CC BY
38УДК 616.226 Marina A. Dmitrienko, Anatolii I. Ginak
AMMONIA AS GASEOUS BIOMARKER OF HELICOBACTER PYLORI INFECTION
Association of Medicine and Analytics, Co Ltd, 17 linia V.O., 4-6, St Petersburg, 199034, Russia
St Petersburg State Institute of Technology (Technical University), Moskovsky Pr., 26, St Petersburg, 190013, Russia e-mail: [email protected]
The ammonia level in gaseous biological samples reflects the state of the body, and that is why it is a biomarker which allows diagnosing some diseases and pathology. The article presents the approach to development of the method and test-systems for the specific medical diagnostics, specifically for the Helicobacter pylori infection. It includes setting of the goal, search for analytical detectors and development of diagnostic equipment. Two test-systems with indicator tubes and one test- system with an electrochemical sensor have been developed. Their diagnostic effectiveness has been evaluated at 11 hospitals in Russia, Ukraine, Belarus; the diagnostic sensitivity is 91-97%, the diagnostic specificity is 87.5-96%.
Key words: Ammonia, biomarker, medical diagnostics, Helicobacter pylori infection, HELIC-test, analytical and diagnostic sensitivity and specificity.
Введение
Точная и быстрая диагностика заболеваний или патологических состояний человека важна для правильного оказания медицинской помощи. В то время как анализ жидких и твердых биологических образцов широко используется в клинической практике, анализ газообразных проб, напротив, практически отсутствует. И это несмотря на огромное количество информации о состоянии организма, которое несут в себе пробы выделяемой человеком смеси газов.
С древних пор врачеватели знали о важности для постановки правильного диагноза запаха, исходящего от больного [1]. В те времена довериться можно было только обонянию, ни о каком анализе воздуха речи не было. Первые эксперименты по изучению состава выдыхаемого воздуха были сделаны в 18 веке [2]. С тех пор исследования в этой области сильно продвинулись.
На стыке химии, физики, биологии, медицины формируется новая наука, у которой еще даже нет устоявшегося названия. Ее обозначают как «исследование дыхания» - breath research, «брифомика» - breathomics, входящая в «омиксные технологии».
Метаболические процессы с образованием аммиака
В ходе процессов жизнедеятельности в организме образуются вещества-метаболиты, которые могут быть
М.А. Дмитриенко1, А.И. Гинак2
АММИАК КАК ГАЗООБРАЗНЫЙ БИОМАРКЕР ИНФЕКЦИИ HELICOBACTER PYLORI
ООО «Ассоциация Медицины и Аналитики», 17 линия В.О., 4-6, Санкт-Петербург, 199034, Россия Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет), Московский пр. 26, Санкт-Петербург, 190013, Россия e-mail: [email protected]
Уровень аммиака в газообразных биологических образцах отражает состояние организма, поэтому он является биомаркером и позволяет диагностировать некоторые заболевания и патологические состояния. В статье рассматривается подход к разработке комплекса методик и устройств для специфической медицинской диагностики на примере определения инфекции Helicobacter pylori (HP), включающий постановку задачи, поиск аналитических детекторов, разработку диагностического оборудования на их основе. Разработаны две тест-системы с использованием индикаторных трубок и одна - с электрохимическим датчиком. Предложенные методы и средства оценивались в 11 медицинских учреждениях России, Украины, Белоруссии по их диагностической эффективности; диагностическая чувствительность составила 91-97%, а диагностическая специфичность - 87.5-96%.
Ключевые слова: аммиак, биомаркер, медицинская диагностика, хеликобактериоз, ХЕЛИК-тест, аналитическая и диагностическая чувствительность и специфичность.
биомаркерами. Биомаркер - это объективный признак медицинского состояния, наблюдаемый вне пациента, который может быть измерен точно и воспроизводимо [3].
Аммиак участвует в большом числе метаболических реакций организма человека, он может быть индикатором множества физиологических и патологических процессов. Измерить его содержание точно и воспроизводимо также возможно, значит, он соответствует определению биомаркера.
193 фермента катализируют биохимические реакции с участием аммиака, (причем некоторые катализируют множественные реакции), среди них: окислительное дезаминирование глутаминовой кислоты глутаматдегидрогеназой; дезаминирование аминокислот оксидазами, окисление цистеина до цистеинсульфиновой кислоты, которая затем окислительно дезаминируется и разрушается до сульфата и пирувата; дезаминирование гистидина лиазой; окисление глицина глициноксидазой; отщепление амидной группы от глутамина глутаминазой и многие другие [4].
В ходе клеточного метаболизма аммиак продуцируется и расходуется практически во всех органах и тканях организма человека (желудочно-кишечном тракте, мышцах, мозговой ткани, печени, почках), а также его микрофлорой [5]. В кишечнике, где микрофлора генерирует большую часть всего производимого в организме аммиака, скорость его образования достигает
1 Дмитриенко Марина Александровна, канд. техн. наук, генеральный директор ООО «Ассоциация Медицины и Аналитики», e-mail: m_dmitrienko@ amamed.ru
Marina A. Dmitrienko, PhD (Eng.), general director "Association of Medicine and Analytics" Co. Ltd
2 Гинак Анатолий Иосифович, д-р хим. наук, профессор, каф. молекулярной биотехнологии СПбГТИ(ТУ), e-mail: [email protected] Anatolii I. Ginak, Dr Sci (Chem.), professor, Molecular biotechnology department SPbSIT(TU),
Дата поступления - 22 декабря 2015 года
0,16 ммоль/ч на кг массы тела, что в итоге приводит к цифре 4,6 г в сутки на человека в среднем [4].
Аммиак является токсичным соединением, поэтому в организме человека существуют механизмы его детоксикации, в первую очередь, в печени [6]. При этом основное количество аммиака в ходе орнитинового цикла конвертируется в менее токсичное соединение - карбамид (мочевину). Мочевина затем выводится почками, часть мочевины может быть конвертирована печенью или почками обратно в аммиак.
В норме в выдыхаемом здоровым человеком воздухе может быть обнаружено от 100-150 ррЬ [7] до 400-2400 ррЬ аммиака [8].
Возможно ли в таком случае практическое использование аммиака в качестве биомаркера?
Возможно, поскольку превышение неких предустановленных пределов нормального содержания аммиака может свидетельствовать о патологии.
Опубликовано большое количество статей, в которых говорится об увеличении уровня аммиака в выдыхаемом воздухе при физической нагрузке, курении, патологии и заболеваниях в первую очередь тех органов, где происходит образование, метаболизация или выведение аммиака. Примеры патологических состояний, при которых отмечено повышение уровня аммиака в выдыхаемом воздухе, приведены в таблице 1.
Таблица 1. Патологические состояния, связанные с повышением уровня аммиака в выдыхаемом воздухе
Патологическое состояние Концентрация аммиака Ссылка
Цирроз печени G.745 ppm [9]
Рак легкого Не указывается [1G]
Терминальная стадия почечной недостаточности 15GG-2GGG ppb [11]
Терминальная стадия почечной недостаточности 4G-2993 ppbv [12]
Острая и хроническая почечная недостаточность 914.5±3G1.4ppb 964.4±4G2.4ppb [13]
Предлагаются методики мониторинга состояния пациентов с тяжелыми заболеваниями печени [9], почек [11, 12] по уровню NH3 в выдыхаемом воздухе. Для анализа аммиака разработан прибор AmBeR (Dublin city University, Ирландия) на полианилиновом сенсоре с наночастицами [14]. Прибор предназначен для диагностики хронических заболеваний печени, почек, оценки спортивного метаболизма, токсичности лекарств и спортивного питания [15]. Упоминается также диагностика инфекции Helicobacter pylori [15] и обнаружение дефектов цикла мочевины у новорожденных по уровню аммиака в выдыхаемом воздухе [16].
Таким образом, можно утверждать, что аммиак является неспецифическим биологическим маркером многих патологических состояний и заболеваний.
Может ли аммиак быть специфическим биомаркером, иными словами - можно ли из всего многообразия продуцирующих аммиак реакций выделить одну и построить на ней специфическую диагностику конкретного заболевания? В частности, диагностику инфекции Helicobacter pylori (НР), которая является одной из самых острых проблем гастроэнтерологии последних десятилетий [17, 18]?
Диагностика Helicobacter pylori
Поиск и совершенствование методов диагностики инфекции НР ведется с 1983 года, когда была подтверждена роль обитающей в желудке бактерии в развитии заболеваний желудочно-кишечного тракта [18].
Отправной точкой при разработке метода специфической диагностики инфекции Helicobacter py-
lori послужили наблюдения врачей-гастроэнтерологов о том, что от пациентов, страдающих хеликобактериозом, пахнет аммиаком.
Причина этого запаха становится понятной после рассмотрения основной реакции (1), обеспечивающей способность бактерии НР выживать в агрессивных условиях окружающей среды в желудке:
(.nh2)2co + н20 ^^ с02 т +2nh3 т
(1)
Это реакция гидролиза мочевины (карбамида, CAS 57-13-6) под действием уреазы (CAS 9002-13-5) НР в присутствии кислоты.
В желудочном соке в норме содержится 5-10 ммоль/л мочевины; она может быть гидролизована в ходе ферментативной реакции (1).
Образующиеся в ходе гидролиза продукты повышают рН окружающей бактериальную клетку среды и спасают ее от гибели. Поэтому подавляющее количество (до 99 %) штаммов НР уреазопозитивны, и именно эти штаммы способны колонизировать желудок и дуоденум.
Реакция (1) лежит в основе биохимического метода определения НР, при этом анализ может вестись по любому продукту, как по СО2, так и по NH3. Использование каждого из аналитов имеет свои плюсы и минусы.
Образующиеся в ходе реакции (1) газообразные продукты не остаются в желудке. Считается, что диоксид углерода диффундирует в кровеносные сосуды эпителия и в течение нескольких минут появляется в выдыхаемом пациентом воздухе [18]. В связи с тем, что СО2 является основным дыхательным метаболитом, его содержание в выдыхаемом воздухе велико и зависит от множества факторов. Для того, чтобы его использовать в качестве специфического маркера отдельной метаболической реакции, вводят изотопную метку 13С или 14С в субстрат данной реакции; в случае диагностики НР - в мочевину [19]. Даже в этом случае ошибки метода измерения составляют 0,2 - 0,5 %о [19].
Аммиак выводится с помощью другого механизма: образовавшийся в желудке в ходе гидролиза карбамида аммиак через пищевод, трансэзофагеально, поступает в ротовую полость [20]. При этом также неизбежны потери, в первую очередь - в реакции нейтрализации желудочным соком и за счет высокой растворимости аммиака в воде.
Рассмотрим особенности аммиака в качестве биомаркера данной реакции. Увеличение содержания аммиака в слизистой оболочке желудка (СОЖ) при пер-систировании в нем бактерии НР было экспериментально подтверждено различными методами [21, 22]. Но определять аммиак внутрижелудочно in vivo в ходе фиброгастродуоденоскопии (ФгДс) весьма сложно, это возможно только в исследовательских целях.
Уровень аммиака в воздухе ротовой полости человека изменяется в довольно широких пределах. На этом фоне доля аммиака, добавляемая колонией бактерий НР, может быть неразличима, особенно если значение рН желудочного содержимого нормальное, т.е. в пределах 0,8-2,0 единиц рН. В таких условиях образующийся аммиак практически сразу будет протонироваться:
nh,
^ рКа=9,25
+ н+ <?===> nha
(2)
и в виде иона аммония поступать в кровь, далее кровотоком - в воротную вену и нейтрализоваться в печени, не доходя до газообразного состояния.
На практике это подтвердилось тем, что определение НР по уровню аммиака в выдыхаемом воздухе (методика «Аэротест») было возможно в случае ярко выраженного хеликобактериоза (большой суммарной уреазной активности) или при критически высоких значениях рН желудочного содержимого - на уровне 7,5-8,0 единиц.
Для повышения специфичности определения был применен своеобразный «метод добавки».
Сначала определялся уровень аммиака, свойственный данному человеку в его текущем состоянии, так называемый «базальный» уровень. При этом сводились к минимуму все факторы, которые могут повлиять на результат обследования, как по продукции аммиака, так и по активности определяемого микроорганизма. Затем провоцировалась реакция ферментативного гидролиза в желудке. Для этого пациент принимал порцию мочевины в виде водного раствора, которая при наличии у обследуемого хеликобактериоза запускала реакцию (1), причем по всей поверхности желудка, покрытой биопленкой с НР и ее уреазой. Через несколько минут после приема порции субстрата определение уровня аммиака в ротовой полости пациента проводилось еще раз - это был уже «нагрузочный» уровень.
Сравнение полученных при анализе характеристик газовоздушной смеси (ГВС) ротовой полости, в первую очередь, содержания аммиака, позволяла сделать вывод о наличии инфекции НР по проявленной уреазной активности.
Данная методика получила название ХЕЛИК-тест [23].
Детекторы аммиака
Оценить возможности предложенного метода и ответить на вопрос о пригодности аммиака для специфического определения НР можно было, только найдя соответствующие детекторы аммиака.
Аналитическая задача формулировалась следующим образом:
• область применения - медицинская диагностика;
• определяемый аналит - аммиак;
• диапазон определяемого содержания 0,5^20 мг/м3;
• анализируемая среда - воздух ротовой полости;
• условия определения: нормальное атмосферное давление,
• температура 30-36 °С;
• относительная влажность 80-99 %;
• режим пробоотбора: принудительный;
• скорость отбора пробы 2^20 мл/с;
• селективность - не должны мешать определению Н20, Н2, N0*, спирты и др. органические соединения, которые могут присутствовать в воздухе ротовой полости.
В качестве детекторов аммиака были использованы индикаторные трубки (ИТ) и электрохимические датчики (ЭХД) для определения аммиака в газовой фазе.
Индикаторные трубки (ИТ) реализуют собой линейно-колористический метод определения содержания вещества. Он основан на изменении длины окрашенного слоя композиции внутри ИТ при пропускании через нее воздуха, содержащего аналит - аммиак. Молекулы аммиака, соединяясь с молекулами воды (присутствующими во влажном воздухе), адсорбируются на частицах индикаторной композиции. При этом повышается значение рН, что приводит к изменению цвета индикатора, нанесенного на частицы композиции. Длина окрашиваемого слоя индикаторной композиции пропорциональна детектируемой концентрации аммиака.
Существующие ИТ экологического назначения, способные определять содержание аммиака в газовой фазе в требуемом диапазоне концентраций [24], не обладают требуемыми аналитическими характеристиками в заданных условиях проведения анализа. Поэтому сотрудниками ООО «АМА» были разработаны детекторы специально для решения поставленной задачи [25].
Основные аналитические параметры разработанных индикаторных трубок представлены в таблице 2.
Таблица 2. Аналитические характеристики индикаторных трубок
Наименование параметра Значение параметра
Выходной сигнал Длина окрашиваемого слоя, м
Диапазон детектируемых концентраций аммиака (0,3-10) мг/м3
Минимально определяемая концентрация аммиака 0,3 мг/м3
Скорость пропускания анализируемой ГВС, 2,0 ± 0.1 мл/с
Чувствительность 5 106 м/кг
Воспроизводимость Относительное стандартное отклонение - не более 5 %
Продолжительность анализа 6 мин
Характеристики анализируемых проб воздуха Температура: 30-36 °С Влажность: 70-100 %
Индикаторная трубка - одноразовое устройство.
С одной стороны, это осложняет выполнение аналитической задачи необходимостью делать вывод об инфицированности пациента по единственному обследованию, с другой стороны - позволяет разработать одноразовое средство индивидуального применения и свести к минимуму возможность инфекционной контаминации.
Воздух ротовой полости имеет очень высокое содержание паров воды, при этом разработанной индикаторной трубке как детектору влажность не мешает, а наоборот, делает индикаторный эффект более ярким, а визуальную границу - более четкой.
Еще одна особенность ИТ - ее кумулятивность, т.е. способность накапливать индикаторный эффект в ходе всего времени проведения анализа. Это позволяет обеспечить требуемую аналитическую чувствительность по отношению к аналиту аммиаку на уровне 0,3 мг/м3.
Нами были определены факторы, оказывающие влияние на результат анализа с помощью ИТ. Эти факторы могут быть разделены на три группы.
I. Производственные, связанные с различием в конструктивных элементах ИТ:
• неодинаковая плотность индикаторной композиции в трубке;
• колебания высоты слоя композиции;
• изменение диаметра трубки;
• неравномерность нанесения реагентов на носитель;
• неодинаковость размера гранул носителя;
• неодинаковое аэродинамическое сопротивление уплотнительных тампонов в трубках.
Такие или подобные проблемы характерны для всех ИТ как детектирующих устройств [24].
Нами была также отмечена зависимость качества ИТ от температуры и влажности в производственном помещении, где изготавливаются трубки, от стабильности характеристик реагентов и комплектующих, из которых изготавливаются ИТ, а также от профессиональных навыков изготавливающего трубки персонала при ручной сборке или от наладки оборудования при автоматизированном изготовлении. Все эти производственные факторы должны строго контролироваться, так как они могут существенно повлиять на результат анализа и даже исказить его.
Свести влияние производственных факторов к минимуму возможно путем совершенствования всех этапов процесса серийного изготовления и контроля ИТ.
II. Результат обследования зависит от факторов пробоотбора, в первую очередь - от правильной работы насоса, аспирирующего воздух через ИТ.
Насос должен обеспечивать постоянную скорость пропускания анализируемой ГВС во все время анализа
в течение всего срока службы независимо от колебаний напряжения и частоты в сети, быть простым и надежным в работе и при этом недорогим. Насос для применения с индикаторными трубками был разработан также в ООО «АМА», г. Санкт-Петербург, и выпускается в виде единой с ИТ тест-системы. Технические характеристики разработанного насоса приведены в таблице 3.
Таблица 3. Технические характеристики насоса воздушного для индикаторных трубок.
Наименование параметра Значение параметра
Напряжение (220 ± 22)В
Частота 50 Гц
Производительность с ИТ (2,0 ± 0,1) мл/с
Потребляемая мощность 6 Вт
Создаваемое давление, не менее 120 мбар
Уровень производимого шума (на расстоянии 1,8 м), не более 35 дБ
При отборе пробы возможна потеря аналита на этапе доставки пробы к детектору. Это особенно критично при определении низких концентраций аммиака, так как аммиак имеет высокую степень адгезии к некоторым материалам, а также хорошо растворим в воде. При прохождении пробы, например, через металлическую или силиконовую трубку, или через трубку с конденсированными парами воды существенное, но неизвестное количество паров аммиака может быть потеряно, и проба будет нерепрезентативной.
Использование ИТ в качестве детектирующего устройства позволяет свести потери к минимуму, так как расстояние от места генерации или выхода аналита (ротоглотки) до конца ИТ составляет 5-20 мм. Уменьшение этого расстояния вызывает риск касания конца трубки поверхности слизистой и засасывания слюны, а превышение или тем более выход ИТ из ротовой полости - риск уменьшения или потери целевого сигнала. И в том, и в другом случае результат анализа будет недостоверен, и обследование необходимо будет проводить заново. Во избежание этого нами разработан специальный мундштук, надеваемый на кончик ИТ. Мундштук позиционирует ИТ в полости рта, предохраняет трубку от попадания в нее слюны и облегчает проведение диагностической процедуры для пациента.
III. Третья группа влияющих факторов -процедурные. Они в первую очередь зависят от обследуемого: адекватная подготовка пациента к тестированию, соблюдение всех необходимых требований и ограничений, правильное поведение при тестировании, прием порции карбамида и полоскание рта перед повторным обследованием, правильное дыхание в течение всего времени тестирования.
К этой же группе следует отнести факторы, зависящие от проводящего обследование медицинского работника - так называемые «операторские ошибки»: несоблюдение процедуры и временных интервалов при проведении обследования, неверная оценка результата анализа и т.п.
Нами был проведен анализ всех групп влияющих факторов. В результате были внесены изменения в характеристики ИТ, насоса, а также откорректированы инструкции по проведению обследования.
Электрохимические датчики (ЭХД). Принцип работы электрохимического амперометрического сенсора заключается в следующем. Молекулы газа, проникая в электролит сквозь мембрану, сдвигают динамическое равновесие. При этом изменяется
разность потенциалов между электродами, вызывая электрический ток через электрохимический элемент.
Для выполнения поставленной аналитической задачи необходимо было найти среди серийно выпускаемых электрохимических датчиков такой, который мог бы стабильно и воспроизводимо работать в требуемом диапазоне концентраций в сложных условиях медицинского применения (предельно высокая влажность воздуха ротовой полости и принудительное движение анализируемой воздушной смеси).
Нестандартные условия приводят к изменению характеристик и к существенному снижению срока службы ЭХД для медицинского применения по сравнению с паспортным (см. таблицу 4).
Таблица 4. Аналитические характеристики электрохимического датчика
Параметр ЭХД по паспортным данным ЭХД при анализе воздуха ротовой полости
Выходной сигнал Сила тока, нА Сила тока, нА
Диапазон (0,0 -70,9) мг/м3 1,40-15,00 мг/м3
Разрешение 0,7 мг/м3 0,71 мг/м3
Скорость пропускания анализируемой ГВС, 0 мл/с, пассивная диффузия 12±1 мл/сек
Погрешность Не более 10% Не более 10%
Время отклика Не более 60 сек Частота снятия сигнала - 1р в 1 сек
Срок жизни чувствительного элемента 2 г 6 мес.
Селективность Сероводород мешает определению Сероводород мешает определению
Частота снятия сигнала ЭХД - 1 раз в секунду, продолжительность тестирования - несколько минут, которые должны пройти от момента принятия пациентом карбамида до наиболее вероятного момента выхода максимального количества аммиака в ротовую полость. Это позволяет уйти от единственности определения, присущей ИТ. Непрерывность регистрации аммиака позволяет за 9 мин проведения анализа получить 540 значений и наблюдать процесс кинетически.
Рассматривая факторы, влияющие на результат анализа с помощью ЭХД (аналогично ИТ), необходимо отметить, что группа производственных факторов была сведена к минимуму путем использования серийно изготавливаемых на стандартизированном производстве ЭХД. Применение с диагностической целью сократило срок службы датчика, но не повлияло на точностные характеристики (см. таблицу 4).
Пробоотбор при использовании ЭХД необходимо было организовать по-другому в сравнении с ИТ: расстояние от ротовой полости до места детектирования увеличилось до 300-350 мм. Для уменьшения потерь аналита был выбран материал шланга с минимальной степенью разрушения аммиака на стенках - поливинилхлорид ПВХ ПМ. Но даже в таком случае при длине шланга 300 мм величина целевого сигнала снижается вдвое.
Применение мундштука также является целесообразным, как и в случае с ИТ.
Электрохимический датчик требует плавности потока анализируемой ГВС, так как толчки при движении потока (например, при использовании насоса мембранного типа) разрушающе действуют на мембрану ЭХД и искажают показания сенсора.
Процедурные влияющие факторы в меньшей степени зависят от типа используемого для анализа детектора; они остаются практически теми же, что и для обследования с помощью ИТ.
Диагностическая эффективность устройств
На основе выбранных детекторов нами были разработаны устройства для диагностики инфекции НР:
• тест-система ХЕЛИК® с ИТ в вариантах с компрессором (РУ № ФСР 2009/05180), и с устройством ХЕЛИК-скан для неинвазивного определения хеликобактериоза (РУ № РЗН 2015/2536);
• индикатор компьютеризированный ХЕЛИК®-аппарат (РУ № ФСР 2010/07907).
Были разработаны методики проведения тестирования пациентов с каждым из этих устройств и оценена их диагностическая эффективность.
Согласно международным стандартам, например, BS EN ISO 18153:2003[26], ISO/TS 17822-1:2014(en) [27], рекомендованных теперь и для использования в России [28], диагностическая эффективность метода (и, соответственно, оборудования, работающего на основе данного метода) определяется путем сравнения с референтным, или эталонным методом [29]. В качестве эталонного используется так называемый «золотой стандарт», или как его называют теперь, «критериальный стандарт».
Расчет основных операционных диагностических характеристик осуществляется с помощью «латинского квадрата» (таблица 5) [30].
Таблица 5. Четырехпольная таблица определения основных характеристик диагностических методов
Результаты Заболевание
исследования есть нет
Положительные A (ИП) B (ЛП)
Отрицательные C (ЛО) D (ИО)
Примечание: ИО- (true negative) -истинно отрицательный результат.
ЛО- (false negative) - ложноотрицательный результат.
ЛП - (false positive) - ложноположительный результат.
ИП - (true positive) - истинно положительный результат.
Тогда диагностическая чувствительность (sensitivity, Se) - это доля больных, которые выявляются диагностическим методом как больные. Определяется по формуле:
Se = ИП/(ИП+ЛО) • 100 (3)
Диагностическая специфичность (specificity, Sp) -это доля здоровых, которые определяются диагностическим методом как здоровые. Определяется по формуле:
Sp = ИО/(ИО+ЛП) • 100 (4)
Чувствительность и специфичность являются операционными характеристиками теста, которые оцениваются в диагностическом эксперименте.
Часто также определяют прогностичность положительного результата, прогностичность
отрицательного результата, распространенность и некоторые другие характеристики [30].
Оценка эффективности разработанных нами средств диагностики НР по сравнению с другими методами определения этой инфекции за прошедшие годы проводилась неоднократно в различных ЛПУ России, Украины, Белоруссии. Результаты этих исследований приведены в таблице 6.
Как можно увидеть, диагностические характеристики довольно сильно изменяются в зависимости от места проведения работы, количества и возраста пациентов, а также методов сравнения. За
неимением абсолютно достоверного (и чувствительного, и специфичного) референтного метода подтверждения хеликобактериоза использовались сочетания различных методов, в том числе гистологический, бактериологический, гистобактериоскопический, серологический методы, спектрометр ионного дрейфа - СИД, полимераз-но-цепная реакция - ПЦР, быстрый уреазный тест - БУТ, иммуноферментный анализ - ИФА, Гастропанель, моче-винный дыхательный тест 13С-иВТ.
Обращают на себя внимание результаты сопоставительных исследований группы под управлением профессора М.РКонорева (Витебск, Белоруссия), который показал относительность диагностических показателей ХЕЛИК-теста при изменении порядка референсного определения инфекции [34, 40]. Сопоставления показывают, что подтверждение наличия у пациента инфекции НР следует вести по 5 биоптатам (3 из тела и 2 из антрального отдела желудка). «Нарушение протокола взятия биопсийного материала для морфологического исследования приводит к занижению показателей и операционных характеристик диагностического теста» [40]. Диагностическая чувствительность ХЕЛИК-теста, определенная в сравнении с гистологической оценкой слизистой по 5 биоптатам, составляет 94 %, а в сравнении с гистологической оценкой по одному биоптату - 81 %. Разница в показателях диагностической специфичности еще более существенна: 92 % и 48 % соответственно.
В настоящей статье возможность применения газообразного аммиака в качестве специфического маркера конкретного заболевания - хеликобактериоза
- оценивается по диагностической эффективности неинвазивных тест-систем. Чувствительность ХЕЛИК-теста как метода, определенная в ходе приведенных в таблице 6 исследований, оказалась на уровне от 91 до 97 %, специфичность - от 86,5 до 96 %. Вариации показателей понятны, так как сравнение проводилось по отношению к разным методам, среди пациентов разных возрастных групп, а в некоторых случаях - на фоне сопутствующих заболеваний. Эти значения показателей чувствительности и специфичности свидетельствуют о том, что аммиак может служить специфическим маркером инфекции НР.
Высокая диагностическая чувствительность разработанных тест-систем (91-97 %) обеспечена высокой аналитической чувствительностью применяемых детекторов и эффективностью биохимического
- каталитического - метода, лежащего в основе определения НР.
Более того, все три типа разработанных диагностических тест-систем имеют запас по аналитической чувствительности - они могут обнаруживать меньшие количества аммиака, и, соответственно, меньшие уровни уреазной активности и/или меньшее количество бактериальных клеток НР. Но при высоком уровне инфицированности населения России НР (70-90 %) чересчур высокая чувствительность определения неизбежно вызовет рост числа ошибок первого рода, или ложноположительных срабатываний. Поэтому, определение 0,01 единицы уреазной активности при инвазивном определении является вполне разумным пределом, обозначающим границу между инфицированным и неинфицированным пациентом.
По литературным данным, приблизительно 1405 бактериальных клеток должно присутствовать в образце биоптата для установления положительного результата тестирования [41]. Это и есть минимальное количество клеток бактерии НР, которое является границей инфицирования.
Специфичность определения также должна быть оценена с двух точек зрения. Аналитическая специфичность, или селективность, показывает, насколько верно используемые детекторы и тест-системы
Таблица 6. Диагностические чувствительность и специфичность ХЕЛИК-теста
№ Место Пациенты Возраст Метод сравнения Se, % Sp, % Совпадение, % Ссылка
1 СПбГПМА, Санкт-Петербург 124 пациента Дети Гистология и БУТ, Сравнение со СИД 97 96 [32]
2 Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И.Пирогова, Москва 200 пациентов Взрослые ПЦР, жидкий уреазный тест (среда Нестерко) 91 90 Акт испытаний
3 Украина, Киев, НМАПО Взрослые 27 ж+23м 37,5±2,9 13С-ивт (Украинско- немецкий центр BYK-Киев) 91,2 87,5 [33]
4 Научный центр здоровья детей, Москва, Россия 200 Гистология, серология, бактериология, уреазный тест 92 90 Акт испытаний
5 Государственный медицинский университет, Витебск, Белоруссия 47(7ж+40м) Ревмат. артрит, прием NSAIDs 54,2±12,5 Гистология по 5 биоптатам, окрашивание по Гимзе 94 90 [34]
6 ГМА Павлова, СЗГМУ им Мечникова, СПб 171 человек взрослые Гистология по 2 биоптатам 92 93 87,5 [35]
7 ГМА Павлова, Елизаветинская ГБ, СЗГМУ им Мечникова, СПб, Россия 2008-2009: 134 взрослых 17-72 БУТ, гистология (4 биоптата), ПЦР, бактериология 85 [36]
8 УГМАДО, Челябинск, ФГУЗ ЦМСЧ №15, Снежинск 145 человек С ЯБДПК взрослые ИФА 88,2 [37]
80 человек с ЯБЖ 92
9 БГМУ, Минск, Белоруссия 37 (11м+26ж) 17-67 гистология 94,7 94,4 [38]
10 МНИИЭМ Габричевского, Москва 168 пациентов взрослые Гистобактериоскопия, Гастропанель 89,3 [39]
42 пациента 18-70 Морфология 5 биоптатов СО тела и антрума 94 92 93
Государственный медицинский университет, областной клинический 18-70 1 биоптат СО антрума -уреазный тест 95 83 92
11 61пациент 18-70 1 биоптат СО антрума-морфология 81 48 67 [40]
центр, Витебск, Белоруссия 18-70 1 биоптат нормальная и модифицированная СО антрума-морфология 81 48 67
47пациентов 18-70 1 биоптат нормальная СО антрума - морфология 93 67 83
на их основе распознают именно аммиак в анализируемой ПВС, есть ли перекрестная чувствительность к мешающим веществам в пробе воздуха ротовой полости. Проводимые нами проверки специфичности ИТ не обнаружили веществ, препятствующих определению искомого аналита из числа тех, что могут присутствовать в исследуемой воздушной смеси. В то же время у некоторых пациентов были отмечены случаи нецелевой цветной реакции индикаторной композиции (появления зеленого цвета вместо сине-фиолетового). Возможно, это означает наличие других важных для диагностики веществ.
При использовании ЭХД мешающее влияние могут оказывать пары воды. Для устранения этого влияния в ХЕЛИК-аппарате предусмотрено снижение влажности поступающей на детектор ПВС. Кроме того, сенсоры, проявляющие чувствительность к парам воды, отбраковываются при входном контроле. Также теоретически известно, что определению может мешать сероводород, являющийся каталитическим ядом для сенсора. Практически за все время работы таких случаев не было зафиксировано ни разу.
Диагностическая специфичность разработанных тест-систем определяется в первую очередь тем, что и где должно быть обнаружено. Нашей целью было обнаружение именно НР и именно в желудке.
Мешать специфической диагностике могут:
- нехеликобактерные уреазопродуценты, колонизирующие полость рта, ротоглотку, пищевод;
- бактерии НР, присутствующие в ротовой полости;
- уреазопродуценты кишечника;
- уреазонегативные штаммы НР.
Во всех отделах желудочно-кишечного тракта человека могут присутствовать микроорганизмы, обладающие уреазной активностью (Corynebacterium spp., Staphylococcus spp., Brevibacterium spp., обитающие на коже, Streptococcus spp., Ureaplasma urealyticum, Proteus spp., Candida spp.). Большая часть их обитает в кишечнике, куда мочевина поступает уже после прохождения желудка. Значит, и аммиак, продуцированный микрофлорой кишечника, будет появляться существенно позже аммиака из желудка. Ограничение времени контроля содержания образовавшегося аммиака десятью минутами позволяет отстроиться от мешающего влияния уреазопродуцентов кишечника.
Доля уреазонегативных штаммов НР желудка несущественна, ~ 1%, и это понятно исходя из механизма выживания бактериальных клеток в агрессивных окружающих условиях желудка. Уреаза и гены ureA, ureB, ее кодирующие, являются одним из основных факторов патогенности Н. pylori [42]. Недоопределение этой части менее патогенных непродуцирующих уреазу бактерий несколько снижает специфичность всех биохимических методов диагностики НР, в том числе и ХЕЛИК-теста, но это снижение невелико.
Гораздо более значимым оказывается влияние ротовой полости, где могут обитать как НР, так и другие уреазопродуценты. Принимаемый пациентом раствор карбамида может стимулировать реакцию ферментативного гидролиза уже во рту и в ротоглотке, если
произойдет контакт находящейся там уреалитической микрофлоры с субстратом реакции (1). В этом случае содержание аммиака в ротовой полости повысится уже через несколько секунд после принятия раствора карбамида. Слишком быстрое появление аналита (до 2030 сек) - свидетельство его нецелевого характера. Для уменьшения влияния уреаз полости рта на результат обследования нами были разработаны рекомендации врачам по правильному проведению тестирования, нашедшие отражение в инструкциях к тест-системам. Согласно этим рекомендациям пациент перед проведением обследования должен почистить зубы, причем зубная паста не должна содержать карбамид, таким образом, влияние уреазопродуцентов ротовой полости существенно снижается. Раствор карбамида следует проглатывать быстро, затем рот надо прополоскать питьевой водой. Это позволит свести к минимуму взаимодействие фермента уреазы и субстрата мочевины. Еще одно важное условие, нарушение которого может привести к ложному срабатыванию тест-системы - отказ от проведения анализа у пациентов, имеющих в момент обследования простудное заболевание, особенно верхних дыхательных путей, или инфицированных Staphylococcus spp и/или другими уреалитиками. Уреазная активность этой микрофлоры ниже, чем у НР, но суммарная активность в разгар заболевания может значимо повлиять на результат анализа.
Правильное проведение обследования с учетом всех описанных обстоятельств обеспечивает высокую диагностическую специфичность ХЕЛИК-теста - от 86,5 до 96 % по таблице 6, что является весьма хорошим показателем для метода широкого практического применения.
Заключение
Разработанные методы и средства обнаружения инфекции НР обеспечивают ее достоверную диагностику. Проведенные сопоставительные испытания позволяют утверждать, что аммиак может использоваться как специфический биомаркер наличия хеликобактериоза у обследуемого пациента.
Литература:
1. Phillips M. Breath tests in Medicine // Sci Am. 1992. V. l(267). P. 74-79.
2. Disease markers in exhaled breath / ed.by N. Marczin, S. Kharitonov, M. Yacoub, P. Barnes New York.: Marcel Dekker, 2003. 534 p.
3. Strimbu K, Tavel JA. What are Biomarkers? // Current opinion in HIV and AIDS. 2010. 5(6). Р. 463-466.
4. Косенко E.A., Каминский Ю.Г. Клеточные механизмы токсичности аммиака. М.: ЛКИ, 2008. 288 с.
5. Нельсон Д., Кокс М. Основы биохимии Ленинджера: пер с англ. в 3 т. М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, Т. 2, 2014. 636 с.
6. Буеверов A.O. Аммиак как нейро- и гепатотоксин: клинические аспекты // Медицинский совет. 2015. № 13. С. 80-84.
7. Степанов Е.В. Диодная лазерная спектроскопия и анализ молекул-биомаркеров. М.: ФИЗМАТЛИТ, 2009. 416 c.
8. Diskin A., Spanel P., Smith D. Time variation of ammonia, acetone, isoprene and ethanol in breath: a quan-tative SIFT-MS study over 30 days // Physiol. Meas. 2003. № 24. С. 107-20.
9. Shimamoto C., Hirata I., Katsu K. Breath and blood ammonia in liver cirrhosis // Hepatogastroenterology. 2000. № 47(32). С. 443-445.
10. Скрупский B.A. Эндогенные летучие соединения - биологические маркеры в физиологии и патологии человека и методы их определения: научно-технический отчет / Институт океанологии РАН. М., 1994. 75 с.
11. Narasimhan L.R., Goodman W., Patel C.K. Correlation of breath ammonia with blood urea nitrogen and creatinine during hemodialysis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. № 98(8). Р. 4617-4621.
12. Hibbard T., Crowley K., Kelly F. [et al.]. Point of care monitoring of hemodialysis patients with a breath ammonia measurement device based on printed polyani-line nanoparticle sensors // Anal Chem. 2013. № 85(24). Р. 12158-12165.
13. Neri G., Lacquaniti A., Rizzo G. [et al.]. Real-time monitoring of breath ammonia during haemodialysis: use of ion mobility spectrometry (IMS) and cavity ring-down spectroscopy (CRDS) techniques // Nephrol. Dial. Transplant. 2012 № 27(7). Р. 2945-2952.
14. Hibbard T., Crowley K., Killard A.J. Direct measurement of ammonia in simulated human breath using an inkjet-printed polyaniline nanoparticle sensor // Analytica Chimica Acta. 2013. V. 79. P. 56-63.
15. Прибор AmBeR: сенсорная система, применение и публикации, http://www.breathdx.com, (дата обращения - 24.11.2015)
16. Feasibility study of breath ammonia device to manage children with urea cycle defects(AmBeR). Industry collaboration. URL: http://www.uhbristol.nhs.uk/ media/2361581/feasibility_study_of_breath_ammonia_
device_to_manage_children_with_urea_cycle_defects_
amber_._industry_collaboration.pdf (дата обращения -24.11.2015)
17. Helicobacter pylori. Basic Mechanisms to clinical Cure 2000 / Ed. by R. Hunt, G. Tytgat. Dordrecht/Boston/London : Kluwer Academic Publisher, 2000. 689 p.
18. Holton J., Figura N., Vaira B. Helicobacter pylori. An Atlas of Investigation and Management. Oxford : Clinical Publishing, 2012. 152 p.
19. Рапопорт С.И., Шубина Н.А. 13С-дыхательный тест - возможности и ограничения в диагностике заболеваний органов пищеварения. М.: ООО «Медицинское информационное агентство», 2014. 240 с.
20. Быков А.С., Быков С.Э., Барышникова Н.В., Гинак А.И. Модель транспорта аммиака из желудка в ротовую полость при гидролизе карбамида в присутствии гастральной уреазы // Практическая медицина. 2014. № 1(77). С. 133-137.
21. Lee O.J., Lee E.J., Kim H.J. Correlations among gastric juice pH and ammonia, Helicobacter pylori infection and gastric mucosal histology // Korean J. Intern. Med. 2004. № 19(4). Р. 205-212.
22. Neumann H., Foertsch S., Vieth M., [et al.]. Immediate detection of Helicobacter infection with a novel electrochemical system: feasibility and comparison of diagnostic yield with immunohistochemistry, 13C urea breath test and Helicobacter urease test // Gastroenterology. 2010. № 138(Suppl 1). S114.
23. Корниенко Е.А., Милейко В.Е. Способ неинвазивной диагностики хеликобактериоза ин виво: пат. 2100010 Рос. Федерация. № 96103341; заявл. 20.02.96; опубл. 27.12.97.
24. Золотое Ю.А., Иванов В.М., Амелин В.Г. Химические тест-методы анализа. М.: Едиториал УРСС, 2006. 304 с.
25. Корниенко Е.А., Дмитриенко М.А., Дмитриенко В.С. [и др.]. Устройство для проведения диагностирования заболевания человека по составу воздуха ротовой полости : пат. на полезную модель 36615 Рос. Федерация. № 2003133838; заявл.18.11.03; опубл. 20.03.2004.
26. BS EN ISO 18153:2003 In vitro diagnostic medical devices. Measurement of quantities in biological samples. Metrological traceability of values for catalytic concentration of enzymes assigned to calibrators and control materials.
27. ISO/TS 17822-1:2014(en) In vitro diagnostic test systems — Qualitative nucleic acid-based in vitro
examination procedures for detection and identification of microbial pathogens.
28. Методические рекомендации по порядку проведения экспертизы качества, эффективности и безопасности медицинских изделий. URL: http://www.roszdravnadzor.ru/i/upload/ images/2015/4/29/1430321713.53455-1-4501.pdf (дата обращения 08.11.2015г.)
29. Васильев А.Ю., Малый А.Ю., Серова Н.С. Анализ данных лучевых методов исследования на основе принципов доказательной медицины : уч. пособие М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008. 32 c.
30. Платонов А.Е. Статистический анализ в медицине и биологии: задачи, терминология, логика, компьютерные методы. М.: РАМН, 2000. 52 с.
31. Флетчер Р., Флетчер С., Вагнер Э. Клиническая эпидемиология: Основы доказательной медицины: пер. с англ. М.: МедиаСфера, 1998. 352 с.
32. Корниенко Е.А., Милейко В.Е., Самокиш В.А., Нажиганов О.Н. Неинвазивные методы диагностики Helicobacter pylori // Педиатрия. 1999. № 1. С. 37-40.
33. Харченко Н.В., Лопух И.Я. Оценка диагностической надежности «ХЕЛИК-теста» для определения инфекции Helicobacter pylori // Рос. журн. гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. Материалы XIV Российской Гастроэнтерологической недели. 2008. № 5. С. 185.
34. Konorev M.R., Komleva E.N., Matveenko M.E. Evaluation of efficiency of HELIC ammonia breth test for diagnostics of H.Pylori infection in stomach in rheumatoidartri-tis patients taking NSAIDS // Helicobacter. 2014. V. 19 (S.1). Р.123.
35. Baryshnikova N.V., Belousova L.N., Loeva I.A. [et al.]. Comparative Analysis of efficacy of noninvasive ammoni-
um "HELIC-test" and histological method in diagnostic of Helicobacter pylori infection // Helicobacter. 2014. V. 19 (S.1). Р. 122.
36. Успенский Ю.П., Барышникова Н.В., Орлов О.Ю., [идр.]. Дыхательный аммонийный тест в диагностике инфекции Helicobacter pylori: преимущества и недостатки // Дневник Казанской медицинской школы. URL: http:// www.dkmsc.ru/gastroenterologiya/item/48-dy-hatel-ny-i-am-monii-ny-i-test-v-diagnostike-infektcii-helicobacter-pylori-pre-imushchestva-i-nedostatki (дата обращения 08.11.2015г.)
37. Сарсенбаева А.С., Захарова Н.А. Оптимизация диагностики клинически латентных форм язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки у пациентов, состоящих на диспансерном учете // Фундаментальные исследования. 2011. № 2. С. 147-151.
38. ЛазебникЛ.Б., Рустамов М.Н. Использование неинвазивного дыхательного ХЕЛИК-теста в диагностике инфекции Helicobacter pylori // Клиническая и экспериментальная гастроэнтерология. 2013. № 10. С. 38-39.
39. Леонтьева Н.И. Клинико-патогенетические аспекты хеликобактериоза, диагностика и тактика лечения: дис. ... д-ра мед. наук. М.: МНИИЭМ им.Г.Н.Габричевского, . 2012. 282 с.
40. Конорев М.Р., Комлева Е.Н., Кухарев А.В. [и др.]. Оценка эффективности аммиачного дыхательного теста ХЕЛИК для диагностики Helicobacter pylori в желудке и некоторые ошибки при проведении исследования // Практическая медицина. 2015. № 5(90). С. 202-208.
41. Uotani T., Graham D. Diagnosis of Helicobacter pylori using the rapid urease test // Ann. Transl. Med. 2015. № 2(1). P. 9.
42. Хомерики С.Г., Касьяненко В.И. Лабораторная диагностика инфекции Helicobacter pylori. СПб.: ООО «АМА», 2011. 110 с.
