CC BY
148
АНАЛИЗ ЭНДОГЕННОГО СО В ВЫДЫХАЕМОМ ВОЗДУХЕ МЕТОДАМИ ДИОДНОЙ ЛАЗЕРНОЙ СПЕКТРОСКОПИИ
Е.В. Степанов, А.И. Дьяченко, Ю.А. Шулагин Институт общей физики им. А.М. Прохорова РАН, EugeneStepanov@yandex.ru
Показано, что лазерный анализ СО в выдыхаемом воздухе позволяет исследовать выделение этого газообразного вещества при проведении различных физиологических и медицинских исследований, изучать закономерности и взаимосвязи процессов, отвечающих за продукцию, транспорт, буферирование и выделение СО в организме. Возможности нового подхода продемонстрированы для широкого круга диагностических приложений в биологии и медицине. Описана лазерная аналитическая система, предназначенная для высокочувствительного и высокоселективного исследования газообмена с дыханием у человека и лабораторных животных. Результаты, полученные при клинической апробации разработанных методов и системы, демонстрируют возможность и перспективность использования лазерного анализа СО в выдыхаемом воздухе для целей диагностики и контроля эффективности терапии ряда заболеваний.
Актуальность определения содержания СО в выдыхаемом воздухе, а также разработок аналитических устройств, предназначенных для подобных измерений, обусловлена тем, что моноокись углерода является одним из эндогенных газообразных соединений, играющих значительную роль в жизнедеятельности организма. Особенности процессов ее образования в организме и транспорта от тканей и органов в выдыхаемый воздух в настоящий момент недостаточно хорошо изучены, поэтому разработка методов использования СО в качестве молекулы-биомаркера требует тщательных предварительных исследований.
В организме эндогенный СО образуется в результате ферментативно-управляемого катаболизма гем-содержащих соединений. Основная его продукция обусловлена гемолизом эритроцитарного гема и миоглобина в ходе эритропоэза, направленного на устранение стареющих клеток крови. Кроме того, некоторая доля эндогенного СО образуется при деградации цитохромов и ряда металлосодержащих ферментов, таких как каталаза, пероксидаза, триптофанпирролаза, гуанилатциклаза, NO-синтаза и других. Также возможно образование относительно малого количества СО негемовой природы за счет перекисного окисления липидов, фотоокисления, а также активности ксенобиотиков и некоторых бактерий. Результаты недавних биохимических исследований показывают, что СО в организме является не только конечным продуктом метаболических превращений упомянутых выше соединений, но и сигнальной молекулой (так называемым вторичным мессенджером), участвующей в механизме преобразования сигналов, регуляции клеточного метаболизма и в передаче информации.
Во избежание избыточного накопления СО интенсивно выводится из организма. Для этих целей, помимо диффузии, транспорта в растворенном состоянии и конвективного газообмена, используется специальный механизм обратимого связывания этих молекул гем-содержащими белковыми структурами (гемоглобин, миоглобин, цитоглобин, нейроглобин, цитохром а3), кратковременного буферирования на них и транспорта по градиенту концентраций О2 — от клеток и тканей в легкие. Для выведения СО используется та же цепочка механизмов, с помощью которой осуществляется транспорт кислорода из легких и обеспечение дыхания клеток, только действующая в обратном направлении. В клетках СО может быть связано цитоглобином, нейроглобином или цитохромами а3 (в митохондриях клеток). В тканях СО накапливается на миоглобине, а в крови — на гемоглобине. За счет потока кислорода, проникающего с кровью в ткани и клетки, между этими системами буферирования СО происходит постоянный обмен, так что молекулы СО постепенно продвигаются в направлении от клеток к легким. В легких СО диффундирует из крови в воздушное пространство легких и затем за счет вентиляции при дыхании выводится в атмосферу. На заключительном этапе пребывания эндогенного СО в крови, т.е. в альвеолярных капиллярах, темп его выделения в
воздушное пространство легких находится в непосредственной зависимости от перфузии и эффективности доставки кислорода к альвеолярной мембране легких. Эта эффективность может меняться за счет вариации как газодинамических, так и диффузионных характеристик используемых дыхательных смесей.
Можно выделить несколько наиболее важных процессов, в которых эндогенное СО участвует в организме. Во-первых, СО является вторичным мессенджером для нейромедиаторов и гормонов, поскольку активизирует работу фермента гуанилат-циклазы, участвующей в образовании циклического гуанизинмонофосфата. Последним определяется уровень кальция в клетке, от которого в конечном счете зависит активность протеин-киназ и некоторых биохимических процессов. Кроме того, СО участвует в механизме регуляции тонуса кровеносных сосудов и, возможно, влияет на внутриклеточные механизмы формирования долговременной памяти. Во-вторых, СО разделяет с О2 общую систему транспорта и буферирования, что позволяет использовать его как маркер при исследовании механизмов и самого транспорта кислорода. В-третьих, существуют предположения, что СО выделяется при воспалительных процессах и поэтому может быть использовано как маркер работы антиоксидантной системы. Наконец, в-четвертых, основная функция молекул СО определяется их ролью в регуляции обновления клеток крови, т.е. СО может служить индикатором и маркером катаболизма.
Таким образом, для использования эндогенного СО в качестве биомаркера физиологических процессов существенным является то, что интенсивность выделения СО с выдыхаемым воздухом зависит от скорости продукции СО в организме, биохимических параметров среды в клетках и тканях организма и химического состава вдыхаемой газовой среды. Благодаря этому использование высокочувствительного, высокоточного и селективного мониторинга эндогенного СО в выдыхаемом воздухе может быть актуально и перспективно для исследований:
• интенсивности метаболических, индуцированных и патологических процессов, связанных с образованием СО;
• диффузионных и конвективных процессов переноса кислорода в легких;
• эффективности процессов переноса кислорода кровью от легких к тканям, включая перфузию и тканевую микроциркуляцию;
• интенсивности основного обмена, образования и накопления кислых продуктов в условиях тканевой гипоксии и, возможно, ряда других процессов.
В докладе представлены данные оригинальных экспериментальных исследований основных закономерностей выделения эндогенного СО с выдыхаемым воздухом с помощью методов высокочувствительного лазерного анализа, а также результаты модельного описания этих процессов.
Для детектирования эндогенного СО в выдыхаемом воздухе был разработан высокочувствительный автоматизированный газоанализатор на основе перестраиваемых диодных лазеров (ПДЛ), позволяющий измерять относительно малые концентрации этого вещества, ~ 0.1 млн-1, с точностью ~ 5 % в режиме долговременного мониторинга.
Для высокочувствительного лазерного анализа СО были использованы линии поглощения фундаментальной колебательно-вращательной полосы 1-0, расположенной вблизи 4.7 мкм. Их интенсивности составляют (3-4)-10-19 см-/мол-см- , а коэффициент столкновительного уширения воздухом 0.06-0.08 см-1/атм. Полоса 1-0 СО интерферирует с несколькими слабыми полосами СО2 и Н2О. В данном случае эта интерференция не является существенным фактором, ухудшающим условия детектирования СО в выдыхаемом воздухе, поскольку спектры достаточно разрежены.
Высокочувствительный анализатор СО базируется на использовании диффузионного ПДЛ на основе твердого раствора типа PbSSe. Точный подбор химического состава лазера обеспечивает генерацию в диапазоне 2100-2180 см-1 при температуре жидкого азота (~ 78 К). Для накачки используются короткие импульсы тока амплитудой ~ 1-2 А, длительностью до 100 мкс и частотой повторения ~ 100 Гц. Перестройка частоты генерации лазера происходит со скоростями порядка 5-10-105 см-1/с. Мощность излучения в моде составляет 0.30.5 мВт. Для охлаждения ПДЛ используется заливной оптический криостат с расходом жидкого азота около 1.5 л за сутки. Выбор подходящего режима генерации ПДЛ в данной системе осуществляется только за счет изменения параметров тока накачки. Для повышения концентрационной чувствительности анализа излучение ПДЛ пропускается через многоходовую аналитическую кювету (МХК), съюстированную по схеме Вайта. Объем кюветы составляет ~ 1.2 л при базовой длине кюветы ~ 30 см. Общий оптический путь в МХК составляет ~ 20 м. Для регистрации спектров пропускания СО использована электронная система, базирующаяся на быстродействующем (50 нс) 8-разрядном АЦП. При записи огибающей импульса ПДЛ длительностью 40-60 мкс на линию поглощения СО, сканируемую лазером за время ~ 1.5-2 мкс, приходится около 30-40 точек. Исследуемый спектр пропускания, регистрируется с накоплением 128 раз в течение ~ 5 с. Динамический диапазон регистрации амплитуды сигнала расширяется до 4-10 за счет аппаратного свипирования сигнала.
Для измерения концентрации СО используется прямое детектирование линий поглощения. При автоматической обработке регистрируемого спектра производится определение положения центра аналитической линии, огибающей нуля поглощения, оптического нуля, величины поглощения в максимуме резонанса и ширины линии поглощения на полувысоте. Расчет концентрации СО в исследуемой газовой смеси проводится с учетом длины оптического пути в МХК, температуры, атмосферного давления и спектральных параметров используемой аналитической линии поглощения. Применяемые для расчета параметры линии, заимствованные из банка спектральных данных ШТКА№96, задаются на основе идентификации спектра поглощения СО с помощью изотопомеров 13С16О и 12С18О.
Основные аналитические параметры анализатора СО на основе ПДЛ:
• чувствительность детектирования содержания СО ~ 5 млрд-1,
• точность детектирования ~ 3 %,
• селективность детектирования ~ 100 %,
• время измерения концентрации СО ~ 5 с,
• время перенапуска МХК (по уровню 0.9) ~ 10 с,
• время непрерывного мониторинга не ограничено.
В исследованиях содержания СО в выдыхаемом воздухе анализатор мог использоваться в режиме отбора пробы воздуха за один выдох, в режиме долговременного непрерывного мониторинга дыхания и в режиме накопления микропорций воздуха, соответствующих исследуемой фазе выдоха.
С учетом контролируемой вентиляции, стандартных условий в легких и фонового уровня СО в атмосферном воздухе измеряемая концентрация пересчитывалась в скорость выделения СО организмом. Для исследований особенностей и закономерностей выделения эндогенного СО с выдыхаемым воздухом в различных условиях и при различных состояниях испытуемых описанный анализатор использовался в составе автоматизированного измерительного комплекса, содержащего также анализаторы О2 и СО2, респирометр (датчик дыхательного потока) и пульсоксиметр.
Было продемонстрировано, что лазерный анализ СО в выдыхаемом воздухе позволяет исследовать выделение этого газообразного вещества при проведении различных фундаментальных физиологических и медицинских исследований, изучать закономерности и взаимосвязи процессов, отвечающих за продукцию, транспорт, буферирование и выделение СО в организме. Использование фракционирования воздуха, выделяемого в течение одного выдоха, позволяет разделять части, соответствующие начальной и конечной фазам выдоха. Возможен долговременный непрерывный мониторинг содержания СО в выдыхаемом воздухе или других исследуемых газовых средах.
С помощью разработанной лазерной системы были проведены измерения уровня эндогенного СО в выдыхаемом воздухе в больших группах испытуемых, как практически здоровых, так и с бронхолегочной патологией. Лазерный анализ был применен нами для мониторинга относительно быстрых изменений скорости выделения СО при проведении различных функциональных тестов (физической нагрузки различной мощности и длительности, гипервентиляции различной глубины, задержки дыхания с различными патернами, гипербарии), при изменении состава вдыхаемого воздуха (гипероксии, гипоксии, гиперкапнии, изменении уровня антропогенных загрязнений атмосферного воздуха), при воздействии фармацевтических препаратов. Была продемонстрирована возможность исследований закономерности выделения эндогенного СО лабораторными животными.
Проведенный цикл исследований выделения эндогенного СО с выдыхаемым воздухом позволил установить, что помимо скорости образования СО в организме основными факторами, обусловливающими интенсивность этого процесса, являются: вариации концентрации СО в атмосферном воздухе; парциальное давление кислорода в альвеолах легких и артериальной крови; напряжение растворенного кислорода в тканях и межклеточной жидкости; рН среды в крови, клетках и тканях организма (содержание С02, лактата и других кислых продуктов). Полученные экспериментальные данные дают основание для разработки математической модели, описывающей основные закономерности выделения эндогенного СО с выдыхаемым воздухом, в частности, динамику выделения СО при изменении содержания О2 и СО во вдыхаемом воздухе, а также при изменении химических параметров среды в организме.
Успешная клиническая апробация разработанных методов и приборов указывает на возможность и перспективность использования лазерного анализа СО в выдыхаемом воздухе для целей диагностики заболеваний и контроля эффективности терапии.
Данные исследования проведены при частичной поддержке в рамках Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине, а также проектов РФФИ 05-08-50288-а и 08-02-01185-а.
ANALYSIS OF ENDOGENOUS CARBON MONOXIDE (CO) IN EXHALED AIR WITH TUNABLE DIODE LASER TECHNIQUE
E.V. Stepanov, A.I. Dyachenko, Yu.A. Shulagin
The laser based analysis of endogenous CO in exhalation was demonstrated to be useful in applications to different studies in normal physiology and in diagnostics of some pathology where a data on endogenous CO production, transportation, storage and release could be significant. Possibilities of the new approach were experimentally demonstrated in different diagnostic applications. The laser based analytical system applied for the complex high sensitive and high selective studies of gas exchange with exhalation for man and laboratory animals is described. Previous results of clinical application of this technique are also discussed and demonstrate a possibility for future application of the laser based approach to diagnostics of some diseases as well as to a control of their therapy.
