CC BY
18
КЛИНИЧЕСКАЯ МЕДИЦИНА
УДК 61.616.8-056.7 © Коллектив авторов, 2016
А.Ф. Ахметгалеева1, И.М. Хидиятова1,2, Е.В. Сайфуллина3, Р.Ф. Идрисова4, Р.В. Магжанов3, Э.К. Хуснутдинова1,2 АНАЛИЗ ГЕНА REEP1 У ПАЦИЕНТОВ РЕСПУБЛИКИ БАШКОРТОСТАН С НАСЛЕДСТВЕННОЙ СПАСТИЧЕСКОЙ ПАРАПЛЕГИЕЙ
1ФГБУН Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН, г. Уфа 2ФГБОУ ВО «Башкирский государственный университет» Минобрнауки России, г. Уфа 3ФГБОУ ВО «Башкирский государственный медицинский университет»
Минздрава России, г. Уфа 4ГБУЗ «Республиканская клиническая больница им. Г.Г. Куватова», г. Уфа
Наследственные спастические параплегии (НСП) - группа нейродегенеративных болезней с преимущественным поражением пирамидного тракта. Мутации в генах спастина (SPG4), атластина (SPG3A) и REEP1 (SPG31) являются наиболее частыми причинами развития НСП. Цель настоящего исследования - определение вклада генетической формы SPG31, обусловленной мутациями гена REEP1, в структуру НСП в Республике Башкортостан и анализ клинических особенностей заболевания у пациентов с идентифицированными мутациями в исследуемом гене. Клинико-генеалогическое и молекулярно-генетическое исследование проведено в 60 неродственных семьях с НСП. Методами анализа конформационного полиморфизма однонитевой ДНК (SSCP) и последующего секвенирования в гене REEP1 были идентифицированы не описанная ранее нонсенс-мутация ^225G>A (p.W75*) у пациента со спорадической формой заболевания и известная мутация в 3'-нетранслируемой области гена - ^606+43G>T в семье с аутосомно-доминантной формой НСП. Вклад SPG31 формы НСП в структуру заболевания в РБ составил 3,3 %. Клинические исследования показали, что в обеих семьях заболевание соответствует неосложненной форме наследственной спастической параплегии.
Ключевые слова: наследственные спастические параплегии, ген REEP1, мутации.
A.F. Akhmetgaleeva, I.M. Khidiyatova, E.V. Sayfullina, R.F. Idrisova, R.V. Magzhanov, E.K. Khusnutdinova ANALYSIS OF THE REEP1 GENE IN PATIENTS WITH HEREDITARY SPASTIC PARAPLEGIA FROM THE REPUBLIC OF BASHKORTOSTAN
Hereditary spastic paraplegia (HSP) is a group of neurodegenerative diseases with a primary lesion of the pyramidal tract. Mutations in the spastin (SPG4), atlastina (SPG3A) and REEP1 (SPG31) genes are the most frequent causes of HSP. The aim of this study was to determine the genetic contribution of SPG31 form, caused by mutations in the REEP1 gene in HSP structure in the Republic of Bashkortostan, and to analyze clinical features of the disease in patients with identified mutations in the studied gene. Clinical, genealogical and molecular genetic study was carried out in 60 unrelated families with HSP. DNA single-strand conformation polymorphism (SSCP) analysis and subsequent sequencing of REEP1 gene identified previously undescribed nonsense mutation c.225G> A (p.W75 *) in patient with sporadic form of the disease, and known mutation in the 3 'untranslated region of the gene -c.606 + 43G> T, in family with autosomal dominant form of HSP. Contribution of SPG31 form in HSP disease structure in the Republic of Bashkortostan amounted to 3.3%. Clinical studies have shown that in both families the disease corresponds to an uncomplicated form of hereditary spastic paraplegia.
Key words: hereditary spastic paraplegia, REEP1 gene, mutations.
Наследственные спастические параплегии (НСП) - это генетически и клинически гетерогенная группа дегенеративных заболеваний нервной системы, обусловленных ди-стальной аксонопатией длинных аксонов кор-тикоспинального тракта [1]. Клинически НСП проявляются спастичностью мышц нижних конечностей. В зависимости от того, является ли основной симптом единственным или сочетается с другими неврологическими или экстраневральными симптомами, выделяют неосложнённые («чистые») или осложненные формы заболевания. Распространенность НСП в мире варьирует от 1,27 до 9,6 на 100000 населения [2]. Существует более 50 генетических форм НСП с различными типами наследования и клиническими проявлениями заболевания, обозначаемыми 8Р01-56 [2]
в соответствии с порядком открытия генного локуса, упоминается также митохондриальная форма [1,2]. Мутации в генах спастина (SPG4), атластина (SPG3A) и REEPl(Receptor expression enhancing protein 1)(SPG31) являются наиболее частыми причинами развития НСП и обнаруживаются у АД НСП больных соответственно в 40% [3], 10% [4] и 2,4% -6,5% случаев [5,6,7,8]. По распространенности НСП, спектру и частоте мутаций в ответственных генах наблюдаются межпопуляци-онные различия. В связи с этим в последние годы нами было начато исследование эпидемиологии и молекулярно-генетических причин НСП в Республике Башкортостан (РБ). Распространенность заболевания в республике составляет 3,5 на 100000 населения [9]. Целью настоящего исследования являлись опре-
деление вклада генетической формы SPG31, обусловленной мутациями гена REEP1, в структуру наследственных спастических па-раплегий в РБ, и анализ клинических особенностей заболевания у пациентов с идентифицированными мутациями в исследуемом гене.
Материал и методы
Клинико-генеалогическое и молекуляр-но-генетическое исследования проведены в 60 неродственных семьях с НСП. Контрольная выборка состояла из здоровых жителей РБ различной этнической принадлежности: русской (50 чел.), татарской (50 чел.), башкирской (50 чел.). У всех обследуемых лиц кровь была получена с их информированного согласия.
Поиск мутаций в гене REEP1 проведен методом анализа конформационного полиморфизма однонитевой ДНК (SSCP) c последующим секвенированием на автоматическом анализаторе ABI PRISM 310 (Applied Biosystems). Амплификация первых шести экзонов гена проведена с использованием олигонуклеотидных праймеров, описанных Hewamadduma [7], седьмого экзона с протяженной 3' нетранслируемой областью - с использованием праймеров, подобранных в программе PRIMER3 (http ://bioinfo. ut.ee/primer3 -0.4.0/).
Для анализа функциональной значимости выявленных нуклеотидных изменений использовали программы Mutationtaster (www.mutationtaster.org) и Human splicing finder (www.umd.be/HSF3). С этой же целью был проведен скрининг на наличие выявленных мутаций в контрольных выборках здоровых индивидов. ПДРФ-анализ с использованием эндо-нуклеазы HaeIII был применен для подтверждения одного из найденных изменений.
Результаты и обсуждение
Ген REEP1, локализованный на 2-й хромосоме (2p12), содержит семь экзонов и кодирует белок REEP1, состоящий из 201 аминокислоты, усиливающий экспрессию рецепторов, повышающих чувствительность обонятельных нейронов [10]. К настоящему времени в гене REEP1 описано 50 мутаций, обусловливающих аутосомно-доминантную форму НСП SPG31 [15], большинство из которых миссенс/нонсенс мутации, небольшие делеции и мутации сплайсинга.
В результате проведенного нами исследования у пациентов с НСП в гене REEP1 были идентифицированы четыре различных изменения нуклеотидной последовательности.
У пациента русской этнической принадлежности в четвертом экзоне гена была выявлена не описанная ранее нонсенс-мутация ^225G>A (p.W75*), приводящая к
образованию преждевременного стоп-кодона и синтезу укороченного белка, не имеющего С-терминального конца, но сохранившего оба гидрофобных домена. К сожалению, клинически здоровые родственники пробанда не были доступны для ДНК-анализа, поэтому трудно судить о происхождении мутации (возможно, она возникла de novo). В контрольной группе здоровых индивидов данная мутация не обнаружена. Согласно результатам анализа в компьютерной программе Mutationtaster нуклео-тидная замена ^225G>A является патогенной мутацией, нарушающей структуру и функцию белка REEP1.
Белок REEP1, так же как спастин М1 и атластин 1, является белком сети ЭПР. Взаимодействуя между собой посредством гидрофобных доменов, располагающихся внутри мембран трубочек ЭПР, эти три белка обеспечивают формирование сети ЭПР, а также взаимодействие последней с микротрубочками цитоскелета и регулируют транспорт поляризованных мембран и белков вдоль микротрубочек к удаленным частям клеток. При этом С-терминальный конец REEP1, выходящий в цитоплазму, непосредственно взаимодействует с микротрубочками [11]. В экспериментах с мутантными белками было показано, что в случае укороченного белка REEP1, лишенного С-терминального конца, нарушается связь ЭПР с микротрубочками цитоскелета, что также приводит к формированию измененной структуры и самой сети [11]. Наряду с этим в настоящее время активно исследуется роль белка REEP1 во взаимодействии ЭПР с митохондриями. В частности, доказана его локализация в контактных участках между ЭПР и митохондриями, называемых МАМ, и показано, что при мутациях в гене REEP1 взаимодействие между этими органеллами ослабевает, что приводит к уменьшению проникновения Са2+ в митохондрии, необходимого для их функционирования [12]. Такие нарушения взаимодействия ЭПР и митохондрий являются критичными для нейронов и приводят к различным нейродегенеративным заболеваниям, в том числе к НСП [12,13]. Вероятно, что именно мутации, нарушающие структуру С-концевого домена белка, ответственного за взаимодействие REEP1 с другими белками, могут приводить к подобным нарушениям взаимодействия ЭПР и митохондрий.
Нонсенс-мутации, приводящие к образованию укороченного белка REEP1, ранее были описаны у пациентов с аутосомно-доминантной НСП (Hewamadduma, 2009; Goi-zet, 2011), а также в спорадических случаях
или случаях с неизвестным наследованием заболевания [6]. Идентифицированная нами мутация с.225G>A (W75*) выявлена у пациента со спорадической формой НСП, у которого при клиническом обследовании были выявлены спастическая походка, гиперрефлексия коленных, аддукторных, ахилловых рефлексов, клонусы стоп, а также изменение мышечного тонуса рук и ног. Изменение походки сам пациент отмечает в течение длительного времени, но затрудняется назвать возраст начала, вероятнее всего, ввиду медленного прогрессирования заболевания и хороших компенсаторных возможностей. Наряду с этим пациент страдает нарушением мочеиспускания в виде затрудненного удержания мочи; по заключению уролога - нейро-генное расстройство мочеиспускания. На ми-елограммах шейного и грудного отделов позвоночника патологии не выявлено. Дисфункцию тазовых органов пациента отмечает в течение последних 15 лет, заболевание имеет прогрессирующее течение. Таким образом, представленный клинический случай НСП можно охарактеризовать как спорадическую неосложненную форму заболевания, сочетающуюся с нарушением мочеиспускания. В исследовании Hewamadduma [7] в семье с аутосомно-доминантным наследованием другой мутации, также приводящей к образованию преждевременного стоп-кодона, у про-банда было выявлено патологическое повышение тонуса и сухожильных рефлексов в нижних и верхних конечностях.
Второе изменение нуклеотидной последовательности в гене ЯЕЕР1 - с.606+43G>T -это известная мутация в З'-нетранслируемой области, описанная ранее 2иеЬпег е!а1. [5], которая выявлена нами в башкирской семье с аутосомно-доминантной НСП. Данная мутация обнаружена у пробанда и его сына. Не выявлена в контрольной группе лиц башкирской этнической принадлежности и подтверждается методом ПДРФ-анализа с использованием эн-донуклеазы ИавШ. Мутация с.606+43G>T нарушает высоко консервативный сайт связывания гена с микроРНК (miR-140), что приводит к усилению микроРНК опосредованной постранскрипционной репрессии уровня белка ИЕЕР1 [5]. Таким образом, изменение последовательности гена ЯЕЕР1 в случае мутации с.606+43G>T проявляется уменьшением количества транслируемого белка КЕЕР1 [5,7].
Клинический осмотр членов данной семьи указал на неосложненную форму наслед-
ственной спастической параплегии. Заболевание было диагностировано у пробанда и его брата (к сожалению, не было возможности взять ДНК для анализа у брата пробанда), имеющих сходные клинические признаки: заболевание манифестировало после 40 лет и довольно быстро прогрессировало. В неврологическом статусе: нижний спастический парапарез с положительными сгибательными и разгибательными патологическими знаками. Походка спастическая, старший брат использует при ходьбе трость. У сына пробанда при отсутствии жалоб выявлены множественные пирамидные симптомы: в виде негрубого повышения мышечного тонуса, оживления сухожильных рефлексов в ногах, клонусов стоп. Сходные клинические симптомы описаны и в других семьях с данной мутацией [7,14].
Третье и четвертое изменения g.120955T>G (ге 141722767) и g.121139T>C (ге141976852) идентифицированы сцеплено у двух пациентов русской и татарской этнической принадлежности. Поиск данных полиморфных вариантов был проведен методом 88СР в этнически соответствующих контрольных группах (100 человек). У одного индивида русской этнической принадлежности также выявлены данные полиморфные варианты. Исходя из результатов частота минорных аллелей в этих локусах составляет среди русских - 1,8%, среди татар - 2,2%, что соответствует частоте в европейских популяциях (2%) [16] и свидетельствует о нейтральном характере данных нуклеотидных замен.
Выводы
Таким образом, у больных с НСП из Республики Башкортостан в гене ЯЕЕР1 идентифицированы две патогенные мутации -не описанная ранее нонсенс-мутация с.225G>A (W75*), выявленная у пациента русской этнической принадлежности со спорадической формой заболевания, и известная мутация в 3'-нетранслируемой области гена, нарушающая сайт связывания с микроРНК -с.606+43G>T, которая обнаружена в башкирской семье с аутосомно-доминантной формой НСП. Вклад генетической формы НСП 8РО31 в структуру заболевания в РБ составил 3,3 %. Клиническая картина НСП у пациентов с описанными мутациями в целом соответствует неосложненной форме заболевания. Полученные данные способствуют познанию патогенеза заболевания, его геногеографии и разработке алгоритма ДНК-диагностики НСП, оптимального для исследуемого региона.
Сведения об авторах статьи: Ахметгалеева Алия Фанильевна - аспирант ФГБУН ИБГ УНЦ РАН. Адрес: 450054, г. Уфа, пр. Октября, 71. E-mail: [email protected].
Хидиятова Ирина Михайловна - д.б.н., профессор, ведущий научный сотрудник ФГБУН ИБГ УНЦ РАН, профессор кафедры генетики и фундаментальной медицины ФГБОУ ВО БГУ. Адрес: 450054, г. Уфа, пр. Октября, 71. Е-mail: [email protected].
Сайфуллина Елена Владимировна - к.м.н., доцент кафедры неврологии с курсами нейрохирургии и медицинской генетики ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России. Адрес: 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3.
Идрисова Римма Фуатовна - врач-невролог ГБУЗ РКБ им. Куватова. Адрес: 450005, г. Уфа, ул. Достоевского, 132. Email: [email protected].
Магжанов Рим Валеевич - д.м.н., профессор, зав. кафедрой неврологии с курсами нейрохирургии и медицинской генетики ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России. Адрес: 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3. Тел./факс: 8 (347) 251-10-07. E-mail: [email protected].
Хуснутдинова Эльза Камилевна - д.б.н., профессор, академик АН РБ, зав. лабораторией молекулярной генетики человека ФГБУН ИБГ УНЦ РАН, зав. кафедрой генетики и фундаментальной медицины ФГБОУ ВО БГУ. Адрес: 450054, г. Уфа, пр. Октября, 71. E-mail: [email protected].
ЛИТЕРАТУРА
1. Hereditary spastic paraplegias with autosomal dominant, recessive, X-linked, or maternal trait of inheritance / J. Finsterer [et al.] // J. of the Neurological Sciences. - 2012. V. 318, №1. - P. 1-18.
2. Fink, J. K. Hereditary spastic paraplegia: clinico-pathologic features and emerging molecular mechanisms / J. K. Fink // Acta neuropathology. - 2013. - V. 126, №3. - P. 307-328.
3. Spectrum of SPG 4 mutations in autosomal dominant spastic paraplegia / N. Fonknechten [et al.] // Hum. Mol. Genetics. - 2000. - V. 9, №4. -P. 637-644.
4. A large Japanese SPG4 family with a novel insertion mutation of the SPG4 gene: a clinical and genetic study / M. Namekawa [et al.] // J. of the Neurological Sciences. - 2001. - V. 185, №1. - P. 63-68.
5. Mutations in the Novel Mitochondrial Protein REEP1 Cause Hereditary Spastic Paraplegia Type 31 / S. Zuchner [et al.] // The Am. J. of Human Genetics. - 2006. - V. 79, №2. - P. 365-369.
6. Exome Sequencing Identifies a REEP1 Mutation Involved in Distal Hereditary Motor Neuropathy Type V / C. Beetz [et al.] // The Am. J. of Human Genetics. - 2012. - V. 91, №1. - P. 139-145.
7. New pedigrees and novel mutation expand the phenotype of REEP1-associated hereditary spastic paraplegia (HSP) / C. Hewamadduma [et al.] // Neurogenetics. - 2009. - V. 10, №2. - P. 105-110.
8. Autosomal dominant hereditary spastic paraplegia: Novel mutations in the REEP1 gene (SPG31) / K. J. Schlang [et al.] // BMC medical genetics. - 2008. - V. 9, №. 1. - P. 1.
9. Эпидемиологическая характеристика наследственных спастических параплегий в Республике Башкортостан / Р. В. Магжанов [и др.] // Медицинская Генетика. - 2013. - №7. - С. 12-16.
10. RTP Family Members Induce Functional Expression of Mammalian Odorant Receptors / H. Saito [et al.] // Cell. - 2004. - Т. 119, №. 5. -P. 679-691.
11. Hereditary spastic paraplegia proteins REEP1, spastin, and atlastin-1 coordinate microtubule interactions with the tubular ER network / S. Park [et al.] // The J. of Clin. Invest. - 2010. - V. 120, №4. - P. 1097-1110.
12. Hereditary Spastic Paraplegia-Linked REEP1 Modulates Endoplasmic Reticulum/Mitochondria Contacts / Y. Lim [et al.] // Annals of neurology. - 2015. - V. 78, №. 5. - P. 679-696.
13. REEP1 Mutations in SPG31: Frequency, Mutational Spectrum, and Potential Association with Mitochondrial Morpho-Functional Dysfunction / C. Goizet [et al.] // Human mutation. - 2011. - V. 32, №10. - P. 1118-1127.
14. Molecular spectrum of the SPAST, ATL1 and REEP1 gene mutations associated with the most common hereditary spastic paraplegias in a group of Polish patients / E. Elert - Dobkowska [et al.] // J. of the Neurological Sciences. - 2015. - V. 359, №1. - P. 35-39.
15. The Human Gene Mutation Database [Электронный ресурс]. // URL: http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php
16. Genome assembly: GRCh38.p7 (GCA_000001405.22) [Электронный ресурс]. // URL: http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Info/Index
УДК 61.617.741-004.1-053.1 © Коллектив авторов, 2016
И.И. Хидиятова1, М.Т. Азнабаев2, И.М. Хидиятова1'3, С.Р. Авхадеева2, Л.У. Джемилева1, Э.К. Хуснутдинова1,3 АНАЛИЗ ГЕНА КОННЕКСИНА 46 (GJA3) У БОЛЬНЫХ НАСЛЕДСТВЕННОЙ ВРОЖДЕННОЙ КАТАРАКТОЙ РЕСПУБЛИКИ БАШКОРТОСТАН
1 ФГБУН Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН, г. Уфа 2 ФГБОУ ВО «Башкирский государственный медицинский университет»
Минздрава России, г. Уфа 3 ФГБОУ ВО «Башкирский государственный университет» Минобрнауки России, г. Уфа
Мутации в гене коннексина 46 считаются одними из частых причин развития наследственной врожденной ка-
таракты (НВК).
Целью исследования явился поиск мутаций в гене GJA3 у больных из Республики Башкортостан с наследственной врожденной катарактой (НВК).
Методом прямого секвенирования проведен анализ кодирующей области гена GJA3 у 40 неродственных больных с НВК из Республики Башкортостан. Идентифицированы три изменения нуклеотидной последовательности гена. Одно из них - ранее не описанная мутация с.del1126_1139(p.Asp376Glnfs*69), приводящая к развитию катаракты, - обнаружено в гетерозиготном состоянии у трех членов семьи с аутосомно-доминантной зонулярной катарактой. Два других изменения
