CC BY
18
УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ КАЗАНСКОГО УНИВЕРСИТЕТА. СЕРИЯ ЕСТЕСТВЕННЫЕ НАУКИ
2022, Т. 164, кн. 1 ISSN 2542-064X (Print)
С. 22-35 ISSN 2500-218X (Online)
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
УДК 543.94:582.281.21 doi: 10.26907/2542-064X.2022.1.22-35
АМПЕРОМЕТРИЧЕСКИЕ ИММУНОФЕРМЕНТНЫЕ СЕНСОРЫ В ОПРЕДЕЛЕНИИ АНТИГЕНОВ Fusarium oxysporum
Р.М. Бейлинсон1, Э.П. Медянцева1, Е.А. Кириллова1, Е.В. Халдеева2, Г.К. Будников1
1 Казанский (Приволжский) федеральный университет, г. Казань, 420008, Россия 2Казанский НИИ эпидемиологии и микробиологии Роспотребнадзора, г. Казань, 420015, Россия
Аннотация
Предложены иммуноферментные сенсоры (ИФС) с L-цистеиндесульфгидразой (ЦДГ) в качестве метки на основе планарных графитовых электродов для определения антигена (Аг) Fusarium oxysporum. Действие ИФС основано на сочетании иммунологической, ферментативной и электрохимической реакциий. Разработанные иммуносенсоры позволяют определять Аг Fusarium oxysporum в диапазоне концентраций от 5 1040 - 5 10-6 мг/мл с нижней границей определяемых содержаний 110-10 мг/мл. Оценена константа связывания иммунных комплексов Ат-Аг, значение которой составило Ка = (6.2 ± 0.2) 109 (мг/мл)4. Подтверждено отсутствие перекрестного реагирования с Аг патогенных грибов Alternaria alternata, Cladosporium herbarum, Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger. Методика определения Аг Fusarium oxysporumс с помощью предлагаемого ЦДГ-иммуносенсора апробирована на примере оценки качества пшеничной крупы.
Ключевые слова: Fusarium oxysporum, иммуноферментный сенсор, L-цистеинде-сульфгидраза, грибковые патогены
Введение
Грибковые заболевания растений имеют большое экономическое значение, вызывая 70-80% потерь урожая, связанных с микробными патогенами растений. Грибы рода Fusarium являются широко распространенными фитопатогенами, источниками опасных токсинов, наносящими существенный ущерб сельскому хозяйству и производству продуктов питания.
Известно, что Fusarium oxysporum является важным почвенным фитопато-геном. Он отвечает по меньшей мере за 20 различных заболеваний, встречающихся более чем у 120 видов растений. Кукуруза, пшеница, соя и ячмень наиболее часто поражены этим грибковым патогеном. Он проникает в проводящие воду капилляры растений и способствует увяданию, что приводит к преждевременной гибели растения [1].
Традиционные методы определения патогенных грибов основаны на культивировании и морфологических исследованиях, анализе ДНК. Главным образом используют различные варианты полимеразной цепной реакции (ПЦР) [2-6], среди которых самый распространенный - ПЦР в режиме реального времени [7-11],
и методы петлевой изотермической амплификации [12-15]. Хотя традиционные методы обладают необходимой специфичностью и чувствительностью, они требуют относительно сложной последовательности стадий, длительны и трудоемки, что не позволяет широко использовать их в целях решения проблем сельского хозяйства и пищевой промышленности.
Спектральные методы оказались альтернативными методам мокрой химии для эффективного и неразрушающего определения грибкового загрязнения в пищевых продуктах [16-22], однако остаются проблемы анализа, связанные с неоднородным распределением токсинов, фоновыми составляющими интерференции, робастностью, разработкой аппаратуры [23]. Хроматографические методы позволяют определять характерные маркерные соединения, включая микотоксины и другие грибковые метаболиты, и таким образом идентифицировать некоторые виды грибков [1, 24-26], однако они ограничены в своем применении. Имеются данные о разработке оптических и электрохимических ДНК-сенсоров с использованием различных подходов для определения некоторых патогенных грибов [27-29]. Кроме того, разработаны тест-системы для быстрого обнаружения грибковых инфекций, основанные на иммунохимических и гибридизационных взаимодействиях ДНК [30-32].
Нами ранее был разработан амперометрический иммуноферментный сенсор (ИФС) с иммобилизованной холинэстеразой (ХЭ) и антителами для определения антигена (Аг) патогенных грибов Trichophyton rubrum. Иммуносенсор основан на специфической иммунореакции Аг с антителами, которые были иммобилизованы вместе с ферментом ХЭ на нитроцеллюлозной мембране. Разработанный иммуносенсор позволяет определять до 1 • 10-15 мг/мл Trichophyton rubrum. Общее время иммуноанализа менее 20 мин. Метод был применен для определения Аг Trichophyton rubrum в сыворотке крови человека [33].
Для растений характерно бессимптомное протекание ранних стадий болезней, вызванных инфицированием грибковыми патогенами. Раннее обнаружение патогенов растений играет важную роль в мониторинге их здоровья. Это позволяет управлять болезнетворными инфекциями на различных этапах их развития, а также минимизировать риск распространения инфекций, что особенно важно при контроле семенного фонда. Поэтому имеет особое значение разработка экспрессных методов анализа для контроля поступающей сельскохозяйственной продукции и анализа на всех этапах производства продуктов питания. Разработка селективных и высокочувствительных иммуносенсоров является перспективным решением подобного рода задач.
В связи с этим цель настоящей работы - оценить возможность использования ЦДГ в качестве метки при создании иммуносенсоров на основе планарных электродов, модифицированных наноструктурированными материалами, для определения Аг F. oxysporum и контроля его содержания в сельскохозяйственных продуктах.
1. Экспериментальная часть
Основой разработанного иммуносенсора служила система, состоящая из рабочего, вспомогательного электродов и электрода сравнения, полученная на полимерной подложке методом печатных технологий конструкции «3 в 1» (получены
на кафедре аналитической химии КФУ, Казань, Россия). Материалом поверхности рабочего электрода, на которой иммобилизуются модификатор и фермент, являются графитовые чернила (GwentElectronicMaterials, США). Вспомогательный электрод изготовлен также из графитовых чернил. Электрод сравнения -паста AgCl/Ag.
Объем рабочей ячейки системы составлял 1.8 мл. Все измерения с использованием этих электродов проводили с помощью потенциостата/гальваностата Autolab PGSTAT204 (Metrohm Autolab, Нидерланды). Электрохимическую стабилизацию и очистку поверхности электрода проводили путем циклического изменения потенциала в диапазоне потенциалов от 0 до 1000 мВ, для этого регистрировали 6-7 циклических вольтамперограмм в растворе насыщенного КО при скорости развертки 100 мВ/с.
Использовали фосфатный буферный (ФБ) раствор (рН 7.60 ± 0.05). Значения рН водных растворов определяли рН-метром «Эксперт 001» со стеклянным электродом, градуированным по стандартным буферным растворам.
В качестве субстратов использовали L-цистеин (Sigma), растворы которого готовили по точной навеске в рабочем буферном растворе. В качестве источника ЦДГ использовали гомогенат из проростков зерновых культур (овса), в качестве консерванта - 0.5 М сахарозу. Применяли 25%-ный раствор глута-рового альдегида фирмы ICN (Biomedicals Inc., США), аминопроизводное ги-перразветвленного полиэфира полиола Boltorn-H20-NH2 (получен на кафедре неорганической химии КФУ, Казань, Россия) [34].
В настоящей работе использовали Аг Fusarium oxysporum, Alternaria alternata, Cladosporium herbarum, Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger и сыворотку по-ликлональных Ат против Fusarium oxysporum (полученные и предоставленные лабораторией микологии Казанского НИИ эпидемиологии и микробиологии (КНИИЭМ) (Казань, Россия)). Концентрации водных растворов Ат и Аг были определены спектрофотометрически при X 280 и 266 нм соответственно с помощью прибора BioSpectrometer (Eppendorf, Германия) при температуре 25 °С. Концентрация Ат против Аг F. oxysporum в разведении 1:20 - 4.8 мг/мл. Начальные концентрации Аг грибов Fusarium oxysporum, Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger, Cladosporium herbarum, Alternaria alternata составили 5.5, 2.4, 2.5, 1.5, 11.3 мг/мл соответственно.
Получение гомогената из проростков овса. Для приготовления гомоге-ната растительный материал (проростки овса) мелко нарезали и растирали пестиком в вымороженной ступке, заливали 0.1 М ФБ рН 7.6 в соотношении 1:3, процеживали суспензию через двойной марлевый слой и добавляли 0.5 М раствор сахарозы. Полученный гомогенат использовали для получения биочувствительного слоя иммуносенсоров [35].
Получение Аг F. oxysporum. Антиген F. oxysporum получен по оригинальной методике (КНИИЭМ). Получение основано на экстракции биоактивных компонентов из биомассы гриба 0.85%-ным раствором NaCl с последующим удалением микотоксинов путем экстракции хлороформом. Затем экстракт фракционировали этанолом. Для стабилизации использовали стерилизующую фильтрацию через керамические фильтры. Культивирование биомассы проводили на среде Чапека. Полученную биомассу промывали, центрифугировали и обезжиривали ацетоном.
Готовые антигены тестировали на токсичность, аллергенную активность, активность в иммунологических реакциях (иммунодиффузия с кроличьими антисыворотками).
Изготовление амперометрических иммуносенсоров на основе иммобилизованного фермента ЦДГ. Для получения биочувствительной части ИФС на поверхность рабочего электрода наносили смесь, содержащую раствор фермента (ЦДГ), раствор Ат против Аг F. oxysporum (1:20), раствор Boltorn-H20-NH2, рабочий буфер (pH 7.6), дистиллированную воду и 1%-ный раствор глутарового альдегида. Глутаровый альдегид вносили в последнюю очередь и после перемешивания на поверхность электродов наносили по 1 мкл этой смеси. Полученные таким образом иммуносенсоры оставляли на ночь в закрытой чашке Петри при температуре +4 °С. В дальнейшем хранили в холодильнике не более 15 сут [35].
Статистическая обработка полученных результатов проведена с использованием пакета прикладных программ Microsoft Office, определены средние величины (М), стандартная ошибка средней массы (m).
1.1. Определение характеристик иммунных комплексов
1.1.1. Определение констант связывания иммунного комплекса антиген - антитело. Константа связывания (константа образования иммунного комплекса) является одной из наиболее важных физико-химических характеристик иммунологической реакции, на основании которой можно сделать вывод о возможности использования данной реакции в аналитических целях, оценить качество иммунореагентов:
k _
Аг + Ат с * Аг - Ат,
k-i
Ka = ki/k-i= [Аг - Ат] / [Аг] • [Ат], где Ка - константа образования иммунного комплекса, ki и k-i - константы прямой и обратной иммунологических реакций; [Аг - Ат] - равновесная концентрация иммунного комплекса, [Аг] и [Ат] - равновесные концентрации антигена и антител соответственно. Для разработки методов иммуноанализа достаточно знать эффективные значения констант связывания, характеризующие свойства используемых Ат.
Константу Ка определяли, используя зависимость B/F от B (график Скэт-чарда), представляющую собой прямую линию с тангенсом угла наклона, равным Ка, пересекающую ось абсцисс в точке, соответствующей A0 [36]. Ка можно представить в следующем виде: Ка = B/F^ - B), где F - равновесная концентрация антигена в растворе, А0 - общая концентрация Ат в системе, С0 - исходная концентрация антигена, B/F - отношение концентраций связанного и свободного Аг.
1.1.2. Определение процента перекрестного реагирования. Процент перекрестных реакций определяли как отношение концентрации основного и мешающего компонентов, полученных как точки пересечения перпендикуляра, восстановленного из значения аналитического сигнала, соответствующего используемой
концентрации, деленного на два (ось У) с перпендикулярами, опущенными на ось концентраций (ось Х), используя соответствующие градуировочные графики для их определения.
Процент перекрестных реакций вычисляли как (С1/С2)100%, где С1 и С2 -концентрации основного и мешающего компонентов при 0.5 величины максимального аналитического сигнала [37].
2. Результаты и их обсуждение
Изучение действия Аг F. oxysporum на фермент класса лиаз - ЦДГ - показало, что Аг не является эффектором этого фермента, поэтому были сделаны попытки использования его в качестве меток при создании ИФС для определения Аг грибов.
Разработанный ИФС представляет собой графитовый печатный электрод, на поверхности которого проводили соиммобилизацию фермента и Ат против Аг F. oxysporum (рис. 1).
а б в
Рис. 1. Схема действия ИФС на основе иммобилизованных Ат против Аг Fusarium oxysporum и фермента (Е) включает: совместно иммобилизованные фермент и Ат (а), Аг в растворе (б), образующийся иммунный комплекс и варианты подхода субстрата к активной поверхности фермента (в)
2.1. Природа формирования аналитического сигнала ЦДГ-биосенсора.
ЦДГ катализирует разложение L-цистеина с образованием аммиака, пировино-градной кислоты и сероводорода [38]:
ЦДГ
HOOCCH(NH2)CH2SH + Н20 -NH3 + H2S + СН3С(0)С00Н
Пик окисления L-цистеина на графитовом печатном электроде на фоне ФБ раствора рН 7.6 наблюдается при потенциале 0.45 В (рис. 2). Концентрация субстрата, L-цистеина, составляла 1-10—3 М:
HOOCCH(NH2)CH2SH-2Н+ + 2е + HOOCCH(NH2)CH2SSCH2CH(NH2)COOH
2.2. Действие Аг Fusarium oxysporum на ИФС. Установлено, что Аг F. oxysporum оказывает ингибирующее действие на биочувствительную часть им-муносенсоров, что, вероятно, связано с образованием комплекса Ат-Аг, который создает стерические препятствия при подходе субстрата к активному центру фермента. В случае ИФС на основе ЦДГ ингибирующее действие Аг F. oxysporum
Рис. 2. Вольтамперограммы электроокисления раствора 1 • 10-3 М цистеина на фоне ФБ раствора рН 7.6 (1), в присутствии ЦДГ (2), в отсутствие ЦДГ (4), в присутствии Аг Fusarium oxysporum и ЦДГ (3) на печатном графитовом электроде
Табл. 1
Определение Аг Fusarium oxysporum с помощью ИФС на основе ЦДГ (n = 3, P = 0.95)
Введено, мг/мл Найдено, мг/мл £ Процент открытия, %
3 10-8 (2.9 ± 0.2)10-8 0.069 94-107
7 10-9 (7.2 ± 0.3)10-9 0.042 96-104
Табл. 2
Определение Fusarium oxysporum с помощью ЦДГ-иммуносенсора (n = 3, P = 0.95)
Введено, мг/мл Найдено, мг/мл Sr Процент открытия, %
5 10-7 (4.7 ± 0.2)-10-7 0.043 96-104
5 10-8 (5.2 ± 0.3)-10-8 0.038 96-104
наблюдалось в области концентраций 510 10 - 5 • 10-6 мг/мл. Линейная зависимость между логарифмом концентрации и отношением токов описывается уравнением: / = (-11.6 ± 0.9И-^ С) +(127.0 ± 0.9), где / = ЩЛ00 (1Р - ток в присутствии ингибитора, 1о - ток в отсутствие ингибитора). Разработанный иммунофермент-ный сенсор позволяет определять концентрации Е. oxysporum с нижней границей определяемых содержаний до 110- мг/мл.
Наибольший ингибирующий эффект наблюдался при использовании Ат в разведении 1:20 (максимальная степень ингибирования (72.3 ± 0.5)%. Разведения Ат 1:10, 1:30, 1:40, 1:50 обеспечивали более низкую величину аналитического сигнала и более низкую степень ингибирования.
Аналитические характеристики ИФС для определения Е. oxysporum представлены в табл. 1. Правильность результатов определения Аг Е. oxysporum, полученных с использованием разработанных ИФС, подтверждена методом «введено - найдено» (табл. 2).
2.3. Оценка констант связывания иммунных комплексов и специфичности иммунохимических взаимодействий. Для характеристики иммунных комплексов были определены константы образования иммунных комплексов Ка с помощью метода Скэтчарда.
700 -, B/F
400 -
200 -
300 -
600 -
500 -
100 -
0
Bx 108
10
15
20
25
Рис. 3. График Скэтчарда для нахождения констант связывания иммунного комплекса Ат -Аг Fusarium
Проводили серию опытов по определению концентрации свободного и связанного Аг при различных начальных концентрациях Аг и постоянной концентрации Ат в системе. Для определения несвязанного количества Аг использовали градуировочную зависимость действия Аг F. oxysporum на другую фермент-субстратную систему (тирозиназа - фенол), для которой установлено наличие активирующего эффекта.
Полученная зависимость взаимодействия Аг-Ат в координатах Скэтчарда имеет близкий к линейному характер, что свидетельствует об однородности используемых антител (рис. 3). Найденное значение константы связывания для Ат к F. oxysporum Ка = (6.2 ± 0.2)• 109 (мг/мл)-1 указывает на достаточную прочность образующихся иммунных комплексов. Это позволяет проводить селективный анализ независимо от присутствия других грибковых патогенов.
Полученные результаты показывают, что предлагаемые иммуносенсоры могут быть использованы для определения содержания F. oxysporum в сельскохозяйственных продуктах.
2.4. Определение Аг F. oxysporum в сельскохозяйственной продукции.
В связи с широкой распространенностью F. oxysporum и его способностью поражать разнообразные сельскохозяйственные культуры, представляло интерес количественно оценить его содержание в продуктах переработки зерна - пшеничной крупе.
Методика извлечения Аг F. oxysporum из крупы. Навеску образца (1 г) (пшеничной крупы) растирали в порошок, используя блендер фирмы Jiplai (Китай) и добавляли 10 мл водно-солевого буфера (фосфатного буфера рН 7.6). Смесь фильтровали на воронке трижды. Фильтраты объединили и центрифугировали в течение 15 мин при скорости 7000 об./мин, после этого использовали для последующего определения F. oxysporum с помощью иммуносенсора на основе ЦДГ.
Методика определения содержания Аг F. oxysporum в образце крупы. В ячейку на 1800 мкл вносили 180 мкл раствора образца, полученного как описано выше, 180 мкл L-цистеина (с = 1 • 10-3 М), фосфатный буферный раствор (рН 7.6) и ЦДГ-иммуносенсор. Растворы инкубировали в течение 10 мин. Затем измеряли значение тока при потенциале +0.45 В.
В образцах пшеничной крупы («Каждый день», ОАО «МК Сарапул-молоко», г. Сарапул) F. oxysporum не обнаружен.
Возможность определения F. oxysporum с использованием разработанного ИФС оценена методом «введено - найдено».
Заключение
Впервые показана возможность использования амперометрических ИФС с ЦДГ в качестве метки для определения Аг F. oxysporum, действие которого основано на сочетании иммунологической, ферментативной и электрохимической реакций.
Разработанный иммуносенсор позволил определять Аг F. oxysporum в концентрационном интервале 510-10 - 5-10"6 мг/мл, а нижняя граница определяемых содержаний составила 1 • 10- мг/мл.
Оценена константа связывания иммунных комплексов: Ка = (6.2 ± 0.2)-10 (мг/мл)-1. Перекрестное реагирование полностью отсутствовало для Аг патогенных грибов Alternaria alternata, Cladosporium herbarum, Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger.
Разработана методика определения Аг F. oxysporum с помощью предлагаемого цистеиндесульгидразного ИФС в сельскохозяйственной продукции, апробирована на примере оценки качества пшеничной крупы. В исследуемых образцах F. oxysporum не был обнаружен.
Литература
1. Senes C.E.R., Saldan N.C., Costa W.F., Svidzinski T., Oliveira C.C. Identification of Fusarium oxysporum fungus in wheat based on chemical markers and qualitative GC-MS test // J. Braz. Chem. Soc. - 2018. - V. 29, No 12. - P. 2626-2635. - doi: 10.21577/01035053.20180143.
2. GragaM.G., Heijden I.M., Perdigao L., Taira C., Costa S.F., Levin A.S. Evaluation of two methods for direct detection of Fusarium spp. in water // J. Microbiol. Methods. - 2016. -V. 123. - P. 39-43. - doi: 10.1016/j.mimet.2016.01.015.
3. Singh N., Kapoor R. Quick and accurate detection of Fusarium oxysporum f. sp. carthami in host tissue and soil using conventional and real-time PCR assay // World J. Microbiol. Bio-technol. - 2018. - V 34, No 175. - P. 175-187. - doi: 10.1007/s11274-018-2556-y.
4. Omori A.M. Ono E. Y.S., Bordini J.G., Hirozawa M. T., Fungaro M.H.P., Ono M.A. Detection of Fusarium verticillioides by PCR-ELISA based on FUM21 gene // Food Microbiol. -2018. - V. 73. - P. 160-167. - doi: 10.1016/j.fm.2018.01.020.
5. Ge B., Wang B., Guo C., Sun S., Chen G., Wang X., Zhu Z., Duan C. Composition and quantitative analysis of Fusarium species in maize rhizosphere soil // Sci. Agric. Sin. -2018. - V. 51, No 19. - P. 3683-3693.
6. Mishra R.K., Pandey B.K., Muthukumar M., Pathak N., Zeeshan M. Detection of Fusarium wilt pathogens of Psidium guajava L. in soil using culture independent PCR (ciPCR) // Saudi J. Biol. Sci. - 2013. - V 20, No 1. - P. 51-56. - doi: 10.1016/j.sjbs.2012.10.007.
7. Crespo-Sempere A., Estiarte N., Marin S., Sanchis V., Ramos A.J. Propidium monoazide combined with real-time quantitative PCR to quantify viable Alternaria spp. contamination in tomato products // Int. J. Food Microbiol. - 2013. - V 165, No 3. - P. 214-220. -doi: 10.1016/j.ijfoodmicro.2013.05.017.
8. Kumar S., Singh R., Kashyap P.L., Srivastava A.K. Rapid detection and quantification ofAlternaria solani in tomato // Sci. Hortic. - 2013. - V 151. - P. 184-189. - doi: 10.1016/j.scienta.2012.12.026.
9. von Hertwig A.M., Sant'Ana A.S., Sartori D., Silva J., Nascimento M.S., Iamanaka B.T., Pelegrinelli Fungaro M.H., Taniwaki M.H. Real-time PCR-based method for rapid detection of Aspergillus niger and Aspergillus welwitschiae isolated from coffee // J. Microbiol. Methods. - 2018. - V 148. - P. 87-92. - doi: 10.1016/j.mimet.2018.03.010.
10. Nikitin M., Deych K., Grevtseva I., Girsova N.V, Kuznetsova M., Pridannikov M., Dzhavakhiya V., Statsyuk N., Golikov A.G Preserved microarrays for simultaneous detection and identification of six fungal potato pathogens with the use of real-time PCR in matrix format // Biosensors. - 2018. - V 8, No 4. - P. 129-137. - doi: 10.3390/bios8040129.
11. De la Lastra E., Basallote-Ureba M.J., De los Santos B., Miranda L., Vela-Delgado M.D., Capote N. A TaqMan real-time polymerase chain reaction assay for accurate detection and quantification of Fusarium solani in strawberry plants and soil //Sci. Hortic. - 2018. -V 237. - P. 128-134. - doi: 10.1016/j.scienta.2018.04.007.
12. Shan L., Haseeb H.A., Zhang J., Zhang D. Jeffers D.P., Dai X., Guo W. A loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay for the rapid detection of toxigenic Fusarium temperatum in maize stalks and kernels // Int. J. Food Microbiol. - 2019. - V 291. -P. 72-78. - doi: 10.1016/j.ijfoodmicro.2018.11.021.
13. Lan C., Ruan H., Yang X., Yao J. Jiang J. Development of a loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and specific detection of Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum Owen // Phytoparasitica. - 2018. - V 46. - P. 283-293. - doi: 10.1007/s12600-018-0669-3.
14. Pu J., Xie Y., Zhang H., ZhangX., Qi Y., Peng J. Development of a real-time fluorescence loop-mediated isothermal amplification assay for rapid and quantitative detection of Fusarium mangiferae associated with mango malformation // Physiol. Mol. Plant Pathol. -
2014. - V 86. - P. 81-88. - doi: 10.1016/j.pmpp.2014.04.002.
15. Denschlag C., Rieder J., Vogel R.F., Niessen L. Real-time loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay for group specific detection of important trichothecene producing Fusarium species in wheat // Int. J. Food Microbiol. - 2014. - V 177. - P. 117-127. -doi: 10.1016/j.ijfoodmicro.2014.02.010.
16. Jaillais B., Roumet P., Pinson-Gadais L., Bertrand D. Detection of Fusarium head blight contamination in wheat kernels by multivariate imaging // Food Control. - 2015. - V. 54. -P. 250-258. - doi: 10.1016/j.foodcont.2015.01.048.
17. Kaya-Celiker H., Mallikarjunan P.K., Kaaya A. Mid-infrared spectroscopy for discrimination and classification of Aspergillus spp. contamination in peanuts // Food Control. -
2015. - V 52. - P. 103-111. - doi: 10.1016/j.foodcont.2014.12.013.
18. Liang P.-S., Slaughter D.C., Ortega-Beltran A., Michailides T.J. Detection of fungal infection in almond kernels using near-infrared reflectance spectroscopy // Biosyst. Eng. -2015. - V 137. - P. 64-72. - doi: 10.1016/j.biosystemseng.2015.07.010.
19. Pan T., Sun D.-W., Pu H., Wei Q., Xiao W., Wang Q.-J. Detection of A. alternata from pear juice using surface-enhanced Raman spectroscopy based silver nanodots array // J. Food Eng. - 2017. - V. 215. - P. 147-155. - doi: 10.1016/j.jfoodeng.2017.07.019.
20. Shen F., Zhao T., Jiang X., Liu X., Fang Y., Liu Q., Hu Q., Liu X. On-line detection of toxigenic fungal infection in wheat by visible/near infrared spectroscopy // J. Food Sci. Technol. - 2019. - V. 109. - P. 216-224. - doi: 10.1016/j.lwt.2019.04.019.
21. Shen F., Wu Q., Liu P., Jiang X., Fang Y., Cao C. Detection of Aspergillus spp. contamination levels in peanuts by near infrared spectroscopy and electronic nose // Food Control. - 2018. - V 93. - P. 1-8. - doi: 10.1016/j.foodcont.2018.05.039.
22. Tamburini E., Mamolini E., De Bastiani M., Marchetti M.G. Quantitative determination of Fusarium proliferatum concentration in intact garlic cloves using near-infrared spectroscopy // Sensors. - 2016. - V. 16, No 7. - P. 1099-1112. - doi: 10.3390/s16071099.
23. Wu Q., Xie L., Xu H. Determination of toxigenic fungi and aflatoxins in nuts and dried fruits using imaging and spectroscopic techniques // Food Chem. - 2018. - V 252. -P. 228-242. - doi: 10.1016/j.foodchem.2018.01.076.
24. Saldan N.C. Almeida R.T.R., Avíncola A., Porto C., Galuch M.B., Magon T.F.S., Pilau E.J., Svidzinski T.I.E., Oliveira C.C. Development of an analytical method for identification of Aspergillus flavus based on chemical markers using HPLC-MS // Food Chem. - 2018. -V. 241. - P. 113-121. - doi: 10.1016/j.foodchem.2017.08.065.
25. Gu S., Wang J., Wang Y. Early discrimination and growth tracking of Aspergillus spp. contamination in rice kernels using electronic nose // Food Chem. - 2019. - V. 292. -P. 325-335. - doi: 10.1016/j.foodchem.2019.04.054.
26. Erler A. Riebe D., Beitz T., Lohmannsroben H.-G., Grothusheitkamp D., Kunz T., Meth-nerF.-J. Detection of volatile organic compounds in the headspace above mold fungi by GC-soft X-radiation-based APCI-MS // J. Mass Spectrom. - 2018. - V. 53, No 10. -P. 911-920. - doi: 10.1002/jms.4210.
27. Siddiquee S., Rovina K., Yusof N.A., Rodrigues K.F., Suryani S. Nanoparticle-enhanced electrochemical biosensor with DNA immobilization and hybridization of Trichoderma harzi-anum gene // Sens. Bio-Sens. Res. - 2014. - V 2. - P. 16-22. - doi: 10.1016/j.sbsr.2014.06.002.
28. Peltomaa R., Vaghini S., Patiño B., Benito-Peña E., Moreno-Bondi M. Species-specific optical genosensors for the detection of mycotoxigenic Fusarium fungi in food samples // Anal. Chim. Acta. - 2016. - V. 935. - P. 231-238. - doi: 10.1016/j.aca.2016.06.009.
29. Cecchini F., Manzano M., Mandabi Y., Perelman E., Marks R.S. Chemiluminescent DNA optical fibre sensor for Brettanomyces bruxellensis detection // J. Biotechnol. - 2012. - V 157, No 1. - P. 25-30. - doi: 10.1016/j.jbiotec.2011.10.004.
30. Wee E.J.H., Lau H.Y., Botella J.R., Trau M. Re-purposing bridging flocculation for on-site, rapid, qualitative DNA detection in resource-poor settings // Chem. Commun. -2015. - V. 51, No 27. - P. 5828-5831. - doi: 10.1039/C4CC10068A.
31. Zhan F., Wang T., Iradukunda L., Zhan J. A gold nanoparticle-based lateral flow biosensor for sensitive visual detection of the potato late blight pathogen, Phytophthora infestans // Anal. Chim. Acta. - 2018. - V 1036. - P. 153-161. - doi: 10.1016/j.aca.2018.06.083.
32. Miranda B.S., Linares E.M., Thalhammer S., Kubota L.T. Development of a disposable and highly sensitive paper-based immunosensor for early diagnosis of Asian soybean rust // Biosens. Bioelectron. - 2013. - V. 45. - P. 123-128. - doi: 10.1016/j.bios.2013.01.048.
33. Medyantseva E.P., Khaldeeva E.V., Glushko N.I., Budnikov H.C. Amperometric enzyme immunosensor for the determination of the antigen of the pathogenic fungi Trichophyton rubrum //Anal. Chim. Acta. - 2000. - V 411, No 1-2. - P. 13-18.
34. KavandА., Anton N., Vandamme T., Serra C.A., Chan-Seng D. Synthesis and functional-ization of hyperbranched polymers for targeted drug delivery / /J. Controlled Release. -2020. - V. 321. - P. 285-311. - doi: 10.1016/j.jconrel.2020.02.019.
35. Медянцева Э.П., Кремлева Н.В., Будников Г.К., Бормотова Ю.И. Амперометриче-ский биосенсор для определения свинца и кадмия // Журн. аналит. химии. - 1999. -Т. 54, № 2. - С. 166-170.
36. Ёсида К. Электроокисление в органической химии. Роль катион радикалов как ин-термедиатов в синтезе. - М.: Мир, 1987. - 336 с.
37. ЕгоровА.М. Теория и практика иммуноферментного анализа. - М.: Высш. шк., 1991. -288 с.
38. Мусил Я., Новакова О., Кунц. К. Современная биохимия в схемах. - М.: Мир, 1994. -44 с.
Поступила в редакцию 24.09.2021
Бейлинсон Регина Марковна, кандидат химических наук, доцент кафедры аналитической химии Казанский (Приволжский) федеральный университет ул. Кремлевская, д. 18, г. Казань, 420008, Россия E-mail: [email protected]
Медянцева Эльвина Павловна, доктор химических наук, профессор кафедры аналитической химии Казанский (Приволжский) федеральный университет ул. Кремлевская, д. 18, г. Казань, 420008, Россия E-mail: [email protected]
Кириллова Елена Александровна, студент Химического института им. А.М. Бутлерова Казанский (Приволжский) федеральный университет ул. Кремлевская, д. 18, г. Казань, 420008, Россия E-mail: elena.al. kirillova@gmail. com
Халдеева Елена Владимировна, кандидат химических наук, ведущий научный сотрудник, заведующий лабораторией микологии
Казанский НИИ эпидемиологии и микробиологии Роспотребнадзора
ул. Большая Красная, д. 67, г. Казань, 420015, Россия E-mail: [email protected]
Будников Герман Константинович, доктор химических наук, профессор-консультант кафедры аналитической химии
Казанский (Приволжский) федеральный университет ул. Кремлевская, д. 18, г. Казань, 420008, Россия E-mail: [email protected]
ISSN 2542-064X (Print) ISSN 2500-218X (Online)
UCHENYE ZAPISKI KAZANSKOGO UNIVERSITETA. SERIYA ESTESTVENNYE NAUKI (Proceedings of Kazan University. Natural Sciences Series)
2022, vol. 164, no. 1, pp. 22-35
ORIGINAL ARTICLE
doi: 10.26907/2542-064X.2022.1.22-35
Amperometric Enzyme Immunoassay Sensors in Determination of Fusarium oxysporum Antigens
R.M. Beilinson a*, E.P. Medyantseva a**, E.A. Kirillova a*", E. V. Khaldeeva b"",
H. C. Budnikov a
aKazan Federal University, Kazan, 420008 Russia hKazan Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Kazan, 420015 Russia E-mail: [email protected], [email protected], [email protected], [email protected], [email protected]
Received September 24, 2021
Abstract
Enzyme immunoassay sensors (EIS) with L-cysteine desulfhydrase (CDH) as a label based on planar graphite electrodes were created to determine Fusarium oxysporum antigen (Ag). The EIS action relies
on the combined effect of immunological, enzymatic, and electrochemical reactions. The immunosensors developed allow the determination of Fusarium oxysporum Ag in the concentration range of 5 10-10 -5-10-6 mg/mL with the limit of quantification of 1 ■ 10-10 mg/mL. The binding constant of the Ab-Ag immune complexes was estimated as Kaj = (6.2 ± 0.2) 109 (mg/mL)-1. No cross-reaction with Ag of such pathogenic fungi as Alternaria alternata, Cladosporium herbarum, Aspergillus fumigatus, and Aspergillus niger was confirmed. Here the quality of wheat groats was assessed to test the methods for the determination of Fusarium oxysporum Ag using the developed CDH immunosensor.
Keywords: Fusarium oxysporum, enzyme immunoassay sensor, L-cysteine desulfhydrase, fungal pathogens
Figure Captions
Fig. 1. Schematic representation of the action of enzyme immunoassay sensors based on immobilized Ab against Fusarium oxysporum Ag and the enzyme (E) includes: co-immobilized enzyme and Ab (a), Ag in solution (b), immune complex that is formed and variants of the substrate access to the active enzyme surface (c).
Fig. 2. Voltammograms of the electrooxidation of a 110-3 M cysteine solution in phosphate buffer (pH 7.6) (1), in the presence of L-cysteine desulfhydrase (2), in the absence of L-cysteine desulfhydrase (4), in the presence of Fusarium oxysporum Ag and L-cysteine desulfhydrase (3) at the planar graphite electrode.
Fig. 3. Scatchard plot for determining the binding constant of the Ab-Ag immune complex of Fusarium oxysporum.
References
1. Senes C.E.R., Saldan N.C., Costa W.F., Svidzinski T., Oliveira C.C. Identification of Fusarium oxysporum fungus in wheat based on chemical markers and qualitative GC-MS test. J. Braz. Chem. Soc., 2018, vol. 29, no. 12, pp. 2626-2635. doi: 10.21577/0103-5053.20180143.
2. Graja M.G., Heijden I.M., Perdigao L., Taira C., Costa S.F., Levin A.S. Evaluation of two methods for direct detection of Fusarium spp. in water. J. Microbiol. Methods, 2016, vol. 123, pp. 39-43. doi: 10.1016/j.mimet.2016.01.015.
3. Singh N., Kapoor R. Quick and accurate detection of Fusarium oxysporum f. sp. carthami in host tissue and soil using conventional and real-time PCR assay. World J. Microbiol. Biotechnol., 2018, vol. 34, no. 175, pp. 175-187. doi: 10.1007/s11274-018-2556-y.
4. Omori A.M. Ono E.Y.S., Bordini J.G., Hirozawa M.T., Fungaro M.H.P., Ono M.A. Detection of Fusarium verticillioides by PCR-ELISA based on FUM21 gene. Food Microbiol., 2018, vol. 73, pp. 160-167. doi: 10.1016/j.fm.2018.01.020.
5. Ge B., Wang B., Guo C., Sun S., Chen G., Wang X., Zhu Z., Duan C. Composition and quantitative analysis of Fusarium species in maize rhizosphere soil. Sci. Agric. Sin., 2018, vol. 51, no. 19, pp. 3683-3693.
6. Mishra R.K., Pandey B.K., Muthukumar M., Pathak N., Zeeshan M. Detection of Fusarium wilt pathogens of Psidium guajava L. in soil using culture independent PCR (ciPCR). Saudi J. Biol. Sci, 2013, vol. 20, no. 1, pp. 51-56. doi: 10.1016/j.sjbs.2012.10.007.
7. Crespo-Sempere A., Estiarte N., Marin S., Sanchis V., Ramos A.J. Propidium monoazide combined with real-time quantitative PCR to quantify viable Alternaria spp. contamination in tomato products. Int. J. Food Microbiol, 2013, vol. 165, no. 3, pp. 214-220. doi: 10.1016/j.ijfoodmicro.2013.05.017.
8. Kumar S., Singh R., Kashyap P.L., Srivastava A.K. Rapid detection and quantification of Alternaria solani in tomato. Sci. Hortic, 2013, vol. 151, pp. 184-189. doi: 10.1016/j.scienta.2012.12.026.
9. von Hertwig A.M., Sant'Ana A.S., Sartori D., Silva J., Nascimento M.S., Iamanaka B.T., Pelegrinelli Fungaro M.H., Taniwaki M.H. Real-time PCR-based method for rapid detection of Aspergillus niger and Aspergillus welwitschiae isolated from coffee. J. Microbiol. Methods, 2018, vol. 148, pp. 87-92. doi: 10.1016/j.mimet.2018.03.010.
10. Nikitin M., Deych K., Grevtseva I., Girsova N.V., Kuznetsova M., Pridannikov M., Dzhavakhiya V., Statsyuk N., Golikov A.G. Preserved microarrays for simultaneous detection and identification of six fungal potato pathogens with the use of real-time PCR in matrix format. Biosensors, 2018, vol. 8, no. 4, pp. 129-137. doi: 10.3390/bios8040129.
34
P.M. EEHHHHCQH h gp.
11. De la Lastra E., Basallote-Ureba M.J., De los Santos B., Miranda L., Vela-Delgado M.D., Capote N. A TaqMan real-time polymerase chain reaction assay for accurate detection and quantification of Fusarium solani in strawberry plants and soil. Sci. Hortic., 2018, vol. 237, pp. 128-134. doi: 10.1016/j.scienta.2018.04.007.
12. Shan L., Haseeb H.A., Zhang J., Zhang D. Jeffers D.P., Dai X., Guo W. A loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay for the rapid detection of toxigenic Fusarium temperatum in maize stalks and kernels. Int. J. Food Microbiol., 2019, vol. 291, pp. 72-78. doi: 10.1016/j.ijfoodmicro.2018.11.021.
13. Lan C., Ruan H., Yang X., Yao J. Jiang J. Development of a loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and specific detection of Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum Owen. Phytoparasitica, 2018, vol. 46, pp. 283-293. doi: 10.1007/s12600-018-0669-3.
14. Pu J., Xie Y., Zhang H., Zhang X., Qi Y., Peng J. Development of a real-time fluorescence loopmediated isothermal amplification assay for rapid and quantitative detection of Fusarium man-giferae associated with mango malformation. Physiol. Mol. Plant Pathol., 2014, vol. 86, pp. 81-88. doi: 10.1016/j.pmpp.2014.04.002.
15. Denschlag C., Rieder J., Vogel R.F., Niessen L. Real-time loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay for group specific detection of important trichothecene producing Fusarium species in wheat. Int. J. Food Microbiol, 2014, vol. 177, pp. 117-127. doi: 10.1016/j.ijfoodmicro.2014.02.010.
16. Jaillais B., Roumet P., Pinson-Gadais L., Bertrand D. Detection of Fusarium head blight contamination in wheat kernels by multivariate imaging. Food Control, 2015, vol. 54, pp. 250-258. doi: 10.1016/j.foodcont.2015.01.048.
17. Kaya-Celiker H., Mallikarjunan P.K., Kaaya A. Mid-infrared spectroscopy for discrimination and classification of Aspergillus spp. contamination in peanuts. Food Control, 2015, vol. 52, pp. 103111. doi: 10.1016/j.foodcont.2014.12.013.
18. Liang P.-S., Slaughter D.C., Ortega-Beltran A., Michailides T.J. Detection of fungal infection in almond kernels using near-infrared reflectance spectroscopy. Biosyst. Eng., 2015, vol. 137, pp. 6472. doi: 10.1016/j.biosystemseng.2015.07.010.
19. Pan T., Sun D.-W., Pu H., Wei Q., Xiao W., Wang Q.-J. Detection of A. alternata from pear juice using surface-enhanced Raman spectroscopy based silver nanodots array. J. Food Eng., 2017, vol. 215, pp. 147-155. doi: 10.1016/j.jfoodeng.2017.07.019.
20. Shen F., Zhao T., Jiang X., Liu X., Fang Y., Liu Q., Hu Q., Liu X. On-line detection of toxigenic fungal infection in wheat by visible/near infrared spectroscopy. J. Food Sci. Technol., 2019, vol. 109, pp. 216-224. doi: 10.1016/j.lwt.2019.04.019.
21. Shen F., Wu Q., Liu P., Jiang X., Fang Y., Cao C. Detection of Aspergillus spp. contamination levels in peanuts by near infrared spectroscopy and electronic nose. Food Control, 2018, vol. 93, pp. 1-8. doi: 10.1016/j.foodcont.2018.05.039.
22. Tamburini E., Mamolini E., De Bastiani M., Marchetti M.G. Quantitative determination of Fusari-um proliferatum concentration in intact garlic cloves using near-infrared spectroscopy. Sensors, 2016, vol. 16, no. 7, pp. 1099-1112. doi: 10.3390/s16071099.
23. Wu Q., Xie L., Xu H. Determination of toxigenic fungi and aflatoxins in nuts and dried fruits using imaging and spectroscopic techniques. Food Chem., 2018, vol. 252, pp. 228-242. doi: 10.1016/j.foodchem.2018.01.076.
24. Saldan N.C. Almeida R.T.R., Avincola A., Porto C., Galuch M.B., Magon T.F.S., Pilau E.J., Svi-dzinski T.I.E., Oliveira C.C. Development of an analytical method for identification of Aspergillus flavus based on chemical markers using HPLC-MS. Food Chem., 2018, vol. 241, pp. 113-121. doi: 10.1016/j.foodchem.2017.08.065.
25. Gu S., Wang J., Wang Y. Early discrimination and growth tracking of Aspergillus spp. contamination in rice kernels using electronic nose. Food Chem., 2019, vol. 292, pp. 325-335. doi: 10.1016/j.foodchem.2019.04.054.
26. Erler A., Riebe D., Beitz T., Lohmannsroben H.-G., Grothusheitkamp D., Kunz T., Methner F.-J. Detection of volatile organic compounds in the headspace above mold fungi by GC-soft X-radiation-based APCI-MS. J. Mass Spectrom., 2018, vol. 53, no. 10, pp. 911-920. doi: 10.1002/jms.4210.
27. Siddiquee S., Rovina K., Yusof N.A., Rodrigues K.F., Suryani S. Nanoparticle-enhanced electrochemical biosensor with DNA immobilization and hybridization of Trichoderma harzianum gene. Sens. Bio-Sens. Res., 2014, vol. 2, pp. 16-22. doi: 10.1016/j.sbsr.2014.06.002.
28. Peltomaa R., Vaghini S., Patiño B., Benito-Peña E., Moreno-Bondi M. Species-specific optical genosensors for the detection of mycotoxigenic Fusarium fungi in food samples. Anal. Chim. Acta, 2016, vol. 935, pp. 231-238. doi: 10.1016/j.aca.2016.06.009.
29. Cecchini F., Manzano M., Mandabi Y., Perelman E., Marks R.S. Chemiluminescent DNA optical fibre sensor for Brettanomyces bruxellensis detection. J. Biotechnol., 2012, vol. 157, no. 1, pp. 25-30. doi: 10.1016/j .jbiotec .2011.10.004.
30. Wee E.J.H., Lau H.Y., Botella J.R., Trau M. Re-purposing bridging flocculation for on-site, rapid, qualitative DNA detection in resource-poor settings. Chem. Commun., 2015, vol. 51, no. 27, pp. 5828-5831. doi: 10.1039/C4CC10068A.
31. Zhan F., Wang T., Iradukunda L., Zhan J. A gold nanoparticle-based lateral flow biosensor for sensitive visual detection of the potato late blight pathogen, Phytophthora infestans. Anal. Chim. Acta, 2018, vol. 1036, pp. 153-161. doi: 10.1016/j.aca.2018.06.083.
32. Miranda B.S., Linares E.M., Thalhammer S., Kubota L.T. Development of a disposable and highly sensitive paper-based immunosensor for early diagnosis of Asian soybean rust. Biosens. Bioelectron., 2013, vol. 45, pp. 123-128. doi: 10.1016/j.bios.2013.01.048.
33. Medyantseva E.P., Khaldeeva E.V., Glushko N.I., Budnikov H.C. Amperometric enzyme immunosensor for the determination of the antigen of the pathogenic fungi Trichophyton rubrum. Anal. Chim. Acta, 2000, vol. 411, nos. 1-2, pp. 13-18.
34. Kavand A., Anton N., Vandamme T., Serra C.A., Chan-Seng D. Synthesis and functionalization of hyperbranched polymers for targeted drug delivery. J. Controlled Release, 2020, vol. 321, pp. 285-311. doi: 10.1016/j .jconrel.2020.02.019.
35. Medyantseva E.P., Kremleva N.V., Budnikov H.C., Bormotova Y.I. Amperometric biosensor for lead and cadmium determination. J. Anal. Chem., 1999, vol. 54, no. 2, pp. 151-154.
36. Yoshida K. Elektrookislenie v organicheskoi khimii. Rol' kation radikalov kak intermediatov v sinteze [Electrooxidation in Organic Chemistry. The Role of Cation Radicals as Synthetic Intermediates]. Moscow, Mir, 1987. 336 p. (In Russian)
37. Egorov A.M. Teoriya ipraktika immunofermentnogo analiza [Theory and Practice of Enzyme Immunoassay]. Moscow, Vyssh. Shk., 1991. 288 p. (In Russian)
38. Musil Ya., Novakova O., Kunts K. Sovremennaya biokhimiya v skhemakh [Modern Biochemistry in Schemes]. Moscow, Mir, 1994. 44 p. (In Russian)
<Для цитирования: Бейлинсон Р.М., Медянцева Э.П., Кириллова Е.А., Халдеева Е.В., Будников Г.К. Амперометрические иммуноферментные сенсоры в определении антигенов Fusarium oxysporum // Учен. зап. Казан. ун-та. Сер. Естеств. науки. - 2022. -Т. 164, кн. 1. - С. 22-35. - doi: 10.26907/2542-064X.2022.1.22-35.
<For citation: Beilinson R.M., Medyantseva E.P., Kirillova E.A., Khaldeeva E.V., Budnikov H.C Amperometric enzyme immunoassay sensors in determination of Fusarium oxysporum antigens Uchenye Zapiski Kazanskogo Universiteta. Seriya Estestvennye Nauki, 2022, vol. 164, no. 1 pp. 22-35. doi: 10.26907/2542-064X.2022.1.22-35. (In Russian)
