АНАЛИЗ ГЕНОВ, КОДИРУЮЩИХ БЕЛКИ СЕМЕЙСТВА MБЛ-ПОДОБНЫХ МЕТАЛЛОГИДРОЛАЗ, ШТАММА-ДЕСТРУКТОРА КОМПОНЕНТОВ НЕФТИ PSEUDOMONAS PUTIDA BS3701 Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

RM'A'X

https://cmac-joumal.ru

КЛИНИЧЕСКАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ И АНТИМИКРОБНАЯ ХИМИОТЕРАПИЯ

Там 24 №3

2022

DOI: 10.36488/cmac.2022.3.248-253

Оригинальная статья

Анализ генов, кодирующих белки семейства МБЛ-подобных металлогидролаз, штамма-деструктора компонентов нефти Pseudomonas putida BS3701

Позднякова-Филатова И.Ю.1, Загоскин А.А.1, Захарова М.В.1, Нагорных М.О.1,2

1 Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук, Пущино, Россия

2 АНО ВО «Научно-технологический университет „Сириус"», Сочи, Россия

Контактный адрес: Максим Олегович Нагорных Эл. почта: mz412@rambler.ru

Ключевые слова: резистентность,

гены металло-

-бета-P. putida BS3701.

лактамаз,

Конфликт интересов: авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов.

Внешнее финансирование: исследование проведено без внешнего финансирования.

Цель. Определить потенциальную возможность штамма Pseudomonas putida BS3701 быть источником генов устойчивости к бета-лактамным антибиотикам.

Материалы и методы. Последовательности 7 генов, аннотированных как «MBL-fold metallohydrolase superfamily», были проанализированы с использованием следующих ресурсов: ResFinder 4.1, ClustalW, IQ-TREE, iTOL. Подбор олигонуклеотидов для проведения ПЦР в реальном времени осуществляли с использованием ресурса Primer-BLAST. Уровень экспрессии генов оценивали с использованием ПЦР в реальном времени. Определение МПК и МБК проводили с использованием цефепима и меропенема. Для определения присутствия металло-бета-лактамаз (МБЛ) у штамма использовали метод двойных дисков с ЭДТА.

Результаты. Анализ нуклеотидных последовательностей исследуемых генов выявил, что все они не входят в кладу, содержащую последовательности МБЛ. В экспоненциальной фазе роста были обнаружены мРНК, соответствующие исследуемым белкам. Определение МПК и МБК выявило низкий уровень резистентности штамма к цефепиму и меропенему. Фенотипический тест дал отрицательный результат на наличие МБЛ у штамма P. putida BS3701.

Выводы. Группа белков, которая была аннотирована как «MBL-fold metallohydrolase superfamily» штамма P. putida BS3701, не может быть отнесена к МБЛ. Штамм P. putida BS3701 не представляет опасности в качестве источника генов устойчивости к соответствующим антибиотикам и может использоваться в биотехнологических задачах.

Original Article

Analysis of the genes encoding the MBL-fold metallohydrolase superfamily proteins of the Pseudomonas putida BS3701 petroleum component-degrading strain

Pozdnyakova-Filatova I.Yu.1, Zagoskin A.A.1, Zakharova M.V.1, Nagornykh M.O.1,2

1 Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms of the Russian Academy of Sciences, Pushchino, Russia

2 Sirius University of Science and Technology, Sochi, Russia

Objective. To determine whether the genes whose products are annotated as "MBL-fold metallohydrolase superfamily" are related to the proteins of the metallo-p-lactamase group.

Materials and methods. Sequences of the 7 genes annotated as "MBL-fold metallohydrolase superfamily" were analyzed using the following resources: ClustalW, IQ-TREE, iTOL. Selection of the oligonucleotides for real-time PCR was performed using the Primer-BLAST resource. The level of gene expression was assessed using real-time PCR. MIC and MBC measuring was performed using cefepime and meropenem. The double-disc method with EDTA was used to determine the presence of MBL in the strain. Results. Analysis of the nucleotide sequences of the studied genes revealed that all of them were not included in the clade containing sequences of metallo-p-lactamase. In the exponential growth phase, mRNAs corresponding to the studied proteins were found. Determination of MIC and MBC revealed a low level of resistance to antibiotics of the p-lactamase group. The phenotypic test was negative for MBL in P. putida strain BS3701.

Conclusions. The investigated genes and corresponding proteins are not related to metallo-p-lactamases. They are not involved in the resistance of P. putida BS3701 to antibiotics of the metallo-p-lactamase group.

Contacts:

Maxim O. Nagornykh E-mail: mz412@rambler.ru

Key words: resistance, metallo-ß-lactamase genes, P. putida

BS3701.

Conflicts of interest: all authors report no conflicts of interest relevant to this article.

External funding source: no external funding received.

Позднякова-Филатова И.Ю. и соавт.

Введение

Металло-бета-лактамазы (МБЛ) - цинк-зависимые ферменты, которые гидролизуют карбапенемы, пеницил-лины и цефалоспорины. МБЛ относят к классу B в соответствии с классификацией Амблера, которая основана на аминокислотной последовательности бета-лактамаз [1, 2], и разделяют на 3 подкласса (B1, B2, B3), что позволяет учесть структуру металлосвязывающего домена [3]. МБЛ, наряду с AHL-лактоназами, рибонуклеазами и некоторыми другими металл-зависимыми ферментами, входят с суперсемейство металло-гидролаз/оксидоредук-таз [4, 5].

Гены, кодирующие МБЛ, обнаруживают и в представителях рода Pseudomonas: P. aeruginosa, P. putida, P. stutzeri, P. juntendi, P. asiatica [3]. Штаммы P. putida активно применяются в биотехнологии как в составе биопрепаратов для очистки почв от загрязнений ксенобиотиками, так и в виде штаммов-продуцентов ценных метаболитов [6], что делает важным анализ используемых штаммов на наличие генов антибиотикорезистентно-сти. Однако до настоящего времени гены МБЛ P. putida искали только среди внутрибольничных штаммов [7-10]. В геноме штамма-деструктора компонентов нефти P. putida BS3701 [11] аннотировано 7 генов, кодирующих белки семейства МБЛ-подобных металло-гидролаз: 6 из них имеют хромосомную локализацию, 1 имеет плазмидную локализацию [12].

Цель этой работы - определить, являются ли гены, продукты которых аннотированы как «MBL-fold metallohydrolase superfamily», генами, кодирующими МБЛ, с активностью которых ассоциирована повышенная устойчивость псевдомонад к широкому спектру бета-лактамных антибиотиков.

Материалы и методы

Биоинформатический анализ генов

Поиск в геноме штамма P. putida BS3701 генов, ассоциированных с генами устойчивости к антибиотикам, проводили с помощью сервиса ResFinder 4.1 (https://cge.food. dtu.dk/services/ResFinder/). Для построения филогенетического дерева были взяты 7 аминокислотных последовательностей белков P. putida BS3701 и 387 аминокислотных последовательности белков, относящихся к MBL-fold metallohydrolase superfamily [3]. Выравнивание проводили с помощью алгоритма ClustalW со стандартными настройками на сайте (www.genome.jp/tools-bin/clustalw). Для расчета использовали сервер IQ-TREE (http://iqtree.cibiv. univie.ac.at/), предложенная алгоритмом модель замен WAG+F+G4. Для визуализации филогенетического дерева использовали iTOL (https://itol.embl.de/) [13].

Определение минимальной подавляющей и минимальной бактерицидной концентраций антибиотика

Ночную культуру P. putida BS3701 и P. putida KT2442 выращивали на богатой среде lysogeny broth (LB) в течение 24 ч., после чего заражали пробирки с 10 мл LB, содержащей антибиотик (конечная концентрация клеток

Позднякова-Филатова И.Ю. и соавт.

после инокуляции составила 106 КОЕ/мл). Культуру выращивали до стационарной фазы роста (16 ч.) и определяли ОП595. Те образцы, где ОП не отличалась от контроля, сеяли на чашки Петри со средой LB без добавления антибиотика (10 мкл на чашку). Минимальной подавляющей концентрацией (МПК) считали минимальную концентрацию антибиотика, при которой отсутствовал рост культуры. Через 16 ч. оценивали численность и ту концентрацию, при которой отсутствовали колонии на чашке, считали минимальной бактерицидной концентрацией (МБК).

Метод двойных дисков с ЭДТА

Взвесь клеток штамма P. putida BS3701 наносили на поверхность агаризованной среды. Через 5-10 мин. наносили диск с ЭДТА (5 мкл 0,5 М). На расстоянии 15 мм наносили диск с меропенемом (10 мкг). Для контроля использовали пустой диск. Чашки инкубировали в термостате 16-18 ч.

Выделение тотальной РНК

Ночную культуру P. putida BS3701 выращивали на богатой среде LB в течение 24 ч., после чего заражали пробирки с 10 мл LB без добавления антибиотика (конечная концентрация клеток после инокуляции составила 106 КОЕ/мл). Через 4 ч., когда культура находилась в экспоненциальной фазе роста, добавляли 5% спиртовой раствор фенола и собирали биомассу. Для выделения тотальной РНК использовали TRI Reagent (Sigma Aldrich, США). Качество препаратов проверяли с помощью электрофореза в агарозном геле.

Подбор праймеров для количественной ПЦР

Специфические праймеры к генам, кодирующим белки семейства МБЛ-подобных металлогидролаз, и к референсному гену rpoS подбирали с помощью инструмента Primer-BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/ primer-blast/). Эффективность амплификации определяли, используя серию десятикратных разведений ДНК-матрицы, специфичность реакции подтверждали с помощью электрофореза в агарозном геле (Таблица 1).

Количественная ПЦР

Перед проведением количественной ПЦР препараты тотальной РНК обрабатывали ДНКазой I (NEB, США). Для синтеза кДНК брали 100 нг обработанного препарата тотальной РНК и праймеры random hexamer, реакцию обратной транскрипции проводили с использованием набора «Maxima H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit» (Thermo Fisher Scientific, США). Для проведения количественной ПЦР использовали набор реагентов для проведения ПЦР-РВ в присутствии красителя SYBR Green I (Синтол, Россия). Наличие мРНК определяли по разнице между Cp в образце, обработанном обратной транскриптазой, и в образце без обработки:

(1/E(CP«-RT»-CP«+RT»)) х 100% < 3%,

Таблица 1. Информация о праймерах, используемых в количественной ПЦР с обратной транскрипцией

Продукт гена (proteinjd) Последовательность праймеров Размер ампликона E R2

WPJ80689417.1 MBL1 BS3701 rt 299 f TGGAAGACGCCTACAAGCTG MBL1 BS3701 rt 499 r GCTGGATATCGCACTCGACA 201 2,00 0,991

WP_004374564.1 MBL2 BS3701 rt 332 f ATCGCCACGGTTACTCCAAG MBL2 BS3701 rt 438 r GGTCACCTGATGTAACGCCA 107 2,00 0,994

WP_180688401.1 MBL3 BS3701 rt 774 f ACGCGTTACCTTTGCTCAGA MBL3 BS3701 rt 1016 r CCAGGAGAGCGGTGAACAAT 243 1,90 0,981

WP_003254735.1 MBL4 BS3701 rt 638 f GCAGCAAGAACAACCTGCCA MBL4 BS3701 rt 715 R CCGTGTTCCTGATTCGCCAC 78 2,10 0,957

WP_004575872.1 MBL5 BS3701 rt 26 f TCCGCGAAACCTTCCCTGTC MBL5 BS3701 rt 283 R TGTCCCACAGCATCTGGTCG 258 2,10 0,875

WP_020192714.1 MBL6 BS3701 rt 167 f TGGTCGAGCGTGTGAATGAA MBL6 BS3701 rt 264 r TTCTTTCAGGTAGGCAGCGG 98 2,10 0,989

WP_062378634.1 MBL7 BS3701 rt 118 f CCGGGCTTCTATCGCATGAT MBL7 BS3701 rt 329 r CCCGTGTCGATGAGGATGAG 212 2,10 0,999

RpoS rpoS(BS3701)RT861f AGGGCATGAAAGCAGTACCC rpoS(BS3701)RT967r GGATCTCACGCAAACGCTTC 107 1,95 0,978

где Е - эффективность амплификации при использовании конкретной пары праймеров, Cp«-RT» - цикл для образца без обработки обратной транскриптазой, Cp«+RT» - цикл для образца, обработанного обратной транскриптазой.

Результаты

На начальном этапе нами был использован сетевой ресурс ResFinder 4.1 для поиска в геноме штамма P. putida BS3701 генов, ассоциированных с генами устойчивости к антибиотикам. Было установлено, что геном не содержит гены, которые можно отнести к одному из известных генов МБЛ.

МБЛ разделяют на 3 подкласса (B1, B2, B3) и отмечают, что аминокислотные последовательности белков подклассов B1 и B2 гораздо больше похожи друг на друга, чем каждый из них на белки подкласса B3 [5]. Далее мы проанализировали 394 аминокислотных последовательности, относящихся к семейству МБЛ-подобных металлогидролаз, среди которых было 7 последовательностей МБЛ подкласса B1, 19 - подкласса B2, 4 - подкласса B3. Каждая группа последовательностей белков подкласса B1 и B3 образовывали по одной монофиле-тической группе, в то время как для последовательностей подкласса B2 наблюдали образование парафилети-ческой группы (Рисунок 1).

Позднякова-Филатова И.Ю. и соавт.

В геноме P. putida BS3701 аннотировали 7 генов, относящихся к семейству МБЛ-подобных металлогидролаз: 6 из них имели хромосомную локализацию, 1 - плазмидную локализацию (Таблица 2).

Белки WP_020192714.1 (32,7 кДа, ген имеет хромосомную локализацию) и WP_004575872.1 (23,6 кДа, ген имеет хромосомную локализацию) штамма P. putida BS3701 образуют одну кладу с белками (бутстреп-под-держка 96%): P64262 Uncharacterized protein Mb2612c

Таблица 2. Гены, кодирующие белки семейства МБЛ-подобных металлогидролаз, обнаруженные в штамме P. putida BS3701

locus_tag Локализация Размер продукта, кДа proteinjd

H0H12_RS06565 хромосома 51,7 WP_180689417.1

H0H12_RS14840 хромосома 50,2 WP_004374564.1

H0H12_RS18960 хромосома 39,8 WP_180688401.1

H0H12_RS22595 хромосома 27,8 WP_003254735.1

H0H12_RS24960 хромосома 23,6 WP_004575872.1

H0H12_RS28800 хромосома 32,7 WP_020192714.1

H0H12_RS29075 плазмида 34,7 WP_062378634.1

Рисунок 1. Филогенетическое дерево, построенное по 394 аминокислотным последовательностям белков, принадлежащим к MBL-fold т^аПоЬ^гоЫе superfamily

Оранжевой заливкой отмечены МБЛ подкласса В1 (бутстреп-поддержка 98,3%), голубой - подкласса В2, фиолетовой - подкласса В3 (бутстреп-поддержка 92%). Белки MBL-fold metallohydrolase superfamily P. putida BS3701 отмечены точками. Длина ветвей проигнорирована.

Mycobacterium bovis, P9WMW2 Uncharacterized protein MT2658 Mycobacterium tuberculosis, Q49649 Uncharacterized protein ML0493 Mycobacterium leprae, O67893 Uncharacterized protein aq 2135 Aquifex aeolicus, P75849 gloC Hydroxyacylglutathione hydrolase Escherichia coli, Q57544 Hydroxyacylglutathione hydrolase GloC Haemophilus influenzae, P54501 Probable metallo-hydrolase YqgX Bacillus subtilis, Q5XD24 Probable metallo-hydrolase M6 Spy0554 Streptococcus pyogenes serotype M6, Q87AD6 blh Beta-lactamase hydrolase-like protein Xylella fastidiosa, Q9PFB0 blh Beta-lactamase hydrolase-like protein Xylella fastidiosa, Q8UAA9 blh Beta-lactamase hydrolase-like protein Agrobacterium fabrum, Q3JRV4 Probable metallo-hydrolase BURPS1710b 2304

Burkholderia pseudomallei, A7Z4X7 baeB Probable polyketide biosynthesis zinc-dependent hydrolase Bacillus velezensis, O34769 Probable polyketide biosynthesis zinc-dependent hydrolase PksB Bacillus subtilis.

Белки WP_004374564.1 (50,2 кДа, ген имеет хромосомную локализацию) и WP_180689417.1 (51,7 кДа, ген имеет хромосомную локализацию) штамма P. putida BS3701 образуют одну кладу с белками (бутстреп-поддержка 87,2%): B9JPK6 N-acyl homoserine lactonase AiiB Agrobacterium radiobacter, A9CKY2 aiiB N-acyl homoserine lactonase Agrobacterium fabrum, Q5SLP1 Ribonuclease TTHA0252 Thermus thermophilus, Q7B8C5 aiiA N-acyl homoserine lactonase Bacillus thuringiensis subsp. aizawai, Q7B8C3 aiiA

Позднякова-Филатова И.Ю. и соавт.

Таблица 3. MnK и MБK меропенема и цефепима

N-acyl homoserine lactonase Bacillus thuringiensis subsp. indiana, Q08GP4 Y2-aiiA N-acyl homoserine lactonase Bacillus cereus, Q9L8R8 aiiA N-acyl homoserine lactonase Bacillus spp., P9WLD6 Probable metallo-hydrolase MT2357 Mycobacterium_tuberculosis, P64982 Probable metallo-hydrolase Mb2322c Mycobacterium_bo-vis, Q1M813 N-acyl homoserine lactonase AttM Rhi-zobium leguminosarum bv. viciae, A8IQD2 N-acyl homoserine lactonase AttM Azorhizobium caulinodans, Q8VPD5 N-acyl homoserine lactonase AttM Rhizobium radiobacter, Q7D3U0 N-acyl homoserine lactonase AttM Agrobacterium fabrum, Q988B9 mlr6805 4-pyri-doxolactonase Mesorhizobium japonicum.

Белки WP_003254735.1 (27,8 кДа, ген имеет хромосомную локализацию), WP_062378634.1 (34,7 кДа, ген имеет плазмидную локализацию) и WP_180688401.1 (39,8 кДа, ген имеет хромосомную локализацию) штамма P. putida BS3701 образуют одну кладу с белками (бутстреп-поддержка 84%): 034409 Probable metallo-hydrolase YflN Bacillus subtilis, 007607 Probable metallo-hydrolase Yhfl Bacillus subtilis, C0SP91 Putative metallo-hydrolase YycJ Bacillus subtilis.

Таким образом, ни одна из анализируемых последовательностей белков штамма P. putida BS3701 (Таблица 2), принадлежащих семейству МБЛ-подобных металлогидролаз, не входит в кладу, содержащую последовательности МБЛ. Гены, кодирующие исследуемые белки штамма P. putida BS3701, функциональны: в экспоненциальной фазе роста обнаружены соответствующие специфические мРНК (данные не показаны). Были определены МПК и МБК: добавление меропенема в концентрации 8 мкг/мл или цефепима в концентрации 2 мкг/мл ингибировало рост культуры (Таблица 3). Таким образом, было показано, что штамм проявляет низкую резистентность к указанным антибиотикам, при этом гены-кандидаты функционируют.

Значения МБК и МПК, которые отражают суммарное действие нескольких механизмов, не позволяют выявить специфическую активность МБЛ. Дополнительно мы провели измерение чувствительности к меропепему в присутствии ЭДТА - специфического ингибитора активности МБЛ - с использованием диско-диффузионного теста. Отсутствие расширения зоны подавления роста между диском с ЭДТА и диском с меропенемом свидетельствовало об отсутствии МБЛ у штамма.

Обсуждение

Одной из острых проблем современности является растущая множественная устойчивость бактерий к антибиотикам. Эта тема активно исследуется, но как было

отмечено в исследовании Murray С. и соавт. такие исследования нацелены преимущественно на клинические штаммы микроорганизмов, в то время как гены резистентности широко распространены во всех экологических нишах [14]. Это особенно актуально для рода Pseudomonas, один из представителей которого, Pseudomonas aeruginosa, является опасным полирезистентным микроорганизмом. Представители рода Pseudomonas широко распространены во всех экологических нишах и включают в себя как патогенные виды вроде P. aeruginosa, так и безвредные почвенные виды, такие как P. putida [15]. Однако некоторые исходно почвенные микроорганизмы могут выступать в качестве устойчивых к антибиотикам патогенов. Так, были описаны случаи возникновения инфекционных заболеваний, вызванных P. putida [16, 17].

К настоящему времени существует большой массив информации о последовательностях бактериальных геномов и о подтвержденных экспериментально функциональных активностях белков. Это позволяет в некоторых случаях провести биоинформатический анализ исследуемых генов и, дополнив его относительно простыми экспериментами, сделать достоверные выводы о биологических функциях продуктов этих генов. В этом исследовании мы оценили 7 генов, продукты которых аннотированы как «MBL-fold metallohydrolase superfamily» и могли бы выступать в качестве потенциальных генов устойчивости к бета-лактамным антибиотикам. Были использованы как генетические (био-информатический анализ и оценка уровня экспрессии генов с использованием ПЦР в реальном времени), так и фенотипические (оценка МПК, МБК) подходы. Биоинформатический анализ выявил, что ни одна из анализируемых последовательностей белков штамма P. putida BS3701 (Таблица 2) не входила в кладу, содержащую последовательности МБЛ. Исследование фенотипа выявило низкий уровень резистентности у P. putida BS3701 к таким антибиотикам, как цефепим и меропенем. Имеющийся уровень резистентности может быть обусловлен наличием эффлюкс-систем, некоторые из которых были описаны у представителей P. putida [18, 19].

Заключение

Было показано, что продукты генов, аннотированых в геноме P. putida BS3701 как «MBL-fold metallohydrolase superfamily», не относятся к МБЛ. Эти белки не обеспечивают резистентность P. putida BS3701 к антибиотикам класса карбапенемов. Это означает, что данный штамм не представляет опасности в качестве источника генов устойчивости к соответствующим антибиотикам и может быть использован в прикладных задачах.

Работа выполнена при поддержке программы Министерства высшего образования и науки РФ (соглашение №. 075-10-2021-113, уникальный номер проекта RF—193021X0001).

Антибиотик МПК, мкг/мл МБК, мкг/мл

Цефепим 2 256

Mеpопенем 8 64

Позднякова-Филатова И.Ю. и соавт.

Литература

1. Bush K. The ABCD's of ß-lactamase nomenclature. J Infect Chemother. 2013;19:549-559. DOI: 10.1007/s10156-013-0640-7

2. Bahr G., Gonzalez L.J., Vila A.J. Metallo-ß-lactamases in the age of multidrug resistance: from structure and mechanism to evolution, dissemination, and inhibitor design. Chem Rev. 2021;121:7957-8094. DOI: 10.1021/acs. chemrev.1c00138

3. López C., Delmonti J., Bonomo R.A., Vila A.J. Deciphering the evolution of metallo-ß-lactamases: a journey from the test tube to the bacterial periplasm. J Biol Chem. 2022;298:101665. DOI: 10.1016/j.jbc.2022.101665

4. Baier F., Tokuriki N. Connectivity between catalytic landscapes of the metallo-ß-lactamase superfamily. J Mol Biol. 2014;426:2442-2456. DOI: 10.1016/j. jmb.2014.04.013

5. Alderson R.G., Barker D., Mitchell J.B. One origin for metallo-ß-lactamase activity, or two? An investigation assessing a diverse set of reconstructed ancestral sequences based on a sample of phylogenetic trees. J Mol Evol. 2014;79:117-129. DOI: 10.1007/s00239-014-9639-7

6. Nikel P.I., de Lorenzo V. Pseudomonas putida as a functional chassis for industrial biocatalysis: from native biochemistry to trans-metabolism. Metab Eng. 2018;50:142-155. DOI: 10.1016/j.ymben.2018.05.005

7. Treviño M., Moldes L., Hernández M., Martínez-Lamas L., García-Riestra C., Regueiro B.J. Nosocomial infection by VIM-2 metallo-ß-lactamase-producing Pseudomonas putida. J Med Microbiol. 2010;59:853-855. DOI: 10.1099/ jmm.0.018036-0

8. Loucif L., Cherak Z., Chamlal N., Bendjama E., Gacemi-Kirane D., Grainat N., et al. First detection of VIM-2 metallo-ß-lactamase-producing Pseudomonas putida in Blattella germanica cockroaches in an Algerian hospital. Antimicrob Agents Chemother. 2017;61:e00357-17. DOI: 10.1128/ AAC.00357-17

9. Fernández M., Porcel M., de la Torre J., Molina-Henares M.A., Daddaoua A., Llamas M.A., et al. Analysis of the pathogenic potential of nosocomial Pseudomonas putida strains. Frontiers Microbiol. 2015;6:871. DOI: 10.3389/fmicb.2015.00871

10. Molina L., Udaondo Z., Duque E., Fernández M., Molina-Santiago C., Roca A., et al. Antibiotic resistance determinants in a Pseudomonas putida strain isolated from a hospital. PloS One. 2014;9:e81604. DOI: 10.1371/ journal.pone.0081604

11. Filonov A.E., Kosheleva I.A., Samoilenko V.A., Shkid-chenko A.N., Nechaeva I.A., Puntus I.F., et al. Biopreparation for cleaning soils from pollution by petroleum and petroleum products, method of its production and application. Patent RU2378060C2. 2010. Russian. (Филонов А.Е., Коше-лева И.А., Самойленко В.А., Шкидченко А.Н., Нечаева И.А., Пунтус И.Ф. и соавт. Биопрепарат для очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами, способ его получения и применения. Патент RU2378060C2. 2010.)

12. Filonov A., Delegan Y., Puntus I., Valentovich L., Akhremchuk A., Evdokimova O., et al. Complete genome sequence of Pseudomonas putida BS3701, a promising polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading strain for bioremediation technologies. Microbiol Resour Announc. 2020;9(40):e00892-20. DOI: 10.1128/MRA.00892-20

13. Letunic I., Bork P. Interactive Tree of Life (iTOL) v5: an online tool for phylogenetic tree display and annotation. Nucleic Acids Res. 2021;49(W1):W293-W296. DOI: 10.1093/ nar/gkab301

14. Murray C.J., Ikuta K.S., Sharara F., Swetschinski L., Aguilar G.R., Gray A., et al. Global burden of bacterial antimicrobial resistance in 2019: a systematic analysis. Lancet. 2022;399:629-655. DOI: 10.1016/S0140-6736(21)02724-0

15. Tang H., Yu H., Li Q., Wang X., Gai Z., Yin G., et al. Genome sequence of Pseudomonas putida strain B6-2, a superdegrader of polycyclic aromatic hydrocarbons and dioxin-like compounds. J Bacteriol. 2011;193(23):6789-6790. DOI: 10.1128/JB.06201-11

16. Yoshino Y., Kitazawa T., Kamimura M., Tatsuno K., Yotsuyanagi H., Ota Y. Pseudomonas putida bacteremia in adult patients: five case reports and a review of the literature. J Infect Chemother. 2011;17:278-282. DOI: 10.1007/s10156-010-0114-0

17. Carpenter R.J., Hartzell J.D., Forsberg J.A., Babel B.S., Ganesan A. Pseudomonas putida war wound infection in a US Marine: a case report and review of the literature. J Infect. 2008;56:234-240. DOI: 10.1016/j.jinf.2008.01.004

18. Ramos J.L., Duque E., Godoy P., Segura A. Efflux pumps involved in toluene tolerance in Pseudomonas putida DOT-T1E. J Bacteriol. 1998;180:3323-3329. DOI: 10.1128/ JB.180.13.3323-3329.1998

19. Rojas A., Duque E., Mosqueda G., Golden G., Hurtado A., Ramos J.L., et al. Three efflux pumps are required to provide efficient tolerance to toluene in Pseudomonas putida DOT-T1E. J Bacteriol. 2001;183:3967-3973. DOI: 10.1128/ JB.183.13.3967-3973.2001

Позднякова-Филатова И.Ю. и соавт.