CC BY
238
УДК 615.074
АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КАРНОЗИНА
ДА Фадеева, МА Каликова Е.Т. Жилякова, 0.0. Новиков М.Ю. Новикова, H.H. Попов В.Н. Сорокопудов
Белгородский
государственный
университет
Обзор посвящен обобщению существующих методов анализа карнозина (Р-аланил-Ь-гистидина) — дипептида, широко встречающегося в тканях животных и человека.
Ключевые слова: карнозин, дипептид, ВЭЖХ, ТСХ, УФ-спектрофотометрия.
e-mail: [email protected]
Карнозин (^-аланнл-Ь-гистидин) — днпептид природного происхождения, широко встречающийся в тканях животных и человека (рисунок). Физико-химические свойства карнозина приведены в таблице.
н2м-сн2-сн2-со-мн-сн-сн2--1
Соон ^ .1ЧН
Рис. Структурная формула карнозина
Таблица
Физико-химические свойства карнозина
Брутто-формула C9H14N4O3
Молекулярная масса, г/моль 226,2
Внешний вид Бесцветные иглы
Растворимость в воде, г/юомл 32,0
Растворимость в этаноле, г/юомл нерастворим
Удельное оптическое вращение 20 [а] в 1%-ного раствора в Н2О +21,9
Температура плавления, ?С 260-262 (разл.)
рКа 2,62 (СООН) 6,66 (имидазол) 9,24 (NH2)
Карнозин, являясь дипептидом, обладает свойствами, характерными для свободных аминокислот (амфотерность, образование шиффовых оснований, комплексных соединений с ионами металлов, взаимодействие с нингидрином и др.), коме того, наличие в молекуле карнозина имидазольного цикла обуславливает ряд специфических свойств карнозина, таких как способность вступать в реакцию азосочетания, усиление основных свойств соединения [5].
Карнозин был открыт в 1900 году B.C. Гулевичем при исследовании экстрактов мясного фарша [10]. Открытие карнозина в составе мышечной ткани поставило перед исследователями проблему его биологической активности. К настоящему времени продемонстрирована способность карнозина защищать клетки от окислительного стресса, а также увеличивать их устойчивость при избыточной функциональной нагрузке и при накоплении возрастных изменений [1, 9]. Являясь сильным антиоксидан-том, данное соединение обладает антикатарактальным, репаративным, антиишемиче-ским действием [4, 23, 26, 27].
В последние годы возрос интерес к карнозину как к действующему лекарственному веществу: в России и за рубежом создаются биологически активные добавки и лекарственные препараты, содержащие карнозин [2, 8]. Одним из важнейших этапов создания новых лекарственных препаратов является обеспечение и контроль их качества, для чего необходимо соответствующее аналитическое обеспечение. Целью данного обзора является систематизация и обобщение существующих методов, применяемых для определения карнозина, а также рассмотрение возможности их применения для целей фармацевтического анализа.
Наиболее часто для качественного и количественного определения карнозина применяются хроматографические [15,19, 22] и спектральные [7,12] методы анализа.
Хроматографические методы используются как для идентификации, так и для количественного определения карнозина. Метод бумажной хроматографии, использовавшийся для качественного и полуколичественного анализа и разделения аминокислот и пептидов на протяжении десятков лет, однако, не утратил своей актуальности благодаря простоте и экономичности исполнения. Кроме того, данный метод не требует сложного аппаратурного оформления. Так, для разделения анзерина и карнозина проводили хроматографию на бумаге Whatman (23x25 см) с использованием в качестве растворителя систему бутан-2-он-пропионовая кислота-вода (75:25:30, об.). Для обнаружения гистидинсодержащих пептидов на хроматограммах, к которым принадлежит и карнозин, применяют реактив Паули (N-концевой гистидин в составе пептида дает чаще коричневую окраску, а не розовую, как обычно), растворы нингидрина.
Благодаря надежности и эффективности, метод тонкослойной хроматографии (ТСХ) часто используется в анализе пептидов. Важным преимуществом данного метода является возможность одновременного анализа нескольких образцов при малом расходе мобильной фазы. Хроматографирование проводят на силикагелевых пластинах в системах хлороформ-метанол-25%-ный раствор аммиака (3:3:1> об.), бутанол-уксусная кислота - вода, (4:1:5, об.), изопропанол-вода-25%-й водный аммиак (6:1:3, об.), проявляли хроматограммы раствором нингидрина в ацетоне и хлортолидиновым реактивом. В другом исследовании перед процедурой ТСХ исследуемые образцы обрабатывали 7-хлоро-4-нитробензено-2-гидрокси-1,з-диазолом (НБД-хлорид), разделяли и исследовали спектрофотометрически при длине волны 456-470 нм [3].
Для определения карнозина широко применяется высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Существует множество работ по определению карнозина данным методом в мышцах рыб [17], птиц [25], мышцах [18] и плазме [21] млекопитающих, тканях мозга [24]. С помощью ВЭЖХ определялось содержание карнозина в продуктах питания на предмет их животного происхождения [15, 22].
Для определения карнозина использовалась прямо- и обращеннофазная ВЭЖХ, в качестве сорбента использовались различные марки силикагеля [19]. Подвижной фазой служили фосфатный буфер (o,iM раствор Na2HPO4) с показателем рН 2,1 и 8,5 [3], смесь фосфатного буфера и одз%-ного раствора гептафторбутировой кислоты [24], смесь ацетатного буфера (25мМоль, рН6,5) и ацетонитрила (градиент фаз 85%:15%; 60%:40%; 30%:70%) [12], смесь ацетатного буфера и метанола [18] и др. Детекцию полученных хроматограмм осуществляли с помощью УФ-спектроскопии [3], масс-спектроскопии [25], флурометрии [18], радиохроматографически [24].
Коллектив итальянских ученых исследовал содержание карнозина в молоке овец [8]. Для этой цели была использована высокоэффективная жидкостная хроматография. Подвижной фазой служила система ацетонитрил - смесь растворов хлороводородной кислоты (6 мМоль/л) и натрия хлорида (0,48 мМоль/л) (5%:95%> об.). Температура колонки - 50?С. Детекция осуществлялась спектрофотометрически после обработки элюатов о-фталевым ангидридом. Содержание карнозина в молоке составило 9,17 ± 0,89 нМоль/мл.
Рядом исследователей осуществлялась идентификация методом ВЭЖХ N-a-ацетилкарнозина как пролекарства карнозина, устойчивого к действию каро зиназы [3].
Коллектив американских ученых использовали метод ВЭЖХ для количественного определения карнозина при исследовании механизмов его транспорта из кровяного русла в спинномозговую жидкость [24]. Эпителиальные клетки хориоидального сплетения мозга крыс были выдержаны в растворах карнозина, содержащего радиоактивный изотоп 3Н. Затем клетки были трижды промыты в ледяном буфере и солюби-зированы в 0,5 мл о,2-молярного раствора натрия гидроксида и 1%-ного раствора натрия додецилсульфата. Полученные образцы были исследованы с помощью обращен-нофазной ВЭЖХ. Колонка Alltech (США) размером 250x4,6 мм заполнялась силикаге-лем Hypersil ODS с размером частиц 5 мкм. В качестве подвижной фазы была использована смесь o,iM Na2HPO4 и 0,13% раствора гептафторбутировой кислоты. Скорость элюирования составляла 1 мл/мин, анализ проводился при комнатной температуре (23 0С). Время удерживания карнозина — 18,5 минут. Детекция карнозина осуществлялась на радиохроматографическом детекторе FLOONE 500TR.
Метод ВЭЖХ, широко используемый для определения карнозина и его производных, однако, не всегда удобен из-за его низкой пропускной способности и большой продолжительности исследований. Кроме того, существующие методики не адаптированы к задачам фармацевтического анализа.
Метод ионообменной хроматографии широко используется в идентификации и количественном определении аминокислот и пептидов, так как он более универсален и высокочувствителен нежели ВЭЖХ. Для анализа карнозина использовались как катион- так и анионобменные колонки с нингидриновым детектором [3]. В качестве подвижной фазы использовались цитратный буфер (0,35 моль/л или 0,38 моль/л, рН 5,28 или 4,14, соответственно), а также раствор гидроксида натрия (100 ммоль/л) [20].
Немаловажную роль в анализе карнозина занимает и спектрофотометрия. С помощью данного метода возможно осуществить как идентификацию, так и количественное содержание карнозина. Данный пептид определялся как по собственному поглощению при длине волны 210-212 нм [12, 24], так и по максимумам поглощения окрашенных соединений карнозина. В качестве реагентов использовали соли Hg2+ (максимум поглощения комплекса при X = 570 нм) и Cu2+ (максимум поглощения комплекса при X = боо нм) [7], диазотированный р-бромоанилин (красное окрашивание), 2,4-динитрофторбензол и его производные (желтое окрашивание) [25], о-фталевый ангидрид (максимум поглощения окрашенного соединения при Л=б40 нм) [8].
Зачастую исследователи использовали параллельно несколько методов для идентификации и количественного определения карнозина. Так, в совместном исследовании российских и американских ученых была изучена кинетика карнозина и N-a-ацетилкарнозина в тканях глаза кроликов породы шиншилла. В данном комплексном исследовании применялись методы ВЭЖХ, ТСХ, ионообменной хроматографии [3].
На предмет наличия карнозина и его производных, были исследованы образцы водянистой влаги, из которых экстрагировали имидазолсодержащие соединения, выпаривали досуха, ресуспендировали в фосфатном буфере (o,iM Na2HPO4, рН 7,0, 2,0 мл) и подвергали ВЭЖХ.
Обращеннофазную аналитическую ВЭЖХ проводили с помощью жидкостной хроматографической системы Gilson 714 («Gilson, Villiers Fe Bel», Франция). Растворенные, как описано выше, в фосфатном буфере образцы инъецировали в объеме 20 мкл на колонку (250x4,6 мм), наполненную носителем Partisil 5 мкм ODS-3 («Anachem Ltd», Великобритания). Элюирование проводили изократически фосфатным буфером (0,1 M Na2HPO4, рН 2,1) при 20°С в течение 25 мин со скоростью 1,0 мл/мин. Поглощение элюатов оценивали при длине волны 210 нм. Аминокислоты определяли по поглощению карбоксильной группы при 200 нм, а пептиды - по поглощению карбокси-лата и пептидной связи (200-220 нм).
После депротеинизации образцов водянистой влаги, солюбилизации в этаноле и высушивания 100-200 мкл экстрактивных проб подвергали ионообменной хроматографии, используя аминокислотный анализатор Chromaspec («Rank Hilger», Великобритания), оснащенный колонкой Dowex с ионообменной смолой и двухканальным
нингидриновым детектором. Каждое разделение калибровали стандартной смесью всех аминокислот (юо нмоль/мл каждая) и внутреннего стандарта (3-тиенилаланина. Предел обнаружения составлял 14 нмоль на 1 мл пробы для каждой аминокислоты. Аминокислоты элюировали в стандартном режиме буферами с рН в диапазоне 2,2-11,5, под давлением и при 40o.
После удаления водно-этанольного раствора под вакуумом экстракты водянистой влаги концентрировали и продукты биотрансформации Na-ацетилкарнозина идентифицировали с помощью ТСХ на силикагелевых пластинах 6оН («Merck»), Хроматографию проводили в системе хлороформ-метанол-25%-ный водный раствор аммиака (3:3: 0,5, либо 3:3:1, по объему) и окрашивали раствором нингидрина в ацетоне. Значение Rf карнозина составило 0,27.
В отдельной серии экспериментов изучали кинетику проникновения L-карнозина в изолированные хрусталики кролика (исследовалось пять хрусталиков). Чтобы оценить способность хрусталика накапливать карнозин, его помещали в раствор L-карнозина (5 мМ или более высокой концентрации) в солевой среде Хенкса (без бикарбоната, рН 7,4), содержащей 7 мМ глюкозы, и инкубировали при комнатной температуре (20°С). Через i ч проводили процедуру экстракции, чтобы выделить карнозин из небелковой фракции линзы. Выделенную небелковую фракцию фиксировали путем обработки реактивом 4-хлор-7-нитробензо-2-окса-1, 3-диазолом (НБД-хлоридом), а затем подвергали ТСХ в системе растворителей этанол-вода (77:23). Концентрацию карнозина в пробе определяли спектрофотометрически, по характеристическому поглощению при 420/600 нм на двулучевом спектрофотометре Hitachi-557 (Япония).
Помимо вышеперечисленных, в литературе встречаются и другие методы анализа карнозина: микробиологическое определение, протонный магнитный резонанс, капиллярный электрофорез, микродиализ, масс-спектрометрия [6,11,13,14,16].
Обобщая обзор методов анализа карнозина, важно отметить значительный спектр уже существующих и применяемых методик. Однако, они далеко не универсальны, так как применяются чаще всего при биохимических исследованиях, и, зачастую, требуют сложного технического исполнения и длительной подготовки; большинство из них достаточно дорогостоящи. Очевиден недостаток методик фармацевтического анализа карнозина. Таким образом, необходима адаптация существующих и разработка новых методик, применимых для анализа данного перспективного соединения в объектах различного происхождения, в том числе, в лекарственных формах.
Работа выполнена в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы, Государственный контракт № 14.740.11.0119 от 08 сентября 2010 года, проект «Комплексные фармакологические и технологические исследования ряда субмикроструктурирован-ных (наноструктурированных) фармацевтических субстанций с доказанными измененными физико-химическими свойствами».
Литература
1. Болдырев, А.А. Карнозин: эндогенный физиологический корректор активности ан-тиоксидантной системы организма [Текст] / А.А. Болдырев, С.Л. Стволинский, Т.Н. Федорова // Усп. физиол. наук. - 2007. - № 38(3). - С.57-71.
2. Майчук, Ю.Ф. Эффективность применения капель карнозина в терапии заболеваний и при эксимерлазерной хирургии роговицы [Текст] / Ю.Ф. Майчук [и др.] // Офтальмол. журн.-2000. - №4.- С.24-25.
3. Babizhayev, M. A. The Natural Histidine-Containing Dipeptide N-alpha-Acetylcarnosine as an Antioxidant for Ophthalmic Use [Text] / M.A.Babizhayev [et al.] // Biochemistry (Moscow). -2000. - Vol. 65, №5. - P. 691-704.
4. Babizhayev, M.A. Rejuvenation of visual functions in older adult drivers and drivers with cataract during a short-term administration of N-acetylcarnosine lubricant eye drops [Text] / M.A. Babizhayev // Rejuvenation Res. - 2004. - №7(3). - P.186-198.
5. Baran, E. J. Metal Complexes of Carnosine [Text] / E. J. Baran // Biochemistry (Moscow). - 2000. - Vol. 65, № 7. - P. 928-937.
6. Chen, Y.-H. Mass spectrometric determination of dabsyl-chloride derivatised anserine, carnosine and taurine in commercial chicken essences [Text] / Y.-H. Chen [et al.] // International Journal of Food Science & Technology. - 2007. - Vol. 42, № 5. - P.593-600.
7. Coddou, C. Formation of carnosine-Cu(II) complexes prevents and reverts the inhibitory action of copper in P2X4 and P2X7 receptors [Text] / C. Coddou [et al.] // Journal of Neurochemistry.-2002. - Vol.80. - P.626-633.
8. Ducci, M. Concentrations of carnosine, anserine, L-histidine and 3-methyl histidine in boar spermatozoa and sheep milk by a modified HPLC method [Text] / M. Ducci [et al.] // Pol J Vet Sci. -2006. - V0I.9, №3. - P.159-163.
9. Guiotto, A. Carnosine and carnosine-related antioxidants: a review [Text] / A. Guiotto [et al.] //Curr Med Chem.- 2005.- Vol.12, №20. - P.2293-2315.
10.Gulewitsch, W.S. Uber das Karnosin, Eine Neue Organische Base des Fieischextrakt [Text] / W.S. Gulewitsch, S. Amiradzibi //Ber. Deutsch. Chem. Ges. - 1900. - B.33. - S.1902-1903.
11. Gutierrez, D. Amino acid concentration in the interstitium of human skeletal muscle: a mi-crodialysis study [Text] / D. Gutierrez, F. Anderstam, A. Alvestrand // European Journal of Clinical Investigation. - 1999. - Vol. 29, № 11. - P. 947-952.
12. Huang, S.-C. Concentrations and antioxidative activity of anserine and carnosine in poultry meat extracts treated with demineralization and papain [Text] / S.-C. Huang, J. C.-C. Kuo //Proc. Natl. Sci. Counc. - 2000. - Vol. 24, № 4. - P. 193-201.
13. Huang, Y. On-line sample stacking for determination of carnosine-related peptides by capillary electrophoresis [Text] / Y. Huang [et al.] // Chinese Journal Of Chromatography. - 2007. -Vol. 25, №3. - P. 326-331.
14. Huang, Y. Separation and determination of carnosine-related peptides using capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection [Text] // Y. Huang [et al.] // Electrophoresis. -2005. - Vol. 26, №3.— P. 593-599.
15. Kantha, S. S. HPLC Determination of Carnosine in Commercial Canned Soups and Natural Meat Extracts [Text] / S. S. Kantha [et al.] // Lebensmittel-Wissenschaft und-Technologie. - 2000. -Vol. 33, №1. - P. 60-62.
16. Mahir, S. Absolute quantification of carnosine in human calf muscle by proton magnetic resonance spectroscopy [Text] / S. Mahir [et al.] // Physics in Medicine & Biology. - 2007. - Vol. 52, №23. - P.6781-6794.
17. Masataka, S. Determination of anserine and carnosine contents in fish muscles by using high performance liquid chromatography [Text] / S. Masataka, K. Naomichi // Joshi Eiyo Daigaku Kiyo. - 2004. - Vol.35. - P.57-59.
18. Maynard, L. M. High levels of dietary carnosine are associated with increased concentrations of carnosine and histidine in rat soleus muscle [Text] / L. M. Maynard [et al.] // Journal of Nutrition. - 2001. - Vol.131. - P.287-290.
19. Mora, L. Hydrophilic chromatographic determination of carnosine, anserine, balenine, creatine, and creatinine [Text] / L. Mora, M.A. Sentandreu, F.J. Toldra // Agric. Food Chem. - 2007. - Vol.55, №12. - P.4664 -4669.
20. Nardiello, D. Determination of carnosine in feed and meat by high-performance anion-exchange chromatography with integrated pulsed amperometric detection [Text] / D. Nardiello, T.R.I. Cataldi / Journal of Chromatography. - 2004. - Vol.1035, № 2. - P. 285-290.
21. Park, Y.J. Quantitation of carnosine in humans plasma after dietary consumption of beef [Text] / Y.J. Park, S.L. Volpe, E.A. Decker // J. Agric. Food Chem.- 2005.-Vol.53,№ 12. - P.4736-4739.
22. Schonherr, J.J. Analysis of products of animal origin in feeds by determination of carnosine and related dipeptides by high-performance liquid chromatography [Text] / J.J. Schonherr // Agric Food Chem. - 2002.- Vol. 50, №7.- P.1945-1950.
23. Stvolinsky, S. L. Anti-ischemic Activity of Carnosine [Text] / S. L. Stvolinsky, D. Dobrota //Biokhimiya. - 2000. -Vol. 65, №. 7. - P. 998-1005.
24. Teuscher, N. S. Carnosine uptake in rat choroid plexus primary cell cultures and choroid plexus whole tissue from PEPT2 null mice [Text] / N. S. Teuscher [et al.] // Journal of Neurochemis-try.- 2004.-Vol.89.- P. 375-382.
25.Tian, Y. Determination of carnosine in Black-Bone Silky Fowl ( Gallus gallus domesticus Brisson) and common chicken by HPLC [Text] / Y. Tian [et al.] // European Food Research and Technology.- 2007.-Vol. 226.- P.311-314.
26. Wang, A. M .Use of carnosine as a natural anti-senescence drug for human beings [Text] /A. M. Wang [et al.] //Biokhimiya. - 2000.- Vol. 65, №7.- P.1022-1024.
27.Williams, D.L. The effect of a topical antioxidant formulation including N-acetyl carnosine on canine cataract: a preliminary study [Text] / D.L. Williams, P. Munday // Vet Ophthalmol.- 2006.-Vol.9, №5.- P.311-316.
THE ANALYTICAL CHARACTERISTIC OF CARNOSINE
DA Fadeeva, MA Khalikova E.T. Zhilyakova, O.O. Novikov M.Yu. Novikova, N.N. Popov V.N.Sorokopudov
Belgorod State University
The review is devoted to summarizing of existing methods of the analysis of carnosine (P-alanyl-L-histidine) - dipep-tide, which is widespread in animals' and human's tissues.
Key words: carnosine, UV-spectrophotometry.
dipeptide, HPLC, TLC,
e-mail: [email protected]
