CC BY
23
https://doi.org/! 0.1 7116/molgen20193701142
Анализ иммуномодулирующих белков вируса африканской чумы свиней
М.В. НЕФЕДЬЕВА, И.А. ТИТОВ, К.А. МИМА, А.С. МАЛОГОЛОВКИН
ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр вирусологии и микробиологии»,
601125, пгт. Вольгинский, Владимирская область, Россия
Молекулярная эпидемиология вирусных инфекций традиционно основывается на анализе изменений отдельных генов или генетических маркеров. Анализ генов вируса африканской чумы свиней (АЧС), кодирующих иммуномодулирующие белки является важным инструментом изучения разнообразия и эволюции вируса. В данной работе мы провели структурный и филогенетический анализ иммуномодулирующих белков 5el (ген A238L), i14l (ген DP71L), kill (ген I329L) вируса АЧС. Степень нуклеотидных замен конкатенированных генов A238L, I329L и DP71L вируса АЧС выявила очищающий (стабилизирующий) отбор на уровне нуклеотидных последовательностей. Характеристика вариабельности отобранной нами группы генов вируса АЧС представляет большой интерес для поиска генетических различий в иммуномодулирующих белках. Результаты секвенирования генов A238L, I329L и DP71L и их филогенетический анализ показали, что эти гены являются консервативными среди большой группы генов вируса АЧС. Ген I329L является генетическим маркером общности происхождения. Ген DP71L у восточноафриканских штаммов X генотипа имеет две формы: длинную (184 аминокислоты) и краткую (от 70 до 72 аминокислот) и образуется путем слияния 13L и 14L. Все российские изоляты вируса АЧС, выделенные в 2016—2017 гг., по изученным генам идентичны референтному штамму ASFV/Georgia/wb/2007. Характеристика вариабельности белков 5el, i14l, k111 может послужить выявлению таргетных участков в геноме вируса АЧС и для разработки вакцин. Полученные данные позволяют оценить генетическое разнообразие иммуномодулирующих белков вируса АЧС и динамику их эволюции, предсказать возможное участие генов A238L, I329L и DP71L в вирулентности различных штаммов вируса АЧС.
Ключевые слова: вирус африканской чумы свиней, секвенирование, филогенетический анализ, иммуномодулирующие белки, анализ синонимичных и несинонимичных замен.
Analysis of the african swine fever virus immunomodulatory proteins
M.V. NEFEDEVA, I.A. TITOV, K.A. MIMA, A.S. MALOGOLOVKIN
Molecular Virology Laboratory Federal Research Center for Virology and Microbiology, 601125, Russia
Molecular epidemiology of viral infections traditionally based on the analysis of changes in individual genes or genetic markers. The analysis of the African swine fever virus (ASFV) genes encoding immunomodulatory proteins is an important tool for studying the diversity and evolution of the virus. In this work, we carried out a structural and phylogenetic analysis of the ASF virus immunomodulatory proteins 5el (A238L gene), i14l (DP71L gene), k111 (I329L gene). The degree of nucleotide substitutions of the ASFV concatenated genes A238L, I329L and DP71L revealed purifying (stabilizing) selection at the nucleotide sequences level. The variability characteristic of the selected group of ASFV genes is of great interest for the genetic differences search in immunomodulatory proteins. The sequencing results of the A238L, I329L and DP71L genes and their phylogenetic analysis showed that these genes are conservative among a large group of ASFV genes. The I329L gene is a genetic marker of common origin. The East African strains (Genotype X) of DP71L gene have two forms: a long (184 amino acids) and a short (from 70 to 72 amino acids) and is formed by fusion of the 1 3L and 14L. All ASF virus Russian isolates isolated in 2016—201 7 were identical to the reference strain ASFV/Georgia/wb/2007. Characterization of variability 5el protein, i14l, k111 may be serve to identify target sites in the ASFV genome and to develop vaccines. The obtained data allow to evaluate the genetic diversity of the ASFV immunomodulatory proteins and the dynamics of their evolution, to predict the possible participation of the A238L, I329L and DP71 L genes in the virulence of various ASFV strains.
Keywords: african swine fever virus, sequencing, phylogenetic analysis, immunomodulating proteins, analysis of synonymous and nonsynonymous substitutions.
© Коллектив авторов, 201 9
Для корреспонденции: Малоголовкин Александр Сергеевич, канд. биол. наук, заведующий лабораторией молекулярной вирусологии ФГБНУ Федерального исследовательского центра вирусологии и микробиологии, заместитель директора; e-mail: malogolovkin@ inbox.ru
For correspondence: Alexander S. Malogolovkin, PhD of Biological Sciences, Head of the Molecular Virology Laboratory Federal Research Center for Virology and Microbiology, Associate Director; e-mail: [email protected]
Введение
Африканская чума свиней (АЧС) — геморрагическая смертельная болезнь домашних свиней и кабанов, вызванная сложным оболочечным дезоксивирусом семейства As-farviridae. Смертность в инфицированных стадах достигает 100%. Заболевание передается от больных животных и вирусоносителей алиментарным, контактным путем и трансплацентарно [1]. Геном вируса АЧС представляет собой линейную двухцепочечную молекулу ДНК с ковалент-но закрытыми концами и терминальными инвертированными повторами (TIR) [2].
К вирусу АЧС восприимчивы домашние свиньи всех возрастных групп и пород и кабаны. Среди африканских представителей семейства Suidae, дикие африканские и кустарниковые свиньи, бородавочники, могут быть инфицированы вирусом АЧС, но при этом не проявлять клинических признаков. Основным резервуаром вируса в дикой природе в странах Восточной Африки являются мягкие клещи рода Ornithodoros [3].
В зависимости от штамма вируса, вирулентности и способа заражения, наблюдаемые клинические признаки разнообразны в сверхострой, острой, подострой и хронической формах инфекции [4]. Эпидемиология АЧС является весьма сложной и варьирует в зависимости от географических особенностей местности и восприимчивых видов животных (кабан, домашние свиньи, клещи) [3].
Эффективных средств защиты против вируса АЧС до настоящего времени не разработано. Исторические попытки защитить животных инактивированными вакцинами либо потерпели неудачу, либо дали противоречивые результаты. Исследования с использованием аттенуированных вакцин продемонстрировали их потенциал для защиты свиней от экспериментальной инфекции гомологичным вирулентным вирусом, но редко, против гетерологичных вирусов [5— 7]. Изучение антигенного разнообразия среди встречающихся в природе изолятов вируса АЧС представляет огромный интерес для разработки вакцин [8].
Недавние исследования указывают, что генетическое разнообразие вируса, определенное путем секвенирования основного белка капсидаp72 (ген B646L), самое высокое в Центральной и Восточной Африке [3]. Высокий уровень генетической вариабельности вируса АЧС между различными изолятами объясняется разницей в размере генома, однако большая часть генетической вариации обусловлена изменениями числа и последовательности членов муль-тигенных семейств (MGF), расположенных на обоих концах генома, где они ограничивают левую и правую вариабельные области (LVR и RVR, соответственно) [9].
Геном вируса АЧС содержит набор генов, кодирующих протеины ответственные за механизмы иммунной эвазии. Диапазон модуляционной активности вирусных протеинов весьма разнообразен и включает в себя: ингибирова-ние гуморального ответа, интерференцию с интерферона-ми, ингибирование цитокинов и хемокинов, уклонение от цитотоксических Т-лимфоцитов (CTLs) и природных клеток-киллеров (NKs), и управление функцией главного комплекса гистосовместимости (MHC I и II), изменение эф-фекторной функции дендритных клеток и ингибирование апоптоза [10].
Вирус АЧС является макрофаготропным вирусом и может манипулировать как врожденным, так и адаптивным иммунным ответом, модулируя функции макрофагов. Согласно L. Dixon и соавт., было идентифицировано несколь-
ко белков вируса АЧС, которые препятствуют развитию иммунной защиты хозяина [11]. К ним относятся ген A238L, кодирующий белок 5el, который выступает ингибитором активации транскрипции иммуномодулирующих генов хозяина, белок k111 (ген I329L), действующий как ингибитор сигнальных путей Toll-подобных рецепторов и белок i 141 (ген DP71L), сходный с ICP34.5 фактором ней-ровирулентности герпесвируса, регулирующий фосфатаз-ную активность клетки-хозяина при инфицировании, вытесняя ингибирующие субстраты из фосфатазы хозяина PP1 и определяющий круг чувствительных хозяев [12—14]. Кроме того, A238L ингибирует зависимые от кальценей-рина пути хозяина путем непосредственного связывания кальценейрин фосфатазы [14].
Однако не все известные изоляты вируса АЧС обладают одинаковой иммуномодулирующей активностью [15]. Генетические предпосылки данных различий остаются невыясненными. Таким образом, обнаружение генетических маркеров эволюционной изменчивости в иммуномодулирующих белках вируса АЧС позволит изучить механизмы иммунного уклонения при АЧС.
Цель исследования — провести сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов A238L, I329L и DP71L вируса АЧС, участвующих в иммунном уклонении.
Материал и методы
На первом этапе проведен анализ вариабельности белков 5e1, k111 и i141 при помощи веб-сервиса Protein Variability Server методом Симпсона (http://www.expasy.org/ proteomics) [16]. Вариабельными считались области, для которых полученные значения превышали пороговое (0,46). Для предсказания наличия и расположения сайтов расщепления сигнального пептида в аминокислотных последовательностях использовали веб-сервер SignalP 4.1. (http://www.cbs.dtu.dk/services/Signa1P-4.1) [17]. Веб-приложение CCTOP (Constrained Consensus TOPology prediction server) обеспечило прогнозирование трансмембранной топологии белков (http://cctop.enzim.ttk.mta.hu) [18].
На следующем этапе работы из Государственной коллекции микроорганизмов ФГБНУ ФИЦВиМ были отобраны 12 изолятов, выделенные из разных регионов Российской Федерации в 2016 г., и 15 штаммов, принадлежащих к различным генотипам [19, 20] и сероиммунотипам вируса АЧС [21]. Для каждого сероиммунотипа использовали аттенуированный и вирулентный штаммы вируса АЧС, указанные в таблице.
Подбор праймеров для амплификации копий генов A238L, I329L и DP71L осуществляли с помощью сравнения и анализа нуклеотидных последовательностей этих генов штаммов и различных изолятов вируса АЧС, опубликованных в международной базе данных GenBank (http://www. ncbi.nlm.nih.gov/) с помощью программ BioEdit 7.0.1, Oligo 6.0. и веб-сервера IDT DNA (https://eu.idtdna.com/site).
Выделение ДНК из крови и суспензии органов проводили набором ДНК-сорб-B («Интерлабсервис», Россия), в соответствии с инструкцией производителя. Для оптимизации температурных режимов ПЦР и амплификации последовательностей генов использовали термоциклер T100 («Bio-Rad Laboratories», США).
Анализ продуктов реакции осуществляли при помощи электрофореза в 1,5% агарозном геле и учитывали на ChemiDoc MP («Bio-Rad Laboratories», США) путем обнаружения специфических полос в треках с исследуемыми
Штаммы вирусов АЧС, использованные в работе
Штамм/изолят Страна Год выделения Генотип Сероиммунотип A238L 1329L DP71L
Лиссабон-57 (Л-57) Португалия 1957 I 1 MG209277 MG209292 MF589625
ЛК-111 Португалия 1978 I 1 MG209278 MG209293 MF589627
Конго-49 (K-49) Заир 1949 I 2 MG209275 MG209290 MF589624
KK-262 Заир — I 2 MG209276 MG209291 MF589626
Франция-32 (Ф-32) Франция 1964 I 4 MG209272 MG209288 MF589621
ФК-32/135 Франция Пассирован от Ф-32 I 4 MG209273 MG209289 MF589622
CKA-2015 Россия Пассирован от Ставрополь 01/08 II 8 MG010372 MG209287 MF589620
Иркутск-2017 Россия 2017 II 8 MG209274 — MF589623
Мозамбик-78 Мозамбик 1978 V 3 MG209279 MG209294 MF589628
(М-78)
MK-200 Мозамбик Пассирован от М-78 V 3 MG209280 MG209295 MF589630
ТКФ Танзания — X 3 MG209282 MG209297 MF589631
ТСП-80 Танзания Пассирован в 1980 г. X 5 MG209285 MG209300 MF589634
ТСП-80/300 Танзания — X 5 MG209286 MG209301 MF589635
ТС-7 Танзания Пассирован в 1984 г. X 6 MG209283 MG209298 MF589632
ТС-7/27-230 Танзания Пассирован в 1986 г. X 6 MG209284 MG209299 MF589633
Наньюки Кения 1960 8 MG209281 MG209296 MF589629
Липецк-2016 Россия 2016 II 8 — — —
Тамбов-2016
Москва-2016
Пенза-2016
Псков-2016
Воронеж-2016
Архангельск-2016
Курск-2016
Краснодар-2016
образцами относительно фрагмента маркера молекулярного веса и расчетного значения длины ПЦР-продукта. Очистку ПЦР-продуктов из агарозного геля осуществляли коммерческим набором QIAquick Gel Extraction (QIAGEN) и Cleanup-standard («Евроген», Россия). Сиквенсовую реакцию проводили набором Bigdye terminator v3.1 cycle sequencing kit («Applied Biosystems», США). Для проведения секвенирования использовали секвенатор Genetic Analyzer 3130 («Applied Biosystems», США).
Множественное выравнивание последовательностей генов вируса АЧС выполнено с помощью вариантов метода ClustalW и MUSCLE [22]. Для построения филогенетических древ применяли метод максимального правдоподобия с дополнительным бутстрэп-анализом 1000 случайных выборок с использованием программы Mega 6.0 [23].
Для анализа синонимичных (синонимичная дистанция, dS) и несинонимичных замен (несинонимичная дистанция, dN) на сайт в генах A238L, I329L и DP71L, а также числа потенциально синонимичных и несинонимичных сайтов для каждого кодона на основании гипотезы о равных частотах всех нуклеотидных замен использовали пакет программы SNAP (Synonymous Non-synonymous Analysis Program) (www.hiv.lanl.gov).
Результаты и обсуждение
Результаты анализа вариабельности белков 5el, i14l и kl 1l различных штаммов вируса АЧС показали, что у белка 5el наблюдается 13 вариабельных сайтов, часть из которых располагается в участке IxB — подобного домена, со-
стоящего из 3 повторов анкиринов (с 87 по 178 аминокислоту) и на С-терминальном конце мотива Рх1х1ТхС^, который связывает каталитическую субъединицу кальце-нейрина — серинтреонин фосфатазу (с 200 по 213 аминокислоту) (рис. 1). Повторяющиеся белки анкирины, хотя и отсутствуют в большинстве вирусов, но также распространены и среди поксвирусов. Консервативные аминокислотные остатки анкиринов имеют решающее значение для фолдинга и стабильности белка, а также участвуют в присоединении других белков к разным участкам клеточной мембраны [24].
Анализ белка I14L показывает, что этот белок консервативен среди различных штаммов вируса АЧС, однако имеет 7 вариабельных сайтов. Все белки, кодируемые этим геном, содержат центральную область с высококонсервативным 56 аминокислотным доменом и мотивом PP1c_bdg (с 7 по 57 аминокислоту в короткой форме и со 123 по 170 аминокислоту в длинной форме) регуляторных субъединиц (15А и 15 В) белковой фосфатазы 1, расположенных на карбоксильном конце, общих для MyD116 и 1СР34.5. Этот консервативный С-конец, по-видимому, является связующей областью каталитической субъединицы протеинфос-фатазы-1 (РР1С), которая обнаружена как в вирусе простого герпеса, так и у мышей и человека [25].
Высокогликозилированный белок к111, экспрессиру-емый в клеточной мембране и на ее поверхности, содержащий лейцин-богатые повторы похожие на TLR3, является консервативным и не имеет выраженной вариабельности. Для него наблюдается лишь 8 вариабельных сайтов, часть из которых попадает во внеклеточный топологический до-
Рис. 1. Результаты анализа вариабельности белков 5el — IkB гомолога и ингибитора кальций нейрин фосфатазы; i14l -белка, сходного с HSV ICP34.5 фактором нейровирулентности; kill — белка ингибитора передачи сигналов TLR.
мен (с 17 по 239 аминокислоту), а также во внутриклеточный топологический домен (с 261 по 329 аминокислоту). Трансмембранный участок белка находится на С-конце (с 240 по 260 аминокислоту) (см. рис. 1).
В результате наблюдений D. Chapman и соавт. белки 5el и i 141 отнесены к вариабельным, в работе V. de Oliveira и соавт. белок k111 — консервативный, а в работах J. Nei-lan и соавт. и C. Abrams и соавт., напротив, белок 5e1 признан консервативным [12, 26—28]. Согласно результатам наших исследований (см. рис. 1), изученные белки вируса АЧС являются консервативными, особенно в сравнении с другими вариабельными белками вируса АЧС (CD2 p54) [29].
Для того чтобы определить генетическую связь на уровне нуклеотидных последовательностей между штаммами и изолятами вируса АЧС, мы провели секвенирование и множественное выравнивание конкатенированного набора генов A238L, I329L и DP71L.
По результатам секвенирования гены A238L и I329L изолятов вируса АЧС, выделенных на территории Российской Федерации в 2016 г., являются идентичными роди-
тельскому штамму Georgia_2007/1, который является представителем II генотипа.
Согласно полученным результатам по гену I329L, мы можем разделить имеющиеся изоляты на 5 основных кластеров, которые коррелируют с их генотипами (рис. 2). В первый кластер входят штаммы из Юго-Восточной Африки V генотипа, 3-го и 7-го сероиммунотипов, полногеномные изоляты Warthog и Pretorisuskop/96/4, XIX и XX генотипов, 2-го сероиммунотипа. Второй кластер состоит из представителей РФ II генотипа 8-го сероиммунотипа. В отдельный кластер попадают штаммы I генотипа 2-го сероиммунотипа. Четвертый кластер составляют штаммы и изоляты европейского происхождения 1-го и 4-го сероиммунотипов, за исключением изолята Benin 97/1 африканского происхождения, принадлежащих I генотипу. В пятый кластер были отнесены штаммы и изоляты X генотипа, выделенные на территории Танзании и Кении, а также некоторые представители VIII и IX генотипов. Изоляты из Южной Африки и Португалии с неопределенным и 2-м сероиммунотипом, не входили ни в одну из групп перечисленных кластеров.
99 |
етПд
(ASF_straiг_М-7S_SG3 Ц. jj ASF strain MK200 3G3 »
gi|33772324|gh|AY261364.1 LASFJsolate^Tangani„62_complete_ganame_SG7 4- V gij 33772323|яЬ| AY261363.1 LASF_vims_isolata_Pretorjsu5kop/96/4_complete_genonne_SG2
ijS
gi|33772326|gb|AY2$1366.1 |_ASF_vira5_isolate_Warthog_complele_genome_S<S2 ASF strain А4С2/Эк-33 SG6 • "|
gi|303398Sei_ASF_Georgia_2007?1_coniplete_genome_SG8 III Ц ASF_strain_!rkutsk_SG8 J
gi133772322|gb| AY261362.1 |_ASF _i sclate_Mkuzt_1 Э7Э_соп*> lata_0B-ic.rrB_3G? gi133772326|gb|AY26.1366.1 |_ASF_iso)ate_Warmbaths_comp Ib te_ga n oma _SG ? ■ASF_strain_L-67_SG1 ' .. ASF strain_LK-111_SG1 "V Л ASF_strain_K-49_SG2 — ASF_strain KK-262 SG2
M
IV
Г ASF_5train_F-32_SG4
g if 162849383_ASF_OU RT_88/3J aviruie nt_f ia id_iso late )_ca mpl ete_ge no me - ASF_s«rai n_FK-32/136_SG4 •
g i 116284$209_ AS F_B e ni n_371_pat hoge n ic_i so late_co mp te te _ge n ошэ _S G 4 gb|KM2$2846.1_ASF_strain_NHV_complete_genome '' gb|KP0SS815.1_ASF_strain_SA71_partial_genome_SG4 Ч- jj gi|723456162_ASF_strain_BA71V_ooirplate_genome_SG4 Ч У gi|23128S440_ASF_strain_E7S_compiete_ganome_504 J \ gb|KM262B44.1 ASF strain L6D со ma lets ganoms 3G4 Ч V AS F_strai n_TS P80/300_SG 5 •
gi|13028344|gb|AF 327842.1 |_ASFJso late_Mal awi_Lil -20/1 _co mplete_0e no me_SG 8
• Cell culture adapted to ASFV strains
ty ASFV strains isolated from pigs
ASFV strains isolated from ticks
ASFV strains isolated from warthog
у b: К M111295 1 _ A3F_v nj s_strai n_Ke n 06. Bu s cu mp I e te_£e no me .. Эb¡KM 111294.1 _ASF_strain_Kan06 ГГ k1_o omp;ete genome ^Jrty ASF_strain_TS7-2 7-230 SG6 # ASF_strain_TS7„SG6 • A5F_strai n_N a n u ki_SG 6
gi|33772320|gb|AY261360.1 LASF_isotate_Kenva_1360_complete_genome_SG6 Ч V ASF_strain_TKF_SG3 • ASF strain TSP80 SGE •
m
Рис. 2. Филогенетическая дендрограмма, построенная методом максимального правдоподобия на основе конкатенированных нуклеотидных последовательностей 15 штаммов 7 сероиммунотипов вируса АЧС.
В легенде указаны штаммы и изоляты: ¿у. ^ — выделенные от свиней, — клещей, ¡у^ — бородавочников и щ — адаптированные к культуре клеток.
Интересен факт, что у 6 восточноафриканских штаммов X генотипа (ТКФ, Наньюки, ТСП-80, ТСП-80/300, ТС-7, ТС-7/27-230), как у полногеномных изолятов Ken05/ Tk1, Kenya 1950, Malawi Lil-20/1 и штамма Ken06.Bus, ген DP71L образуется путем слияния 13L и 14L. Для примера, результаты детекции продуктов амплификации 2 форм гена DP71L показаны на рис. 3. Результаты наших исследований подтверждают ранее полученные данные R. Bishop и соавт. [30].
Ранее проведенные исследования показали, что методика конкатенированных генов может разрешить неоднозначности в филогенетических построениях на основе отдельных генов. Конкатенация больших мультигенных наборов данных для повышения точности филогенетического логического вывода является принятой методикой для кластеров, состоящих из ортологичных генов [3].
Широко применяется конкатенация в таксонах, в которых имеются полные геномы, например в прокариотах [31], и таксоны с небольшими геномами органелл, такие как митохондрии животных [32]. Конкатенация последовательностей может скрывать основное дерево видов при наличии различных филогенетических сигналов в эволюции отдельных генов [3].
В нашей работе аминокислотные последовательности трех протеинов 5el, ЫП и П41 от 32 штаммов вируса АЧС были сконкатенированы в одну псевдопоследовательность и использовались для расчета соотношения несинонимичной ^^ — синонимичной замены на сайт (отношение dN/dS).
Количество синонимичных замен на синонимичный сайт преобладало над количеством несинонимичных на несинонимичный сайт 0,2788>0,0678 ^^^ pS>pN). При подсчете соотношения dN/dS значение составляет 0,2432<1. Это свидетельствует об очищающем (стабилизирующем) отборе на уровне нуклеотидных последовательностей.
Очищающий отбор встречается наиболее часто, и он характерен для нуклеотидных последовательностей, кодирующих структурно-функционально сформированные белки. Сравнение скоростей синонимичных и несинонимичных замен по генам вируса АЧС выявило от 14 до 18 генов, которые подвергаются положительному (позитивному) отбору [26]. Роль иммунной системы в отношении вариабельности последовательностей может влиять на эволюцию последовательностей некоторых генов вируса АЧС, что, следовательно, может привести к смещению времени жизни «последнего общего предка» (TMRCA). Более низкие ско-
Рис. 3. Электрофореграмма продуктов амплификации гена DP71 L, кодирующего белок И41. М=100 п.о.
рости несинонимичных изменений обнаруживаются в вирусах, передаваемых векторами — членистоногими, что отражает повышенное очищающее давление отбора, связанное с репликацией в различных видах хозяев. Возможно, что многие мутации, которые происходят внутри хозяев, удаляются при передаче между ними из-за сильного очищающего отбора, в первую очередь из-за несоответствия цитотоксического иммунного ответа хозяев, осуществляемого Т-лимфоцитами.
В работе Е. de Villiers и соавт. были исследованы 4 модели замены кодонов (M1, M2, M7 и M8). Модель M2 идентифицировала 14 генов вируса АЧС под положительным отбором. К ним относятся белки мультигенных семейств 360 и 505, несколько гипотетических белков, гомолог CD2v, несколько ферментов и вирусный шаперон B602L, который обеспечивает правильное складывание основного белка капсида p 72. Самая строгая модель для положительного отбора, M8, идентифицировала восемнадцать генов, восемь из которых находятся под положительным отбором и представляют собой гены, которые могут участвовать в модуляции функций клетки-хозяина [3].
Данные анализа соотношения несинонимичных и синонимичных мутаций на широком уровне генома показывают несколько генов, которые могут оказаться под селективным давлением.
Заключение
Диапазон групповой вариабельности белков ранее изучали различные группы исследователей на примере белков p17 [34], p54 и CD2v [15, 26, 33].
Характеристика вариабельности отобранной нами группы генов вируса АЧС представляет большой интерес для поиска генетических различий и маркеров эволюционной изменчивости в иммуномодулирующих белках, а также может послужить выявлению таргетных участков в геноме вируса АЧС для разработки вакцин.
Полученные результаты по данным биоинформатиче-ского анализа показали, что белки 5el и i 141 имеют внутриклеточные участки, белок k111 имеет внеклеточный и внутриклеточный топологические домены и трансмембранный участок. Наличие единичных нуклеотидных замен в этих участках может свидетельствовать о большей консервативности данных белков.
Степень нуклеотидных замен конкатенированных генов A238L, I329L и DP71L вируса АЧС, определенная в этом исследовании, выявила очищающий (стабилизирующий) отбор на уровне нуклеотидных последовательностей. В результате анализа нуклеотидных последовательностей, полученных в результате секвенирования генов A238L, I329L и DP71L, можно сделать вывод, что эти гены являются консервативными, при этом имеют внутри себя вариабельные участки. Все российские изоляты вируса АЧС, выделенные в 2016—2017 гг., имеют идентичные последовательности генов Á238L и I329L, что свидетельствует об общности их происхождения. Топология филогенетического древа по гену I329L полностью совпадает с филогенетическим древом, построенным на основе псевдопоследовательности из 7 иммуномодулирующих генов. Таким образом, ген I329L может являться генетическим маркером общности происхождения. Белок i 141 вируса АЧС имеет 2 формы: длинную (184 аминокислоты) и краткую (от 70 до 72 аминокислот), что является уникальным среди вариантов вируса АЧС.
Используя полученные данные, можно предсказать возможное участие этих генов в изменении уровня вирулентности, присущего выбранным штаммам, а также способность являться факторами вирулентности вируса АЧС.
Работа выполнена в рамках государственного задания 0615-2017-0001.
Благодарность. Работа выполнена в рамках государственного задания при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Долевое участие авторов: написание текста, сбор и обработка материала, выполнение отдельных этапов экспериментальной части — Нефедьева М.В., проведение секвенирования генов — Титов И.А., статистическая обработка вариабельности белков — Мима К.А., концепция и дизайн исследования, редактирование текста — Малоголовкин А.С.
Соблюдение этических норм. Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов исследований.
AMTEPATYPA/REFERENCES
1. Sanchez-Vizcaino JM. African Swine Fever. In: Straw B, D'Allaire S, Menge-ling W, Taylor D, (eds). Diseases of Swine. 9th edition. USA: Iowa State University; 2006.
2. Rodriguez JM, Moreno LT, Alejo A, Lacasta A, Rodriguez F, Salas ML. Genome sequence of african swine fever virus BA71, the virulent parental strain of the nonpathogenic and tissue-culture adapted BA71V. PLoS ONE. 2015;10(11):e0142889.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0142889
3. De Villiers EP, Gallardo C, Arias M, Da Silva M, Upton C, Martin R, et al. Phylogenomic analysis of 11 complete African swine fever virus genome sequences. Virology. 2010;400:128-136. https://doi.org/10.1016/j.virol.2010.01.019
4. Sanchez-Vizcaino JM, Mur L, Gomez-Villamandos JC, Carrasco JL. An Update on the Epidemiology and Pathology of African Swine Fever. J Comp Pathol. 2015;152:9-21. https://doi.org/10.1016/jocpa.2014.09.003
5. Rock DL. Challenges for African swine fever vaccine development — «...perhaps the end of the beginning». Vet Microbiol. 2017;206:52-58. https://doi.org/10.10167j.vetmic.2016.10.003
6. Колбасов Д.В., Балышев В.М., Середа А.Д. Итоги разработки живых вакцин против африканской чумы свиней. Ветеринария. 2014;8:3-8. [Kolbasov DV, Balyshev VM, Sereda AD. Results of research works on the development of live vaccines against African swine fever. Veterinariya. 2014;8:3-8. (In Russ.)].
7. King K, Chapman D, Argilaguet J M, Fishbourne E, Hutet E, Cariolet R, et al. Protection of European domestic pigs from virulent African isolates of African swine fever virus by experimental immunisation. Vaccine. 2011;29(28):4593-4600. https://doi.org/10.U59/000170936
8. Dixon LK, Abrams CC, Chapman DD, Goatley LC, Netherton CL, Taylor G, et al. Prospects for development of African swine fever virus vaccines. Dev Biol (Basel). 2013;135:147-157. https://doi.org/10.1159/000170936
9. Nix RJ, Gallardo C, Hutchings G, Blanco E, Dixon LK. Molecular epidemiology of African swine fever virus studied by analysis of four variable genome regions. Arch Virol. 2006;151(12):2475-2494. https://doi.org/10.1007/s00705-006-0794-z
10. Dixon LK, Baylis SA, Vydeingum S, Twigg SRF, Hammond JM, Hingamp PM, et al. African swine fever virus genome content and variability. Arch Virol. 1993;7:185-199.
https://doi.org/10.1007/978-3-7091-9300-6_15
11. Dixon LK, Abrams CC, Bowick G, Goatley LC, Kay-Jackson PC, Chapman D, et al. African swine fever virus proteins involved in evading host defence systems. Vet Immunol Immunopathol. 2004;100(3-4):117-134. https://doi.org/10.1016/j.vetimm.2004.04.002
12. De Oliveira VL, Almeida SC, Soares HR, Crespo A, Marshall-Clarke S, Parkhouse RME. A novel TLR3 inhibitor encoded by African swine fever virus (ASFV). Arch Virol. 2011;156:597-609. https://doi.org/10.1007/s00705-010-0894-7
13. Zsak L, Lu Z, Kutish GF, Neilan JG, Rock DL. An african swine fever virus virulence-associated gene N L-S with similarity to the herpes simplex virus ICP34.5 gene. J Virol. 1996;70(12):8865-8871.
14. Granja AG, Perkins ND, Revilla Y. A238L inhibits NF-ATc2, NF-kappa B, and c-Jun activation through a novel mechanism involving protein kinase C-theta-mediated up-regulation of the amino-terminal transactivation domain of p300. J Immunol. 2008;180(4):2429-2442. https://doi.org/10.4049/jimmunol.1490049
15. Chapman DA, Tcherepanov V, Upton C, Dixon LK. Comparison of the genome sequences of non-pathogenic and pathogenic African swine fever virus isolates. J Gen Virol. 2008;89(2):397-408. https://doi.org/10.1099/vir.0.83343-0
16. Garcia-Boronat M, Diez-Rivero CM, Reinherz EL, Reche PA. PVS: a web server for protein sequence variability analysis tuned to facilitate conserved epitope discovery. Nucleic Acids Res. 2008;36:35-41. https://doi.org/10.1093/nar/gkn211
17. Nielsen H. Predicting Secretory Proteins with SignalP. In: Kihara D., (eds). Protein Function Prediction. Springer. 2017:59-73. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-7015-5_6
18. Dobson L, Remenyi I, Tusnady GE. CCTOP: a Consensus Constrained TOPology prediction web server. Nucleic Acids Res. 2015;43(1):408-412. https://doi.org/10.1093/nar/gkv451
19. Gallardo C, Mwaengo DM, Macharia JM, Arias M, Taracha EA, Soler A, et al. Enhanced discrimination of African swine fever virus isolates through nucleotide sequencing of the p54, p72, and pB602L (CVR) genes. Virus Genes. 2009;38(1):85-95. https://doi.org/10.1007/s11262-008-0293-2
20. Bastos AD, Penrith ML, Cruciere C, Edrich JL, Hutchings G, Roger F, et al. Genotyping field strains of African swine fever virus by partial p72 gene characterisation. Arch Virol. 2003;148(4):693-706. https://doi.org/10.1007/s00705-002-0946-8
21. Середа А.Д., Балышев В.М. Антигенное разнообразие вируса африканской чумы свиней. Вопросы вирусологии. 2011 ;56(4):38-42. [Sereda AD,
Balyshev VM. Antigenic diversity of African swine fever viruses. Vopr Viru-sol. 2011 ;56(4):38-42. (In Russ.)].
22. Edgar RC. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res. 2004;32(5):1792-1797. https://doi.org/10.1093/nar/gkh340
23. Tamura K, Stecher G, Peterson D, Filipski A, Kumar S. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. Mol Biol Evol. 2013; 30(12):2725-2729.
https://doi.org/10.1093/molbev/mst197
24. Mosavi LK, Cammett TJ, Desrosiers DC, Peng ZY. The ankyrin repeat as molecular architecture for protein recognition. Protein Sci. 2004;13(6):1435-1448.
https://doi.org/10.1110/ps.03554604
25. Jousse C, Oyadomari S, Novoa I, Lu PD, Zhang Y, Harding HP, et al. Inhibition of a constitutive translation initiation factor 2a phosphatase, CReP, promotes survival of stressed cells. J Cell Biol. 2003;163:767-775. https://doi.org/10.1083/jcb.200308075
26. Chapman DA, Darby AC, Da Silva M, Upton C, Radford AD, Dixon LK. Genomic analysis of highly virulent Georgia 2007/1 isolate of African swine fever virus. Emerging Infect Dis. 2011;17(4):599-605. https://doi.org/10.3201/eid1704.101283
27. Neilan JG, Lu Z, Kutish GF, Zsak L, Lewis TL, Rock DL. A conserved African swine fever virus I kappa B homolog, 5el, is nonessential for growth in vitro and virulence in domestic swine. Virology. 1997;235(2):377-385. https://doi.org/10.1006/viro.1997.8693
28. Abrams CC, Chapman DA, Silk R, Liverani E, Dixon LK. Domains involved in calcineurin phosphatase inhibition and nuclear localisation in the African swine fever virus A238L protein. Virology. 2008;374(2):477-486. https://doi.org/10.1371/journal.pbio. 1001492
29. Мима К.А., Бурмакина Г.С., Титов И.А., Малоголовкин А.С. Им-мунологически значимые гликопротеины p54 и cd2v вируса африканской чумы свиней: биоинформатический анализ генетических вариаций и гетерогенности. Сельскохозяйственная биология. 2015;50(6):785-793. [Mima KA, Burmakina GS, Titov IA, Malogolovkin AS. African swine fever virus glycoproteins p54 and CD2v in the context of immune response modulation: bioinformatic analysis of genetic variability and heterogeneity. Sel'skokhozyaistvennaya biologiya. 2015;50(6):785-793. (In Russ.)].
https://doi.org/10.15389/agrobiology.2015.6.785rus
30. Bishop RP, Fleischauer C, de Villiers EP, Okoth EA, Arias M, Gallardo C, et al. Comparative analysis of the complete genome sequences of Kenyan African swine fever virus isolates within p72 genotypes IX and X. Virus Genes. 2015;50(2):303-390.
https://doi.org/10.1007/s11262-014-1156-7
31. Brown JR, Douady CJ, Italia MJ, Marshall WE, Stanhope MJ. Universal trees based on large combined protein sequence data sets. Nat Genet. 2001;28:281-285.
https://doi.org/10.103 8/90129
32. Miya M, Nishida M. Use of mitogenomic information in teleostean molecular phylogenetics: a tree-based exploration under the maximum-parsimony optimality criterion. Mol Phylogenet Evol. 2000; 17:437-455. https://doi.org/10.1006/mpev.2000.0839
33. Rowlands RJ, Duarte MM, Boinas F, Hutchings G, Dixon LK. The CD2v protein enhances African swine fever virus replication in the tick vector, Or-nithodoros erraticus. Virology. 2009;393(2):319-328. https://doi.org/10.1016/j.virol.2009.07.040
34. Suarez C, Gutierrez-Berzal J, Andres G, Salas ML, Rodriguez JM. African Swine Fever Virus Protein p17 Is Essential for the Progression of Viral Membrane Precursors toward Icosahedral Intermediates. J Virol. 2010;84(15):7484-7499.
https://doi.org/10.1128/JVI .00600-10
Поступила в редакцию 29.03.18 После доработки 06.06.18 Принята к публикации 07.09.18
Сведения об авторах:
М.В. Нефедьева [Nefedeva M.V.] https://orcid.org/0000-0002-6143-7199 И.А. Титов [Titov I.A.] https://orcid.org/0000-0002-5821-8980 К.А. Мима [Mima K.A.] https://orcid.org/0000-0001-7184-6968 А.С. Малоголовкин [Malogolovkin A.S.] https://orcid.org/0000-0003-1352-1780
