CC BY
190
Химия растительного сырья. 2003. №1. С. 73-77
УДК 615:3
АНАЛИЗ АРБУТИНА ПОДЗЕМНЫХ И НАДЗЕМНЫХ ВЕГЕТАТИВНЫХ ОРГАНОВ БАДАНА ТОЛСТОЛИСТНОГО (BERGENIA CRASSIFOLIA (L.) FITSCH.), ПРОИЗРАСТАЮЩЕГО НА АЛТАЕ
© Л.М. Федосеева
Алтайский государственный медицинский университет, Барнаул (Россия) e-mail: [email protected]
Целью работы является анализ арбутина корневищ, зеленых, красных и бурых листьев бадана толстолистного. В результате проведенных исследований на основании цветных реакций, бумажной, тонкослойной, высокоэффективной жидкостной хроматографии, фотоэлектроколориметрического и спектрофотометрического определения проведена идентификация и установлено количественное содержание арбутина, которое составило в корневищах 6,46%, зеленых листьях - 15,53%, красных - 7,69%, бурых - 4,43%.
Введение
Бадан толстолистный - вечнозеленый травянистый многолетник, высота 10-60 см, с мощным ветвистым горизонтальным мясистым корневищем, имеющем 1-2 см в поперечнике, длина до 2 м, густо покрыто, особенно в верхней части, остатками черешков отмерших листьев. Верхушка корневища и его ветвей дает ежегодную розетку листьев и один цветоносный стебель. Листья в количестве от 1 до 12 -прикорневые, длинночерешковые, кожистые, на верхней стороне блестящие, на нижней стороне с точечными железками. Они широкоэллиптические или почти округлые, при основании сердцевидные, край редко зубчатый; длина листовой пластины 3-35 см, ширина 2,5-30 см [1].
Поскольку бадан развивается несколько лет, на одном растении находятся бурые, красные и зеленые листья.
Бадан толстолистный - одно из немногих растений, содержащих комплекс фенольных соединений, значительное количество которого составляет арбутин (до 22%) [2]. Арбутин - п-гидроксифенил-D-глюкопиранозидон, является фенологликозидом [3].
Первые сведения о природе арбутина появились в 1762 г., когда Модел выделил химически чистое и фармакологически активное вещество из листьев толокнянки. Из бадана арбутин впервые выделен А.Е. Чичибабиным с сотрудниками в 1931 г., где он содержится в свободном состоянии, а в листьях толокнянки и брусники в виде метиларбутина [4].
Арбутин представляет собой бесцветные кристаллы с температурой плавления 199-200° С, растворяется в воде и этиловом спирте, не растворяется в этиловом эфире, хлороформе [3]. Как все фенольные гликозиды, арбутин оптически активен в связи с присутствием в молекуле глюкозы. Арбутин -О-гликозид, характеризуется способностью к ферментативному и кислотному гидролизу, при сухой перегонке расщепляется на гидрохинон и глюкозу [5].
Целью настоящей работы является качественное и количественное определение арбутина в корневищах, зеленых, красных и бурых листьях бадана толстолистного.
Объектом исследований служило сырье, собранное в республике Алтай в 1996-2001 гг.
Экспериментальная часть
Для идентификации арбутина использовали цветные реакции, хроматографические методы анализа.
Качественный анализ арбутина проводили с водными вытяжками из сырья. В качестве контроля использовали раствор арбутина-стандарта (РСО).
ГФ Х1 издания ст. 26 «Листья толокнянки» регламентирует реакции на арбутин с сульфатом закисного железа и фосфорномолибденокислым натрием [6].
Реакции взаимодействия арбутина с сульфатом закисного железа и натрия фосфорномолибденокислым имеют недостатки, так как соли железа образуют комплексные соединения с полифенолами, а содержание в бадане дубильных веществ мешает определению арбутина. Изучалась возможность проведения реакций до и после осаждения полифенолов ацетатом свинца.
Кроме фармакопейных реакций, предложены реакции образования антипиринового красителя (с 4-аминоантипирином) и азокрасителя (с реактивом Паули) как качественные реакции на арбутин. Образование красителей связано с наличием в молекуле арбутина фенольного гидроксила [7-9].
Хроматография на бумаге водных извлечений осуществлялась восходящим методом на быстро фильтрующей бумаге марки «РШхак» и БМ-3 типа медленная и быстрая; хроматография в тонком слое сорбента - на пластинках «81ШЫ» в системах растворителей: 1 - раствор уксусной кислоты 15%, 2 -раствор уксусной кислоты 60%, 3 - этилацетат - муравьиная кислота - вода (3 : 1 : 1).
Последующую идентификацию арбутина осуществляли, используя высокоэффективную жидкостную хроматографию и спетрофотометрию. Для очистки от сопутствующих и балластных веществ исследуемые извлечения пропускали через колонку с оксидом алюминия II степени активности. Измеряли спектры элюата на спектрофотометре СФ-26 и хроматографе «Милихром».
Количественное определение арбутина проводили йодометрическим методом титрования [6], фотоэлектроколориметрическим методом, в основе которого лежит реакция образования азокрасителя с диазотированным сульфаниламидом (сульфацил-натрий) [7], спектрофотометрическим методом,
основанном на измерении оптической плотности в видимой области спектра после получения антипиринового красителя [10-12].
Обсуждение результатов
В результате эксперимента установлено, что сульфат железа (II) с испытуемыми растворами до осаждения полифенольных соединений давал черно-синюю окраску, аналогично гидролизуемым дубильным веществам. После осаждения образовалась голубая окраска растворов, как и у арбутина-стандарта.
Натрий фосфорномолибденовокислый давал синюю окраску испытуемых растворов до и после осаждения полифенолов.
Проводились реакции образования антипиринового красителя (с 4-амино-антипирином) и азокрасителя (с реактивом Паули) как качественные реакции на арбутин. Результаты представлены в таблице 1.
Определена чувствительность реакций для обнаружения арбутина в лекарственном сырье. Готовили серию стандартных разведений с концентрацией от 300 до 12,5 мкг/мл. Результаты представлены в таблице
2, из данных которой следует, что чувствительность реакции с натрий фосфорномолибденовокислым составила 12,5 мкг/мл, с 4-аминоантипирином - 25 мкг/мл, с реактивом Паули - 50 мкг/мл. Наибольшей чувствительностью обладала реакция с натрием форфорномолибденовокислым.
Таблица 1. Результаты проведения реакций окрашивания арбутина бадана толстолистного
Окраска исследуемых извлечений
Реактивы арбутин свидетель до осаждения полифенолов после осаждения полифенолов
листьев зеленых листьев красных корневищ листьев зеленых листьев красных корневищ
Сульфат железа (II) синяя черно- черно- черно- синяя синяя синяя
фиолетовая фиолетовая фиолетовая
Натрий фосфорно- синяя синяя синяя синяя синяя синяя синяя
молибденовокислый
4-аминоантипирин красная красная красная красная красная красная красная
Реактив Паули красная красная красная красная красная красная красная
Таблица 2. Результаты определения чувствительности реакций идентификации арбутина
Реактив
Концентрация растворов, мкг/мл
300 100 50 25 12,5
Натрий фосфорномолибденовокислый синее синее голубое голубое голубое
4-аминоантипирин красное красное розовое розовое желто-
оранж.
Реактив Паули красное красное оранж. желто- желто-
оранж. оранж.
В результате хроматографирования на бумаге в видимом свете пятен исследуемого вещества и «свидетеля» не обнаружено. В УФ-свете пятна бледно-фиолетового цвета. Значения рассчитывали после проявления хроматограмм реактивом Паули - красные пятна. Проявляющиеся пятна исследуемого вещества и «свидетеля» по цвету и значениям совпадали (табл. 3). В системе уксусная кислота 15% =
0,87; уксусная кислота 60% = 0,84; этилацетат - муравьиная кислота - вода (3 : 1 : 1) = 0,90 - самое
высокое значение. Эта система растворителей обладала хорошей разделяющей способностью и воспроизводимостью результатов.
В результате проведения хроматографии в тонком слое сорбента в Уф-свете наблюдали фиолетовую флуоресценцию пятен на пластинах в системе: 60% уксусная кислота. Хроматограмму проявляли реактивом Паули. Зона вещества исследуемых извлечений и арбутина- стандарта совпали, величина
= 0,88±0,01. В системе 1 и 3 разделение веществ не происходило.
Наличие в молекуле арбутина остатка гидрохинона с достаточной сопряженной системой предполагает поглощение света определенной длины волны с максимумом поглощения при X = 220 в УФ-области, поэтому для идентификции арбутина использовали спектрофотометрические методы.
Предварительно водное извлечение освобождали от примесей. Для очистки от сопутствующих и балластных веществ исследуемые извлечения через колонку с оксидом алюминия II степени активности. Измеряли спектры элюата и арбутина-свидетеля на спектрофотометре СФ-26 и хроматографе «Милихром».
В результате получили спектры исследуемых элюатов и раствора арбутина-свидетеля, идентичные по конфигурации кривой и положению максимумов и минимумов. Для УФ-спектра арбутина характерно два максимума поглощения при X = 220 и 284 нм. По данным литературы для спектра арбутина характерен максимум поглощения при X = 220 нм [11]. Нами подтверждено наличие двух максимумов поглощения арбутина в УФ-области с помощью ВЭЖХ и спектрофотометрии.
Для количественного определения арбутина ГФ Х1 (ст. 26 «Листья толокнянки») рекомендует йодометрический метод титрования [6].
Листья и корневища бадана помимо арбутина содержат свободный гидрохинон, дубильные вещества, флавоноиды, аскорбиновую кислоту. Мы полагаем, что йодометрическое определение арбутина бадана малоспецифично, поскольку после осаждения полифенольных соединений основным ацетатом свинца в извлечении остаются вещества, способные легко окисляться йодом (гидрохинон, катехины, аскорбиновая кислота и др.).
Таблица 3. Результаты определения Я арбутина после хроматографирования на бумаге в системах:
уксусная кислота 15 и 60%, этилацетат - муравьиная кислота - вода (3 : 1 : 1) (п = 5, 1р = 2,571, Р = 95%)
Значение
Системы растворителей зеленые листья красные листья бурые листья корневища арбутин- свидетель
Уксусная кислота 15% 0,87±0,02 0,87±0,02 0,87±0,02 0,87±0,02 0,87±0,02
Sx=0,011 Sx=0,011 Бх=0,0П Sx=0,011 Sx=0,011
Уксусная кислота 60% 0,83±0,03 0,84±0,01 0,84±0,01 0,84±0,01 0,84±0,01
Sx=0,03 Sx=0,005 Бх=0,005 Sx=0,005 Sx=0,005
Этилацетат - 0,90±0,01 0,90±0,02 0,90±0,01 0,90±0,02 0,90±0,01
муравьиная кислота -вода (3 : 1 : 1) Sx=0,01 Sx=0,01 Бх=0,01 Sx=0,01 Sx=0,01
При титровании арбутина раствором йода точка эквивалентности устанавливается визуально по изменению окраски индикатора, что может привести к ошибке. Кроме того, фармакопейный метод определения арбутина длителен (занимает около 5 ч).
С учетом изложенного проведены исследования возможности применения для количественного определения арбутина бадана физико-химических методов.
Фотоэлектроколориметрический метод. В основе лежит реакция образования азокрасителя после взаимодействия арбутина с диазотированным сульфаниламидом (сульфацил-натрий).
Количественное содержание арбутина определяли по калибровочному графику, для построения которого использовали от 0.6 до 4,2 мл 0,03% водного раствора арбутина. Подчиненность закону Бугера-Ламберга-Бера отмечалась в диапазоне концентраций арбутина 7,9-19,8 мкг/мл. Нижним пределом обнаружения арбутина является концентрация 6,3 мкг/мл (табл. 4).
В методике рекомендовано проводить осаждение полифенолов раствором свинца ацетата основного. Определены потери арбутина, которые составили около 1,5% (табл. 5). Таким образом, очистка извлечения от сопутствующих полифенольных соединений раствором свинца ацетата основного влечет потери арбутина, что сказывается на результатах количественного определения фотоколориметрическим методом.
Спектрофотометрический метод основан на измерении оптической плотности в видимой области спектра после получения антипиринового красителя.
Методика была модифицирована: 0,5 г (т.н.) измельченного сырья помещали в колбу, приливали 50 мл воды и кипятили в течение 30 мин. После охлаждения фильтровали в мерную колбу на 100 мл. Извлечение повторяли. Объединенные вытяжки доводили водой до метки 2,5 мл раствора переносили в делительную воронку, разбавляли водой до 25 мл, прибавляли 0,3 мл 2% водного раствора 4-аминоантипирина, 1 мл аммиака, 1 мл 2% водного раствора калия феррицианида. Окрашенный продукт извлекали 10 мл хлороформа. Хлороформную вытяжку процеживали в мерную колбу на 25 мл. Операцию повторяли дважды. Объединенные хлороформные растворы доводили хлороформом до метки и измеряли оптическую плотность окрашенного продукта на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 455 нм.
Результаты количественного определения арбутина в зеленых листьях бадана по методике ГФ Х1 издания, фотоэлектроколориметрическим и спектрофотометрическим методами представлены в таблице 6, из данных которой следует, что наименьшую относительную ошибку давал спектрофотометрический метод определения арбутина 3,71%, который характеризуется точностью и простотой выполнения. Фотоэлектроколориметрический метод давал относительную ошибку 6,54% в связи с тем, что в методике предусмотрено осаждение сопутствующих полифенольных соединений, что приводило к соосаждению и арбутина. Йодометрический метод давал завышенные результаты вследствие неспецифичности используемой реакции.
Рекомендуем для количественного определения арбутина в сырье бадана спектрофотометрический метод.
В результате спектрофотометрического определения содержание арбутина в зеленых листьях составило 15,53±0,39%, красных - 7,69±0,15%, бурых - 4,43±0,17%, корневищах - 6,46±0,14%.
Таблица 4. Результаты определения оптической плотности арбутина для построения калибровочного
графика
Объем аликвоты, мл Концентрация разведения, мкг/мл Оптическая плотность
Б1 Б2 Б3 Бср
0,6 3,96 0,028 0,026 0,026 0,027
1,2 7,92 0,071 0,071 0,070 0,070
1,8 11,88 0,112 0,112 0,112 0,112
2,4 15,81 0,160 0,160 0,160 0,160
3,0 19,80 0,213 0,210 0,203 0,208
3,6 23,76 0,238 0,239 0,232 0,238
4,4 27,72 0,290 0,290 0,283 0,287
Таблица 5. Результаты определение потерь арбутина при осаждении сопутствующихполи фенолов
№ Содержание арбутина, %
опыта до осаждения полифенолов после осаждения полифенолов
1 9,23 8,04
2 10,79 8,32
3 9,48 8,52
4 10,06 8,39
5 9,42 7,86
Хср 9,83±0,45 8,23±0,34
Sx 0,4825 0,2763
E 4,6% 4,06%
Таблица 6. Результаты количественного определения арбутина в листьях бадана различными методами
№ опыта Йодометрический метод, % Фотоэлектроколориметрия, % Спектрофотометрия,%
1 20,17 9,30 15,35
2 16,99 11,41 15,46
3 17,02 10,66 15,06
4 18,26 12,29 15,54
5 17,65 11,93 15,35
Хср 18,01 ±1,62 10,8 2 ±0,70 15,53±0,39
Sx 0,9421 0,8623 0,3195
E 6,40% 6,54% 3,71%
Выводы
В результате проведенных исследований на основании цветных реакций, бумажной, тонкослойной и высокоэффективной хроматографии, спектрофотометического метода определения в корневищах, зеленых, красных и бурых листьях бадана идентифицирован арбутин.
Модифицированы методики качественного и количественного определения арбутина в бадане толстолистном.
Модифицирована и доказана целесообразность количественного определения арбутина в лекарственном растительном сырье спектрофотометрическим методом.
В результате спектрофотометрического определения содержание арбутина в зеленых листьях составило 15,53±0,39%, красных - 7,69±0,15%, бурых - 4,43±0,17%, корневищах - 6,46±0,14%.
Список литературы
1. Гаммерман А.Ф., Кадаев Г.Н., Яценко-Хмелевский А.А. Лекарственные растения (Растения-целители). 3-е изд. М., 1984. 400 с.
2. Шнякина Г.П., Седельникова В.А., Цыганкова Н.Б. О содержании арбутина в листьях некоторых растений Советского Дальнего Востока // Раст. ресурсы. 1981. Т. 17. Вып. 4. С. 568-571.
3. Краткая химическая энциклопедия. М., 1961. Т. 1. 645 с.
4. Чичибабин А.Е. Недубильные вещества экстракта корневищ бадана. Арбутин // Докл. АН СССР. Серия А. М., 1930. С. 23.
5. Иванов И.И. Ферментативное расщепление арбутина // Методы физиологии и биохими растений. М.; Л., 1946. С. 243-246.
6. Государственная фармакопея СССР. 11-е изд. М., 1990. Вып. 2. 398 с.
7. Браиловская В.А., Лукьянчикова Г.И. Фотоколориметрическое определение арбутина в листьях толокнянки // Фармация. 1972. №3. С. 31-32.
8. Федосеева Л.М., Малолеткина Т.С. Выделение некоторых фенольных соединений и идентификация арбутина зеленых листьев бадана // Химия растительного сырья. 1999. №3 С. 109-111.
9. Горбунцова Н.М., Федосеева Л.М., Горбикова О.А. Качественное определение арбутина в листьях бадана // Актуальные проблемы фармации: Сб. науч. тр. Барнаул, 1995. С. 189-196.
10. Горбунцова Н.М., Федосеева Л.М., Горбикова О.А. Количественное определение арбутина в листьях бадана // Актуальные проблемы фармации: Сб. науч. тр. Барнаул, 1995. С. 196-199.
11. Китанов Г. Содержание арбутина в Arctostaphylos uva ursi из разных районов НРБ // Растит. ресурсы. 1986. №3. С. 425-428.
12. Pearl I.A., Darling S.F. Spectrometry as an aid for determining structures ol naturall glucosides // Phytochem. 1989. Vol. 7. №5. P. 831-836.
Поступило в редакцию 21 апреля 2003 г.
