CC BY
488
УДК 618.19-006.6:612.018.2
АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ОСНОВНЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ: РЕЦЕПТОРОВ ЭСТРОГЕНОВ И ПРОГЕСТЕРОНА, Нег2/пеи И К167
Белгородский
государственный
университет
АА ДОЛЖИКОВ1 Н.З. ПАСЕНОВ АА КОТЛЯРОВ
e-mail: dolgikov@bsu.edu.ru
Исследованы иммунофенотипические свойства 1044 случаев рака молочной железы. Установлена связь рецепторного статуса опухолей и экспрессии белка Нег2/пеи, наибольшая частота его гиперэкс-пресии при полной рецептор-негативности, связь иммунофенотипа опухолевых клеток с возрастом. Пролиферативная активность опухолевых клеток находится в обратной зависимости от содержания рецепторов эстрогенов и прогестерона, с гиперэкспрессией Нег2/пеи прямая связь пролиферативной активности отсутствует. После не-оадьювантной терапии достоверно снижается экспрессия рецепторов эстрогенов и прогестерона, экспрессия Нег2/пеи приобретает артефи-циальный характер.
2Белгородский областной онкологический диспансер
Ключевые слова: рак молочной железы, рецепторы гормонов,
онкомаркеры.
Рак молочной железы (РМЖ) занимает первое место в структуре онкопатологии у женщин [5]. По официальным данным [2] стандартизованный (на 100 000 населения) показатель заболеваемости РМЖ в 2004 году в России составил 63,9 и только в возрастных группах от 15 до 39 лет и старше 70 лет он уступает по частоте раку шейки матки и толстой кишки соответственно.
В последние десятилетия существенно изменились подходы к лечению РМЖ в разных возрастных группах и при разных клинических стадиях, что связанос выявлением многих биологических свойств опухолей, установлениеи их морфологической, иммунофенотипической и генетической гетерогенности [10, 16, 18]. В связи с этим постоянно пересматриваются принципы лечения [8, 16]. Ведущую роль при этом играет полная морфологическая верификация опухоли с определением ее основных биологических свойств, к числу которых относятся уровень экспрессии рецепторов стероидных гормонов, экспрессии маркеров пролиферации, рецепторов факторов роста, выраженность ангиогенеза [1, 4, 17]. Показанная в настоящее время нелинейность и разнообразие взаимосвязей биологических свойств опухолевых клеток РМЖ [6, 15, 18] определяет актуальность их анализа с точки зрения оптимизации тактики индивидуализированного лечения. С другой стороны, неоднозначно воспринимается роль лечебного па-томорфоза в возможности адекватной оценки биологических свойств опухолевых клеток, чему в отечественно литературе посвящены единичные исследования [9].
Выполненное нами исследование основано на анализе результатов определения иммуноморфологических свойств опухолей в 1044 отобранных репрезентативных случаях операбельного рака молочной железы за период с апреля 2006 по январь 2007 года. Изучены случаи только инвазивных карцином. В общем числе наблюдений 911 случаев представлены операционным материалом без предшествовавшей химио-и/или лучевой терапии, а также первичными трепанобиоптатами опухолей, в 133 случаях выполнению иммуноморфологического исследования предшествовали 2 — 4 курса неоадьювантной терапии. Наблюдения были разделены на 2 возрастные группы: до 55 лет и старше, отдельно проанализирована группа в возрасте до 35 лет, существенно отличающаяся биологическими свойствами РМЖ [3, 13]. Возраст больных варьировал от 26 до 86 лет (в среднем 56,3 года).
Иммуногистохимически определены уровни экспрессии рецепторов эстрогенов, прогестерона, маркера пролиферации К167, белка Нег2/пеи, являющегося представителем семейства тирозинкиназных рецепторов эпидермального фактора роста. Все исследования выполнены в соответствии с проколами постановки диагностических реакций с использованием коммерческих диагностических антител фирмы «Рако»: моно-
клональные антитела к рецепторам эстрогенов (клон 1 D5), прогестерона (клон PgR636), белку K167 (клон MIB-1), поликлональные антитела к белку Her2/neu. Демаскировка антигенов осуществлялась по протоколу HIER в трис-ЭДТА буфере (рН=9,о) при температуре 95° в течение 40 минут. Использована полимерная система детекции «Biogenex» (USA), в качестве хромогена диаминобензидин.
Оценку уровней экспрессии рецепторов стероидных гормонов осуществляли по шкале PharmDx. Экспрессию белка Her2/neu оценивали по общепринятой визуальной шкале с диагностикой гиперэкспрессии (3+) при наличии непрерывного мембранного окрашивания в более чем 10% опухолевых клеток в инвазивном компоненте. Пролиферацию оценивали по относительному числу опухолевых клеток со средней и интенсивной ядерной реакцией на Ki67 с разделением результатов на 3 группы: низкий уровень пролиферации — до 10% Ю67-позитивных клеток, средний — от 10 до 30%, высокий — более 30% Ю67-позитивных клеток. Анализ выполняли на компьютерных изображениях, полученных с использованием микроскопа, оснащенного стандартной видеокамерой «DCM-300», программы «ScopePhoto» и программного комлекса для анализа изображений «WCIF ImageJ» (USA).
Все количественные данные регистрировали и статистически обрабатывали в электронных таблицах MS Excel. Достоверность отличий оценивали с использованием непараметрических критериев Пирсона (х2) и Фишера при уровне значимости р<0,05. Вычисляли коэффициент линейной корреляции.
В целом ER-позитивные случаи в группе без неоадьювантной терапии составили 62,7%, PR-позитивные 58,7%. В настоящее время 10% рецептор-позитивных раковых клеток считается достаточным для оценки опухоли как потенциально чувствительной к эндокринной терапии. По этому критерию выделяют три группы: высокочувствительные к эндокринотерапии (экспрессия обоих типов рецепторов), недостаточно чувствительные (низкий уровень экспрессии рецепторов или отсутствие одного из них), нечувствительные (отсутствие рецепторов эстрогенов или прогестерона) [8, 15].
Помимо наличия рецепторов эстрогенов и прогестерона как таковых имеют значение варианты их сочетания. При корреляционном анализе установлена средняя прямая связь между экспрессией рецепторов эстрогенов и прогестерона (r=0,57). Выявлена следующая частота сочетаний экспрессии рецепторов: ER+PR+ 51,6%, ER+PR- 11,0%, ER-PR+ 7,0%, ER-PR- 30,4%. Результаты, полученные нами, сопоставимы с имеющимися в литературе данными [10]. По показателю экспрессии рецепторов в клетках рака молочной железы почти половина больных оказывается в группах промежуточного или высокого риска прогрессирования заболевания.
При сопоставлении двух возрастных групп установлено, что у постменопаузальных больных в опухолевых клетках выше частота экспрессии рецепторов эстрогенов (61,1% против 54,4%; р<0,05), тогда как экспрессия рецепторов прогестерона не отличается (54,9% и 53,2%). Данный факт известен в литературе и является основанием для различной лечебной тактики у пре- и постменопаузальных пациенток. Особую группу составляют пациентки в возрасте до 35 лет. Карциномы молочной железы у них отличаются агрессивностью течения и менее благоприятным прогнозом, чем у пациенток более старших возрастных групп [3, 13]. В анализируемом нами материале таких пациенток было 36. Рецепторный статус опухолевых клеток как по отдельности, так и в сочетании у них резко отличался от общей выборки. ER-позитивные случаи составили только 33,3%, PR-позитивные только 36,1%, полный рецепторный позитив (ER+ PR+) наблюдался лишь в 25,0%, а 58,3% составили наблюдения полного рецепторного негатива, относящиеся к категории высокого риска прогрессирования заболевания.
Одним из важнейших биологических и прогностических маркеров РМЖ является экспрессия белка Her2/neu, повышенный уровень которого (гиперэкспрессия; 3+) ассоциируется с неблагоприятным прогнозом. Частота гиперэкспресии варьирует по разным данным от 10 до 35%, что определяется шкалой оценки [18], но в большинстве рандомизированных исследований она составляет 15-20%. В проанализированном нами материале гиперэкспрессия Her2/neu в группе без неоадьювантной терапии составила в целом 14,5%, не отличаясь в возрастной группе до 55 лет и старше (14,7% и 14,2%). Гиперэкспрессия Her2/neu достоверно чаще имеется в случаях полного рецеп-
торного негатива (до 26,1%). Заслуживает внимания достоверное отличие частоты гиперэкспрессии Нег2/пеи при двух различных вариантах отсутствия одного из рецепторов стероидных гормонов. В случаях ЕР- РР+ статуса гиперэкспрессия Нег2/пеи имелась в 2-3 раза чаще, чем при ЕР+ РР-. Традиционным является мнение, что экспрессия рецепторов прогестерона определяется функциональной активностью рецепторов эстрогенов и прямо ее отражает. Однако имеются данные, что активность рецепторов прогестерона зависит также от сигнальных путей между ростовыми факторами и рецепторами экстрогенов, гиперактивность которых может подавлять синтез рецепторов прогестерона [14]. Нами выше уже отмечено, что линейная корреляционная связь между уровнями рецепторов эстрогенов и прогестерона средняя. В эпидемиологических исследованиях также показано, что уровень содержания рецепторов прогестерона может являться независимым прогностическим фактором [10], в частности, для срока развития рецидива. При РР-статусе опухоли срок наступления редидива короче, чем при ЕР-, а при РР+ опухолях рецидив возникает позже, чем при ЕР+ РМЖ [6]. В группе молодых пациенток (< 35 лет) гиперэкспрессия Нег2/пеи нами в целом выявлена в 16,7%, а в группе ЕР- РР- статуса ее частота составила 23,8%.
Достоверным маркером пролиферативной активности клеток является белок Ю67, который экспрессируется начиная с поздней в1 фазы клеточного цикла, в Б, в2 и М фазах и, таким образом, позволяет выявлять весь пролиферативный пул опухоли. Считалось, что поскольку эстрогены обладают пролиферативным действием на гормонально-зависимые клетки, в том числе и опухолевые, то высокий уровень рецепторов эстрогенов должен прямо коррелировать с пролиферативной активностью. Однако полученные нами данные свидетельствуют против такой линейной зависимости и указывают на существование более сложных гормональных путей влияния на пролиферацию, по крайней мере, в раке молочной железы. В группах с полностью позитивным рецепторным статусом (ЕР+ РР+) высокий уровень пролиферативной активности (более 30% К167-позитивных клеток) выявлен только в 20%, тогда как низкий уровень выявлен в 60% наблюдений. Напротив, при полном рецепторном негативе (ЕР- РР-) в 60,9% случаев имелся высокий уровень пролиферации. Коэффициент линейной корреляции между экспрессией рецепторов эстрогенов и Ю67 составил — 0,46; для рецепторов прогестерона данный показатель — 0,40. Таким образом, выявляется обратная корреляционная зависимость между уровнями рецепторов эстрогенов и прогестерона и пролиферативной активностью.
Связь гиперэкспрессии Нег2/пеи с пролиферацией, определяемой по реакции на К167, оказалась незакономерной. Среди случаев с гиперэкспрессией Нег2/пеи более чем в 70% выявлен высокий индекс К167, однако линейной корреляции между данными показателями нет (г=0,07).
Г.А. Раскиным и С.В. Петровым [7] также обнаружен более высокий уровень пролиферации в эстроген-рецептор негативных случаях, что авторами расценивается как свидетельство наличия гормонально независимого механизма активации пролиферации опухолевых клеток. Основным кандидатом для этого является онкоген и белок Нег2/пеи. Однако и в этом случае пути действия на пролиферативную активность клеток не имеют вид прямого каскада, так как гиперэкспрессия Нег2/пеи приводит к исчезновению на клеточной мембране а2в1 интегрина и Е-кадгерина, что нарушает киназный путь стимуляции деления клеток. Отсутствие прямой связи между гиперэкспрессией Нег2/пеи и пролиферацией может быть объяснено количественным, а не качественным характером влияния Нег2/пеи.
После неоадьювантной терапии результаты иммуногистохимических исследований отличаются высокой частотой артефактов и сложных для оценки картин. Исследованная нами группа после лечения представлена 133 наблюдениями. После неоадь-ювантной терапии происходит статистически значимое снижение числа рецептор-позитивных случаев и еще более значимое увеличение частоты полного рецепторного негатива. Типичными для умеренной и выраженной степеней лечебного патоморфоза являются артефакты в виде цитоплазматической реакции на рецепторы гормонов, фрагментарной мембранной и диффузной, или в виде пятен цитоплазматической реакции на Нег2/пеи, которые оценке не подлежат и делают результаты исследования
неадекватными. Более того, после неоадьювантной терапии увеличилась частота выявления гиперэкспрессии Her2/neu, составившая в среднем 20,7%, и в большей степени она возросла в возрастной группе до 55 лет (24%; в группе старше 55 лет - 17,9%). Однако результаты, полученные при сравнении разнородных групп, совпали с данными, полученными при исследовании до и после терапии у одних и тех же пациенток, только в отношении изменений рецепторного статуса. Таких наблюдений у нас имелось 19. Изменения экспрессии Her2/neu следующие: в 5 случаях она снизилась, в 10 осталась неизменной, в 4 повысилась, но из них истинным повышением следует считать только 3 наблюдения, в которых выявлена гиперэкспрессия онкобелка. В последних опубликованных в литературе данных [9], основанных также на небольших сериях наблюдений (29 пациентов) аналогично указывается на преимущественное отсутствие изменений Her2/neu статуса рака молочной железы после неоадьювантной терапии и равнозначность повышения и понижения уровня экспрессии Her2/neu.
На основании проведенных исследований можно сделать следующие выводы.
1. Зависимость экспрессии рецепторов эстрогенов и прогестерона не является линейно детерминированной, а находится под влиянием других факторов, в частности Her2/neu.
2. В возрасте до 35 лет наблюдается наиболее неблагоприятный иммунофенотип, характеризующийся преобладанием рецептор-отрицательности, которая более чем в половине случаев полная, а также относительно высокой частотой гиперэкспре-сии Her2/neu, особенно при ER- PR- рецепторном статусе.
3. Связь между содержанием рецепторов эстрогенов, прогестерона и пролиферативной активностью опухолевых клеток имеет обратный характер. Высокая пролиферативная активность достоверно чаще наблюдается при полном рецептор-отрицательном статусе. Зависимость между уровнем пролиферативной активности и гиперэкспрессией Her2/neu разнонаправленная и вероятнее определяется взаимодействием промежуточных механизмов регуляции клеточного цикла.
4. После неоадьювантной терапии в опухолевых клетках рака молочной железы происходит значимое снижение экспрессии рецепторов эстрогенов и прогестерона. Экспрессия Her2/neu приобретает артефициальный характер и меняется незакономерно.
Литература
1. Герштейн Е.С., Кушлинский Н.Е. Тканевые маркеры как факторы прогноза при раке молочной железы // Практическая онкология / Под ред. С.А. Тюляндина, В.М. Моисеенко. — СПб.: Центр ТОММ, 2004. — С. 41 — 50.
2. Давыдов М.И., Аксель Е.М. Заболеваемость злокачественными новообразованиями населения России и стран СНГ в 2004 г. // Вестник РОНЦ им. Н.Н. Блохина, 2006. — т. 17. — № 3 (прил.). — С. 45 — 77.
3. Дамениа А.О., Туркевич Е.А., Семиглазов В.Ф. и др. Биологические особенности опухоли у больных раком молочной железы моложе 35 лет // Вопр. онкологии. — 2007. — Т. 53. — № 6. — С. 674 — 676.
4. Ермилова В.Д. роль современной патоморфологии в характеристике рака молочной железы // Практ. Онкология. — 2002. — Т. 3. — № 1. — С. 15 — 20.
5. Иванов В.Г. Эпидемиологические факторы риска, ранняя диагностика рака молочной железы // Практическая онкология / Под ред. С.А. Тюляндина, В.М. Моисеенко. — СПб.: Центр ТОММ, 2004. — С. 15 — 21.
6. Поддубная И.В., Комов Д.В., Колядина И.В. и др. Вличние рецепторного статуса первичной опухоли на срок наступления локальных рецидивов рака молочной железы // Материалы XI Российского онкологического конгресса. — М., 2007. — С. 161.
7. Раскин Г.А., Петров С.В. Влияние сверхэкспрессии Her2 на пролиферацию в раке молочной железы / / Вопр. онкологии. — 2007. — Прил. 1. — С. 22- 23.
8. Семиглазов В.Ф. Современные стандарты лечения рака молочной железы (по материалам X Международной конференции по раку молочной железы в Сант-Галлене, 2007) // Материалы XI Российского онкологического конгресса. — М., 2007. — С. 16 — 20.
9. Фролов А.С., Шайдоров М.В., Ермаков В.Е. и др. Влияние неоадьювантной химиотерапии на ИГХ-статус опухоли при раке молочной железы Материалы XI Российского онкологического конгресса. — М., 2007. — С. 166.
10. Bardou V-J., Arpino G., Elledge R.M. et al. Progesterone receptor status significantly improves outcome prediction over estrogen receptor status alone for adjuvant endocrine therapy in two
A.A. ^o^^hkob h gp. AHa^H3 экспpесснн ochobhmx ...
57
large breast cancer databases // J. of Clin. Oncol. - 2003. - Vol. 21. - N 10. - P. 1973 - 1979.
11. Cipollini G., Tomassi S., Paradiso A. et al. Genetic alterations in hereditary breast cancer // Ann. of Oncol. - 2004. - Vol. 15. - P. i7 - i13.
12. Colleoni M., Minchella I., Mazzarol G. et al. Response to primary chemotherapy in breast cancer patients with tumors not expressing estrogen and progesterone receptors // Ann. of Oncol. -2000. - Vol. 11. - P. 1057 - 1059.
13. Colleoni M., Rotmensz N., Robertson C. et al. Very young women (<35 years) with operable breast cancer: features of disease at presentation // Ann. of Oncol. - 2002. - Vol. 13. - P. 273 - 279.
14. Cui X., Schiff R., Arpino G. et al. Biology of progesterone receptor loss in breast cancer and its implications for endocrine therapy // J. of Clin. Oncol. - Vol. 23. - N 30. - P. 7721 - 7735.
15. Goldhirsch A., Glack J. H., Gelber R.D. et al. Meeting highlights: International expert consensus on the primary therapy of early breast cancer 2005 // Ann. of Oncol. - 2005. - Vol. 16. -P. 1569 - 1583.
16. Hilakivi-Clarke L. Estrogen, BRCA1, and breast cancer // Cancer res. - 2000. - Vol. 15. -P. 49993 - 5001.
17. La Castagnetta, Traina A., Liquoru M. et al. Quantitative image analysis of estrogen and progesterone receptors as a prognostic tool for selecting breast cancer patients for therapy // Anal. Quant. Cytol. Histol. - 1999. - Vol. 21. - N 1. - P. 59 - 62.
18. Wolff A.C., Hammond E.H., Schwartz J.N. et al. American society of clinical oncology/College of American pathologists guideline recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer // J. of Clin. Oncol. - 2007. - Vol. 25. - N 1. - P. 1 - 28.
ANALISIS OF EXPRESSION OF THE MAJOR BIOLOGICAL MARKERS OF THE BREAST CANCER: RECEPTORS OF ESTROGENS AND PROGESTERONE, HER2/NEU AND KI67
2 Belgorod regional oncology dispanser
A.A. DOLZHIKOV1 N. Z. PASENOV2 A.A. KOTLYAROV2
Belgorod State University e-mail:dolgiko v@bsu. edu. ru
Immunophenotypic features of 1044 cases of breast cancer were examined. The relationship between receptor status and Her/2 neu expression, high rate of overexpression associated with full receptor-negative status, age dependence of immunophenotype were established. The proliferation of cells is characterized by reverse links with estrogen and progesterone receptors content; there are no direct links between Her2/neu overexpression and proliferation of tumor cells. After chemotherapy the level of estrogen and progesterone receptors decreases, Her2/neu expression is characterized by artifitial type of reaction.
Key words: breast cancer, hormone receptors, oncomarkers
