CC BY
70
УДК 664:543
Табл. 2. Библ. 10.
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕРОКСИДНОГО ОКИСЛЕНИЯ БЕЛКОВ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
Куликовский А.В., канд. техн. наук, Николаева А.С., Насонова В.В., канд. техн. наук, Иванкин А.Н., доктор хим. наук ФГБНУ «ВНИИМП им. В.М. Горбатова»
ANALYTICAL POSSIBILITIES DETERMINATION OF PEROXIDE OXIDATION ANIMAL PROTEINS
Kulikovskii A.V., Nikolaeva A.S., Nasonova V.V., Ivankin A.N.
The V.M.Gorbatov All-Russian Meat Research Institute
Ключевые слова:
пероксидное окисление, карбонильные группы, белки, активные формы кислорода (АФК]
Реферат
Окислительная модификация белков играет ключевую роль в молекулярных механизмах окислительного стресса и может являться пусковым механизмом окислительной деструкции других молекул (липиды, ДНК) клетки. Проведенные исследования позволили оценить степень окислительной модификации белков по содержанию карбонильных групп, которые образуются в белковой молекуле в основном в результате прямого окисления некоторых аминокислотных остатков свободными радикалами. Метод определения продуктов перекисного окисления белков основан на том, что конечные продукты свободнорадикального окисления белков могут количественно реагировать с 2,4-динитрофенилгидразином (2,4-ДНФГ) с образованием 2,4-динитрофенилгидразонов. Оптическую плотность опытной пробы измеряли при 370 нм относительно контрольной пробы, обработанной 2,5 М HCl на спектрофотометре. Определение окисленных групп белков как маркеров окислительного стресса имеет ряд преимуществ. Карбонильные группы являются химически стабильными соединениями, чем конечные продукты свободнорадикального окисления липидов, например малоновый диальдегид.
Keywords:
peroxidation, carbonyl groups, proteins, reactive oxygen species (ROS)
Summary
Oxidative modification of proteins plays a key role in the molecular mechanisms of oxidative stress and may be a trigger mechanism of oxidative degradation of other molecules (lipids, DNA) cells. The studies assess the extent allowed oxidative modification of proteins on the content of carbonyl groups, which are formed in the protein molecule, mainly due to the direct oxidation of certain amino acid residues by free radicals. Method for determination of protein peroxidation products is based on the fact that the final products of free radical oxidation of proteins can react quantitatively with 2,4-dinitrophenylhydrazine (2,4-DNPH) to form 2,4-dinitrophenylhydrazone. Ab-sorbance test sample was measured at 370 nm against a control sample treated with 2.5 M HCl in a spectropho-tometer. Determination of oxidized groups of proteins like oxidative stress markers have several advantages. Carbonyl groups are chemically stable compounds than the end-products of free radical oxidation of lipids, such as malondialdehyde.
Введение
В обзоре представлены данные, касающиеся изучения механизмов пероксидного окисления липидов, его роли в нормальном функционировании клеток, в патогенезе различных заболеваний. Однако активные формы кислорода (АФК) могут вызывать окислительную деструкцию не только липидов, но и белков. Окислительная модификация белков играет ключевую роль в молекулярных механизмах окислительного стресса и может являться пусковым механизмом окислительной деструкции других молекул (липиды, ДНК) клетки [1].
В последние годы особенно большое внимание уделяется изучению роли АФК в метаболизме белков. Вызвано это, во-первых, тем, что белки оказались наиболее чувствительными к свободнорадикальному окислению по сравнению с другими биомолекулами, и, как полагают, их окисление является наиболее ранним показателем усиления продукции АФК. Во-вторых, интерес к окислительной модификации белков обусловлен той важной ролью, которую белки играют в живой клетке и в организме. Окислительная модификация белков (ОМБ) инициируется главным образом
реакцией с ОН -радикалом. Однако течение процесса окисления определяется доступностью О2 и О2 , или его протонизированной формой (ОН2). В совокупности эти АФК могут приводить к окислению белковых остовов, следствием чего является фрагментация белков, образование белок-белковых сшивок [2].
Помимо белковых остовов окислению подвергаются так же и аминокислоты боковых цепей. Поскольку формируются различные белковые продукты окисления необходимо использовать соответствующий метод для анализа окислительного стресса. Выбор специфического или общего анализа может также зависеть и от цели исследования.
Пути и конечные продукты окислительной модификации белков крайне сложны и многообразны, однако существует ряд характерных химических форм, которые образуются в большинстве случаев. К таким продуктам окисления относятся карбонилпроиз-водные белков [3].
Определение окисленных групп белков как маркеров окислительного стресса имеет ряд преимуществ. Так, карбонильные группы являются химически стабильными соединениями, чем конечные продукты свободнорадикального окисления липидов, например малоновый диальдегид. Окисленные белки подвергаются разрушению в течение часов и дней, в то время как продукты окисления липидов нейтрализуются за считанные минуты [3].
На сегодняшний день окислительная модификация белков признана одним из наиболее ранних показателей поражения различных тканей организма при сво-боднорадикальной патологии. Следует отметить, что окислительная деструкция белков рассматривается как один из ранних и стабильных признаков окислительного стресса. В ранних стадиях окислительного стресса преобладают альдегид-динитрофенилгидра-зоны (АДНФГ), в поздних стадиях — кетон-динитро-фенилгидразоны (КДНФГ) [4].
Апробированная в лаборатории «Научно-методических работ, биологических и аналитических исследований» (НМРБиАИ) методика позволяет оценить степень окислительной модификации белков по содержанию карбонильных групп, которые образуются в белковой молекуле в основном в результате прямого окисления некоторых аминокислотных остатков свободными радикалами.
Методы исследований
В настоящее время разработаны методы оценки спонтанного окисления белка, характеризующего окислительный потенциал организма, и стимулиро-
ванного, которое характеризует степень резервно-адаптационных возможностей организма. Метод определения продуктов перекисного окисления белков основан на том, что конечные продукты свободноради-кального окисления белков могут количественно реагировать с 2,4-динитрофенилгидразином (2,4-ДНФГ) с образованием 2,4-динитрофенилгидразонов. Для анализа были выбраны маркеры окислительной деструкции белков, представленные в таблице 1.
Использование определения уровня карбонильных групп в белках как маркеров оксидативного стресса может иметь некоторые преимущества по сравнению с определением продуктов пероксидного окисления липидов, поскольку образование белок связанных CO-групп является общим феноменом белкового окисления и из-за сравнительно раннего образования, и относительной устойчивости окисленных белков. Как известно, клетки разлагают окисленные белки в пределах часов и дней, в то время как продукты пероксид-ного окисления липидов метаболизируются в пределах нескольких минут. Карбонильные группы в белках образуются рано и являются циркулирующими в течение более длинных периодов в крови, по сравнению с другими параметрами окислительного стресса, как, например, окисленным глутатионом или МДА. Повышение содержания окисленных белков в сыворотке стабильно в течение, по крайней мере, 4 часов. Химическая устойчивость белковых карбонилов делает их пригодными объектами для лабораторного измерения. Поэтому количественное определение карбонильных групп обеспечивает интегральную оценку степени окислительной модификации белков и отражает соотношение между про- и антиоксидантными процессами [5, 6].
Для оценки окислительной модификации белков был апробирован метод, основанный на взаимодействии окисленных аминокислотных остатков с 2,4-ди-нитрофенилгидразином (2,4-ДНФГ) с образованием 2,4-динитрофенилгидразонов.
Для регистрации спонтанной окислительной модификации белков к 0,3 мл тканевого гомогената добавляли 100 мМ фосфатный буфер рН 7,4 до конечного объема 1 мл. Пробу инкубировали при 37 °С в течение 15 минут.
В контрольную пробу добавляли 4 мл 2,5 М HCl. В опытную пробу вносили 4 мл 10 мМ 2,4-ДНФГ в 2,5 М HCl. Инкубацию контрольной и опытной пробы проводили при комнатной температуре в течение 1 часа, в темноте, с перемешиванием каждые 15 минут. Затем в каждую пробу добавляли по 5 мл 20 % холодной трихлоруксусной кислоты (ТХУ) для осаждения белка и помещали на холод на 15 минут. После этого
Таблица 1. Маркеры окислительной модификации белка
Название Длинна волны, нм Характеристика
Альдегидфенигидразоны (АФГ) 270 ранний маркер окислительной деструкции белка
Кетондинитрофенилгидразоны (КФГ) 363, 370 поздний маркер окислительной деструкции белка, характери-зирующий, в случае спонтанного ПОБ — степень окислительной деструкции белковой молекулы, а при стимулированном ПОБ — свидетельствует об истощении резервно-адаптационных возможностях организма
пробы центрифугировали 15 минут при 3000 об/мин для формирования белкового осадка. Супернатант удаляли. Осадок белка дополнительно промывали 4 мл 10 % ТХУ и центрифугировали.
Для экстракции липидов и удаления 2,4-ДНФГ, который не прореагировал с карбонильными группами окисленных белков, осадки механически разрушали, промывали 3 раза, каждый раз добавляя по 4 мл смеси этанол:этилацетат (1:1). После этого осадок белка растворяли в 2 мл 8 М мочевины и оставляли на 1 час при 37 °С с постоянным перемешиванием.
Оптическую плотность опытной пробы измеряли при 370 нм относительно контрольной пробы, обработанной 2,5 М HCl на спектрофотометре.
В связи с тем, что до 10-15 % белка терялось на всех этапах проведения исследования, для определения фактического уровня карбонильных групп значение пересчитывают в нМ/мг белка.
Содержание белка определяли методом Лоури. Для построения калибровочной кривой использовали ли-офилизированный бычий сывороточный альбумин, растворенный в 8М мочевине.
Результаты исследования и их обсуждение
В ходе апробации в лаборатории НМРБиАИ методики определения окисленных аминокислотных остатков с 2,4-динитрофенилгидразином, были получены предварительные данные по содержанию карбонильных групп белков в образцах свинины с различным уровнем рН. Была отмечена зависимость количества карбонильных групп от уровня pH, с понижением рН увеличивается количество карбонильных групп белков. В практическом аспекте применение апробированной методики возможно для определения свежести мяса и мясопродуктов. Проведенные исследования спектров поглощения дериватизированных аминокислотных остатков, подтвердили литературные данные, так для алифатических альдегид-динитрофенилги-дразонов нейтрального характера спектр поглощения зарегистрирован в диапазоне 230-558 нм, основного
характера — в диапазоне 258-264 и 428-520 нм. Для алифатических кетон-динитрофенилгидразонов нейтрального характера спектр поглощения 363-367 нм, основного характера — 430-434 и 524-535 нм.
Одним из перспективных направлений является практическое исследование ОМБ. Результатом окислительной деструкции белков является нарушение на-тивной структуры белков. Под действием АФК могут происходить 2 процесса: фрагментация белков, маркерами которой являются АДНФГ и агрегация белков, маркерами которой являются КДНФГ.
В процессе окислительной модификации белка образуются различные стабильные метаболиты аминокислот, представленные в таблице 2.
Однако эти реакции, как правило, не количественны, осложнены побочными продуктами, протекают в неводных средах, что является причиной низкой воспроизводимости аналитического сигнала. В основном он используется в медицинской практике. Большинство неорганических оснований и алифатических аминов мешают количественному определению карбонильных соединений по этому методу [7].
Кроме того, в последнее время для оценки окислительной деструкции белков применятся метод имму-ноферментного анализа с использованием антител, активных в отношении 2,4-динитрофенилгидразонов белков [8, 9].
Белковые карбонильные производные могут также генерироваться через окислительный разрыв белков. Кроме того, CO-группы могут быть введены в белки вторичной реакцией нуклеофильных боковых цепей (Cys, His) и остатков Lys с альдегидами (4-гидрокси-2-ноненалом, МДА), образованных при пероксидном окислении липидов или с активными карбонильными производными (кетоамины, кетоальдегиды). Карбонильные производные образуются в последовательности реакций редуцирующих сахаров или их окисленных продуктов с лизиновыми остатками белков [9].
Поскольку аминокислотные остатки содержат очень незначительные количества СО-групп, любое
Таблица 2. Модификация белков активными формами кислорода
Модифицируемая группа Окислитель Модификация Примечания
Цистеин САР, ОН, ОС1- сульфоновые, дисульфидные связи 8-8-связи
Метионин ОН-, ОС1-, н2о2, О- сульфоксиды легко подвергаются дальнейшему окислению
Гистидин САР, О- 2-оксо-гистидин вызывает поперечные сшивки белков
Пролин, аргинин различные АФК образование полуальдегидов активация поперечных сшивок
Триптофан пероксинитрит, ОН образование 6-нитротриптофана образование флуоресцентных продуктов
Фенилаланин ОН — образование битирозольных радикалов
Тирозин АФК, ОС1-, NO нитрирование, хлорини-рование или образование битирозиновых сшивок ингибирование передачи клеточного сигнала через тирозинки-назу посредством блокирования фосфорилирования тирозина
Концевые NH2-группы белков гипохлорид образование белковых карбонилов легко образуют поперечные сшивки
определяемое возрастание на единицу белка может рассматриваться как результат окислительного стресса, возникающего при дисбалансе АФК-генерирую-щих и улавливающих механизмов.
Заключение
Влияние свободных радикалов на белки разного типа приводит к сложным модификациям в структуре белковой молекулы и, соответственно, к изменению ее физико-химических и биологических свойств. В зависимости от интенсивности генерации активных форм кислорода степень окисления может быть различной: от единичных повреждений аминокислотных остатков до агрегации и фрагментации белковых молекул. Некоторые окислительные модификации являются специфическими и по окисляемым остаткам, и по образующимся продуктам; другие могут изменять многочисленные остатки и вызывать образование несколько продуктов. В последнем случае, высоко специфический
ЛИТЕРАТУРА
1. Окислительная модификация белков: проблемы и перспективы исследования / Л.Е. Муравлева // Фундаментальные исследования — 2010. — № 1. — С. 74-78.
2. Методы оценки оксидативного статуса:учеб.-метод. Пособие для вузов /Рахманова Т.И./ Воронеж: Издатель-ско-полиграфический центр Воронежского гос. ун-та. 2009. — с. 12-13
•-
характер белкового окисления составляет одно из преимуществ использования окислительной модификации белка как маркера окислительного стресса, поскольку это дает значимую информацию о типе свободных радикалов, вовлеченных в процесс окисления. Наиболее объективным способом оценки продуктов окисления является определение карбонильных групп.
© КОНТАКТЫ:
Куликовский Андрей Владимирович V +7 (495) 676-79-61 a kulikovsky87@gmail.com
Николаева Анна Сергеевна a nordik-05@mail.ru
Насонова Виктория Викторовна a nasonova@vniimp.ru
Иванкин Андрей Николаевич a aivankin@inbox.ru
REFERENCES
1. Oxidative modification of proteins: problems and prospects of the research / L.E.Muravleva [et al.] // Basic research — 2010. — № 1. — P. 74-78.
2. Methods of assessing oxidative status: ucheb method. The manual for schools / Rakhmanov TI / Voronezh: Publishing and printing center of the Voronezh State. University. 2009. — P. 12-13
>
3. Stadtman E.R. Protein oxidation / E.R. Stadtman, R.L. Levine // Annals ofN.Y. Academy of Sciences. — Vol. 899. — 2000. — P. 191-208.
4. Gallego M. Evidence of peptide oxidation from major myofibrillar proteins in dry-cured ham/ Marta Gallego, Leticia Mora, M.-Concepcion Aristoy, Fidel Toldra/ Food Chemistry, Volume 187, 15 November 2015, P. 230-235.
5. Perusko M. Macromolecular crowding conditions enhance glycation and oxidation of whey proteins in ultrasound-induced Maillard reaction/ Marija Perusko, Ayah Al-Hanish, Tanja Cirkovic Velickovic, Dragana Stanic-Vucinic// Food Chemistry, Volume 177, 15 June 2015, P. 248-257.
6. Chen Q. The role of bacterial fermentation in the hydrolysis and oxidation of sarcoplasmic and myofibrillar proteins in Harbin dry sausages// Qian Chen, Baohua Kong, Qi Han, Qian Liu, Li Xu// Meat Science, Volume 121, November 2016, P. 196-206.
7. Chennamsetty N. Modeling the Oxidation of Methionine Residues by Peroxides in Proteins// Naresh Chennamsetty, Yong Quan, Vishal Nashine, Ikram Sadineni, Olav Lyngberg, Stanley Krystek// Journal of Pharmaceutical Sciences, Volume 104, Issue 4, April
2015, P. 1246-1255.
8. Lin Tan P. Differential thiol oxidation of the signaling proteins Akt, PTEN or PP2A determines whether Akt phosphorylation is enhanced or inhibited by oxidative stress in C2C12 myotubes derived from skeletal muscle // Pearl Lin Tan, Tea Shavlakadze, Miranda D. Grounds, Peter G. Arthur// The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, Volume 62, May 2015, P. 72-79.
9. Kang D. Effects of power ultrasound on oxidation and structure of beef proteins during curing processing // Da-cheng Kang, Yun-he Zou, Yu-ping Cheng, Lu-juan Xing, Guang-hong Zhou, Wan-gang Zhang// Ultrasonics Sonochemistry, Volume 33, November
2016, P. 47-53.
Подписка на информационно-аналитическое обозрение «РЫНОК мяса и мясных продуктов» на 2017 год
Периодичность выхода обзора — ежемесячно.
Стоимость годовой подписки: 3300 руб. (включая НДС), бумажный носитель.
3540 руб. (включая НДС), электронный носитель. Справки по тел: +7 (495) 676-64-1 1. Подписка: тел./факс: +7 (495) 676-61-01
ПОДПИСНОЙ КУПОН
Издание: МАО «РЫНОК мяса и мясных продуктов»
Срок подписки: содовая / полугодовая_
Адрес подписчика:_
(почтовый индекс, область, район, город, улица, дом, корпус, № офиса)
Наименование предприятия, организации _
Контактный телефон, факс (код города) _
Адрес электронной почты_
Фамилия, имя, отчество _
