НИИ акушерства и гинекологии 1 5 3 13 1
НИИ акушерства и гинекологии 2 3 1 6 1
НИИ акушерства и гинекологии 3 6 6 9 3
НИИ акушерства и гинекологии 4 12 7 14 12
Институт микробиологии (Прага) 3 1 3 2
НИИЭМ 3 1 2 1
Итого 32 19 47 20
* — Штаммы из НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта получались в разное время и анализировались партиями
Таблица 2
ДНК праймеры, использованные для ПЦР анализа штаммов СГВ
Название праймеров Последовательность нуклеотидов 5—3 Ожидаемый размер продукта амплификации н.п.*
р420 р1202 ACAGGCCTATGAAACGAATATTAAGGTTACATCACGCAAAG 782
sspBld sspBlr GCGAACCAAGAAAAACAAAAACTTATGATTGAGTGACGAGTGGG 643
sspB2-Id sspB2-lr ACAACTACTGATGCACAAGCTGAAGCCATCCTTGTTAGGAACATAA 786
sspB2-2d sspB2-2r ATTGATGAAGCAGGTCAATCTGTTATCCATTCCCAAAATCAATC 466
sspB2-3d sspB2-3r CCATTAACAGATTG АС CTG CTTCTTATGTTGCTAACAAG GATG G CT 677
metR metD GCTTAGCTATCGCTCCTGTGATTCCTGAAACCAAAGAGGTCATT 503
tralr trald AGCGATTCTTTCTCCTTCCCGCAGAAAGTCTTGGTCCAGC 255
* — При расчетах размеров ПЦР продуктов указаны данные, соответствующие нуклеотидной последовательности генома штамма ЫЕМ 316 ¡8]
лимеразной цепной реакции, представлены в табл. 2. ПЦР проводилась в аппаратах MJ Research (США) или Perkin Elmer (США) при условиях оптимизированных для каждой пары прай-меров.
Результаты ПЦР оценивались после электрофореза в 1,2%-м агарозном геле в ультрафиолетовом освещении. Для документации результатов и обработки изображений пользовались системой видеозахвата UVP, (США) и программой Digi Doc-It.
Для подтверждения результатов ПЦР осуществлялась ДНК гибридизация с зондами, полученными на основе ПЦР продуктов контрольной ДНК СГВ, помеченных дигоксигенином (La Roche, США). Перенос ДНК на фильтры и постановка гибридизации осуществлялась по [12].
Результаты и их обсуждение
Появление электронных банков данных нукле-отидных последовательностей геномов микроорганизмов в последнее десятилетие обеспечило прорыв в понимании строения бактериальных и вирусных геномов. Появились и принципиально новые подходы к изучению механизмов патогенеза инфекционных заболеваний, основанные на знании структуры генома. Однако с появлением огромного массива новых данных о генетических структурах бактерий, принципиальных изменений в понимании ключевых звеньев патогенеза не произошло. Причина данного явления состоит в существовании пропасти между наличием информации в электронных банках данных и доказательствами ее биологической значимости. Данная ситуация вполне применима по отношению к исследованиям патогенеза заболеваний, вызванных стрептококками группы В. В банке данных нуклеотидных последовательностей GenBank в настоящее время присутствует информация о полных нуклеотидных последовательностях штаммов СГВ серотипа III NEM316h серотипа V 2603 [8, 15]. Имеется также частичная информация о геноме штамма первого серотипа 0909. За три года с момента публикации данных секвенирования
1 2 3 4 5 6
-1-1-1-1-—\-Н^
k- -i к-
643 889
sspB lrd р420-р1202
sspB 1 5.8 т.п.н.
Рис. 1. Схема локализации ДНК праймеров на последовательности генов sspBl и sspB2
концепция основных факторов патогенности СГВ не изменилась. Все так же основным фактором патогенности СГВ считается полисахаридная капсула, а из белковых факторов выделяют С5а-пептидазу, бета-гемолизин, альфа- и бета-С-про-теины [10]. При этом данные выводы о факторах патогенности никак не соотносятся с клинико-эпидемиологическими исследованиями, посвященными изучению заболеваний, вызванных различными штаммами СГВ. В частности, широко известно, что наибольшее количество заболеваний новорожденных обусловлено III серотипом СГВ. При этом среди штаммов данного серотипа не обнаруживается бета-С-про-теин [10], а С5а-пептидаза идентична таковой в СГВ других серотипов. Все это обусловливает необходимость поиска новых потенциально значимых факторов патогенности, значение которых в формировании эпидемически актуальных штаммов еще не исследовалось. В работе, посвященной секвенированию генома СГВ серотипа V [15], проводилось исследование экспрессии поверхностных белков СГВ. В результате было обнаружено более 300 белков, многие из которых кодируются генами, локализованными на так называемых «островах патогенности».
Задачей настоящего исследования явилось изучение клинических штаммов СГВ на предмет присутствия в геномах двух генов потенциальных адгезинов, условно обозначенных sspBl и sspB2. Ген sspBl был первоначально обнаружен нами в геноме штамма 090R в результате анализа вычитающей библиотеки генов СГВ [14]. Причиной выбора данного гена и гена sspB2 для молекулярно-эпидемиологического анализа, а также их обозначения, явился тот факт, что обнаруженные белки СГВ гомологичны белкам SspA, и SspB S. gordonii [4]. Позднее было выяснено, что данные белки также гомологичны широкому спектру бактериальных адгезинов и факторов аггрегации: SpaP S. mutans, SpaA, S. sobrinus, поверхностному адгезину А, белкам Asal и ASP1 E.faecalis, РРаА S. criteri, Pas S. intermedius и ряду других белков. Учитывая важность процесса адгезии в инициации инфекционного процесса, наличие разнообразных адгезинов может быть критичным для распространения СГВ, которые помимо ампулы прямой кишки и влагалища в ряде случаев способны колонизировать уретру, мочеточник, ротовую полость и конъюнктиву. Другой, не менее важной особенностью адгезинов, гомологичных анализируемым белкам СГВ, является их участие в формировании секреторных путей V типа. Данный тип секреторных путей у ряда микроорганизмов участвует в активном транспорте биологических молекул
возбудителя (в первую очередь токсинов) в организм хозяина [9]. Анализ нуклеотидной последовательности генома СГВ ЫЕМ 316 позволил обнаружить одну копию гена .чзрВ/ и 3 копии БзрВ2. В геноме штамма серотипа V 2603 обнаруживалась только одна копия гена ззрВ2 и отсутствовал Учитывая возможное наличие гетерогенности отдельных областей генов $5рВ1 и $$рВ2, для получения объективной картины ПЦР были использованы 2 пары праймеров, соответствующих гену ,м/?7?7, и три пары праймеров, соответствующих гену (рис. 1).
Проведенный анализ позволил установить, что из общего количества штаммов СГВ ген ллрй/ был обнаружен в 24 (20,3 %) штаммах из 118, а ген 55/7^2в 61 (51,6 %) штамме. При этом частота обнаружения данных генов мало зависела от серотипа СГВ. Ген 7 с одинаковой частотой (28 %) обнаруживался в штаммах серотипов I и III и несколько реже среди нетипируемых штаммов
и штаммов серотипа II. Наибольшая частота обнаружения гена sspB2 была отмечена в штаммах серотипа III (58 %), однако, учитывая тот факт, что в ряде случаев микробный материал был выделен из различных участков одного и того же пациента, данные отличия скорее характеризуют тенденцию, чем истинную корреляцию определенного серотипа СГВ с наличием исследуемых генов. Применение группы праймеров в данном исследовании основывалось на предположении, что гены предполагаемых адгезинов характеризуются гетерогенностью. Данное предположение подтвердилось полностью. Так, например, при анализе первой партии штаммов из НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН с обеими парами праймеров на ген sspBl, выбранными для анализа, прореагировали лишь 2 штамма из 16 положительных, а со всеми тремя парами праймеров на ген sspB2— только 5 из 28. При этом в результате амплификации с праймерами на ген
Таблица 3
Штаммы СГВ из 1-й партии штаммов НИИ акушерства и гинекологии, содержащие ген
№ № в коллекции Праймеры SspB 2-1 Размер ДНК фрагмента Праймеры SspB 2-3 Размер ДНК фрагмента Праймеры SspB 2-2 Размер ДНК фрагмента
1 090 R + 600, 780 + 670 + 460
2 10244-д1 + 600 + 670 + 460
3 7129эн + 600 + 670 + 460
4 277 + 600 + 670 + 460
5 11471-д1 + 600, 780 + 670 + 460
6 92-эн + 600 + 670 -
7 11806 + 780 + 670 -
8 3540-д2 + 600, 780 + 670 -
9 10470-Д1 + 600, 780 + 600 -
10 11982 + 780 + 900, 670, 300 -
11 12583-дI + 600, 780 + 900, 670, 300 -
12 10270-Д1 - + 670 + 840
13 11360 - + 670 + 460
14 Зсек + 600 - -
15 238 + 600 - -
16 7293 + 600 - -
17 273 + 600 - -
18 12243-д1 - - + 460
19 3751 - - + 460
20 4306-до - + 900, 700, 300 -
21 3445-д1 - + 900, 700, 300 -
22 123376-д1 - + 670 -
23 714-Д1 - + 670 -
24 7130эн - + 600 -
25 11312-д1 - + 670 -
26 7380 - + 670 -
27 7294 - + 670 -
28 1828 - + 670 -
isspB 2-3 I
-i U-
U--1 I-
sspB 2-1 sspB 2
sspB 2-2 4.3 т.п.н.
Рис. 2. Гибридизация ДНК зонда, полученного в результате ПЦР с геном sspB2 (праймеры SspB2-J'1) с хромосомыми ДНК СГВ различных серотипов после гидролиза хромосомных эндонуклеазой EcoRI. ДНК зонд метили дезоксигенином La Roche, США. Детекцию фрагментов осуществляли при помощи набора Genius, La Roche. Треки 1, 2, 3, 4 соответствуют участкам нанесения хромосомных ДНК II, III, IHR и IV серотипов
Рис. 3. ДНК гибридизация хромосомной ДНК СГВ различных серотипов, гидролизованной эндонуклеазой E.coRl с геном sspB2. Номера треков (1, 2, 3, 4) соответствуют нанесенным ДНК СГВ 11, III, IHR и IV серотипа. В качестве ДНК зонда использовался ПЦР продукт амплификации ДНК СГВ 090R с праймерами sspB2-3rd
мрВ2 во многих случаях образовывалось более одного фрагмента ДНК, отражающих присутствие нескольких копий данного гена (табл. 3).
Данное наблюдение также подтвердили и результаты гибридизации, указывающие на наличие нескольких копий данного гена в геноме (рис. 2,3).
Наиболее интересной частью исследования явилось сопоставление диагноза и места выделения СГВ с частотой присутствия генов в геноме. Оказалось, что из штаммов, выделенных из мочевых путей или мочи, 38 % содержали ген sspBl и 63% содержали ген sspB2, что существенно превышало частоту выделения штаммов, полученных от носителей. Единственный штамм СГВ, выделенный из фасций (предположительно «некротический фасциит»), содержал в геноме оба исследуемых гена. Аналогичная тенденция наблюдалась и при анализе штаммов, полученных из Чехии. Гены sspBl и sspB2 обнаруживались только в случае инвазивных штаммов, выделенных из крови, и в одном случае при выделении с конъюнктивы.
Полученные результаты анализа клинических штаммов СГВ позволяют сделать предположение о неслучайном характере распределения генов потенциальных адгезинов СГВ sspBl и sspB2, а также о возможной роли белковых продуктов данных генов в процессе «освоения» условно-патогенным паразитом, к которым относится СГВ, новых экологических ниш в человеческом организме. В этой связи представляется целесообразным более детальное исследование пациентов — носителей СГВ на предмет содержания в геноме данных потенциальных генов патогенности.
Литература
1. Adderson Е.Е., Takahash S., WangY.etal. Subtractive hybridization identifies a novel predicted protein mediating epithelial cell invasion by virulent serotype III group В Streptococcus agalactiae // Infect. Immun. - 2003. -Vol.71. - P. 6857-6863.
2. Bake C.J. and Edwards M.S. Group В streptococcal infection. In Infectious diseases of the fetus and the newborn infant // Remington J.S. and Klein J.O. eds. (Philadelphia: W.B. Saunders Company). - 1995. -P. 980-1054.
3. Chmourygina I., SuvorovA.N., Ferrieri P. et al. //Infect. Immun. - 1996. - Vol. 64. - P. 2387-2390.
4. Demuth D.R., DuanY., Brooks W. et al. Tandem genes encode cell-surface polypeptides SspA and SspB which mediate adhesion of the oral bacterium Streptococcus gordonii to human and bacterial receptors // Mol. Microbiol. - 1996. - Vol. 20. - P. 403-413.
5. EmbletonN., WariyarU., HeyE.etal. Mortality from early onset group В streptococcal infection in the United Kingdom // Arch. Dis. Child. Fetal Neonatal. Ed. - 1999. -Vol. 80. - P.139-141.
6. Gardam M.A., Low D.E., Saginur R.etal. Group В streptococcal necrotizing fasciitis and streptococcal toxic shock-like syndrome in adults // Arch. Intern. Med. -1998. - N 24. - Vol. 158. - P. 1704-1708.
7. Gibson R.L., Lee M.K., Soderland C.etal. Group В streptococci invade endotelial cells: type III capsular polysacharide attenuates invasion // Infect. Immun. -1993. - Vol. 61. - P. 478-485.
8. Glaser, RusniokC., Buchrieser C. et al. Genome sequence of Streptococcus agalactiae, a pathogen causing invasive
neonatal disease // Molec. Microbiol. - 2002. -Vol. 45. - P. 1499-1514.
9. Henderson I.R., Navarro-García F., Desvaux M.etal. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. - 2004. - Vol. 68. - P. 692-744.
10. KongF., GowanS., Martin D. etal. Molecular profiles of group B streptococcal surface protein antigen genes: relationship to molecular serotypes // J. Clin. Microbiol. -2002. - Vol. 40. - P. 620-626.
11. Lukacs S.L., Schoendorf K.C., Schuchat A. el al. Trends in sepsis-related neonatal mortality in the United States, 1985-1998 // Pediatr. Infect. Dis. J. - 2004. - Vol. 23. -P. 599-603.
12. ManiatisT., Fritsch E.F., SambrookJ. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. - Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor: NY, 1982. - P. 1-545.
13. SuvorovA.N., SverdlovaA., TotolianA.A.etal. //Med. Microbiol. Lett. - 1996. - Vol. 4. - P. 341-345.
14. SuvorovA.N., FerrettiJ.J. Construction of a GBS-GAS DNA subtraction library allows discovery of previously unidentified GBS genes and rapid location of unique regions on the GBS chromosome // J. Basic Microbiol. - 2004, - Vol. 44. -
P. 66-74.
15. TettelinH., MasignaniV., Cieslewicz M.J. et al. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2002. - Vol. 99. - P. 12391-12396.
THE ANALYSIS OF GROUP B STREPTOCOCCAL CLINICAL STRAINS FOR THE PRESENCE OF THE GENES ENCODING FOR POTENTIAL ADHERENCE FACTORS AND LOCALIZED ON THE «PATHOGENICITY ISLANDS»
SuvorovA.N., Savicheva A.M., Glushanova A.V., Oganyan K.A., Grabovskaya K.B., Zatsiorskaya S.L., Alaiceva O.V., Ferretti J., Arjanova O.N.
■ Summary: The collection of group B streptococcal clinical strains has been analyzed for the presence of genes encoding for putative adherence and aggregation factors. The presence of the genes designated as sspBl and sspB2 were tested by PCR and DNA hybridization. The genes under study located in GBS genome on "pathogenicity islands" were found to be heterogeneous and could be associated with urological or invasive diseases. No significant correlation between the GBS serotype and sspB genes pattern have been discovered.
■ Key words: group B streptococci; sspBl and sspB2genes; PCR; DNA hybridization
