CC BY
65УДК 582.282.123.4:615.015.8:615.282
АМИНОКИСЛОТНЫЙ ПОЛИМОРФИЗМ CYP51A ГРИБОВ РОДА ASPERGILLUS, АССОЦИИРОВАННЫЙ С ФОРМИРОВАНИЕМ РЕЗИСТЕНТНОСТИ К АЗОЛАМ
1Тараскина А.Е. (зав. лаб.)*, 2Латыпова Е.М. (н.с.), 1Пчелин И.М. (н.с.), 1Богомолова Т.С. (зав. лаб.), 1Выборнова И.В. (н.с.), 1Игнатьева С.М. (в.н.с.), 1Спиридонова В.А. (н.с.), 1Учеваткина А.Е. (с.н.с.), 1Филиппова Л.В. (с.н.с.), 1Фролова Е.В. (зав. лаб.), 1Васильева Н.В. (директор института, зав. кафедрой)
Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова: НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина и кафедра медицинской микробиологии, Санкт-Петербург; 2 Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова Национального исследовательского центра «Курчатовский институт», Гатчина, Ленинградская область
Изменение аминокислотной структуры фермента семейства цитохром P450 ланостерол 14 альфа-деметилазы (Cyp51), зашифрованное в первичной структуре гена, - ключевой механизм формирования резистентности к препаратам азолового ряда у грибов рода Aspergillus. В то время как для A. fumigatus определенно известны однонуклеотидные генетические вариации CYP51A, приводящие к аминокислоным заменам, ассоциированным с нарушением связывания фермента с антимикотиком и формированием у микромицета резистентности к терапии, их роль у видов Aspergillus non-fumigatus в адаптации к действию азолов плохо изучена.
В ходе нашего исследования мы изучили аминокислотный полиморфизм белка Cyp51A, ассоциированный с нуклеотидными вариациями гена, резистентных к азолам штаммов A. flavus, A. niger, A. terreus, выделенных на территории РФ, и белковых последовательностей, депонированных в базу данных NCBI Protein. Установлено, что у клинических изолятов A. flavus аминокислотная замена А205Т гена CYP51A ассоциируется с формированием резистентности к азолам, но не является доминирующим механизмом формирования резистентности; аминокислотные замены Cyp51A A. niger не ассоциируются с формированием резистентности к азолам. Нами впервые идентифицирован множественный аминокислотный полиморфизм у A. terreus и Т57А у резистентных к азолам штаммов A. niger, но определение их роли требует дальнейшего изучения. На основании литературных данных предполагаем, что аминокислотный полиморфизм паралога Сур51С может быть независимым механизмом адаптации к действию азольных препаратов у некоторых Aspergillus non-fumigatus.
Ключевые слова: грибы рода Aspergillus, резистентность к анти-микотикам, триазолы, аминокислотный полиморфизм, ланостерол 14 альфа-деметилаза, Cyp51A
AMINO ACID CYP51A POLYMORPHISM ASSOCIATED WITH AZOLE RESISTANCE OF FUNGI FROM THE GENUS ASPERGILLUS
1Taraskina A.E. (head of the laboratory), 2Latypova E.M. (scientific collaborator), 1Pchelin I.M. (scientific
Контактное лицо: Тараскина Анастасия Евгеньевна, e-mail: [email protected]
collaborator), 1Bogomolova T.S. (head of the laboratory), 1Vybornova I.V. (scientific collaborator), 1Ignatieva S.M. (leading scientific collaborator), 1Spiridonova V.A. (scientific collaborator), 1Uchevatkina A.E. (senior scientific collaborator), 1Filippova L.V. (senior scientific collaborator), 1Frolova E.V. (head of the laboratory), 1Vasilyeva N.V. (director of the institute, head of the department) 1North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov: Kashkin Research Institute of Medical Mycology and Department of Medical Microbiology, St. Petersburg; Petersburg Nuclear Physics Institute named by B.P. Konstantinov of National Research Centre «Kurchatov Institute», Leningrad district, Gatchina
Amino acid sequence polymorphism of cytochrome P450 family member enzyme lanosterol 14 alpha-demethylase (Cyp51), driven by nucleotide substitutions, is a key mechanism for the formation of resistance to the azole drug in Aspergillus fungi. At a time when A. fumigatus definitely has single nucleotide genetic variations, CYP51A, which leads to impaired binding of the enzyme to antimycotic compounds and results in acquired drug resistance in microscopic fungi, recalcitrance to therapy. However, their role in adaptation of Aspergillus non-fumigatus species to selective pressure of azoles remains understudied.
We studied amino acid polymorphism of Cyp51A protein, associated with nucleotide sequence variation of the gene, in azole-resistant strains of A. flavus, A. niger, A. terreus from the Russian Federation, and protein sequences deposited in the NCBI Protein database. It was found that in clinical isolates of A. flavus, the A205T substitution in CYP51A gene is associated with the resistance to azole antifungals, but is not the dominant mechanism of acquired resistance. Amino acid substitutions in Cyp51A of A. niger is not associated with acquired azole resistance. We were the first to identify multiple amino acid substitutions protein-molecular polymorphism in A. terreus and T57A in azole-resistant A. niger strains, but the determination of their role requires further study. Based on literature data, it can be assumed that the Cyp51Cparalog polymorphism protein may be an independent mechanism of adaptation to the action of azole drugs in some Aspergillus non-fumigatus.
Key words: Aspergillus fungi, antimycotic drug resistance, triazole, amino acid polymorphism, sterol 14 a-demethylase, Cyp51A
ВВЕДЕНИЕ
Грибы рода Aspergillus широко распространены в природе. В настоящее время род организован в несколько подродов и секций, включая в себя более 300 различных видов. Aspergillus spp. имеют важное значение в процессах жизнедеятельности человека: как положительное (задействованы в биотехнологических процессах производства ферментативных препаратов, медикаментов, лимонной кислоты и др.), так и негативное (могут приносить экономический урон как сельскохозяйственные вредители и создавать опасность для здоровья как оппортунистические патогены). Наибольшей клинической актуальностью обладают представители секций Fumigati, Flavi, Terrei и Nigri, способные вызывать различные инфекционные заболевания [1]. Грибы данного рода при снижении толерантности к антигенам могут усугублять аллергическое воспаление у больных бронхиальной астмой и тем самым инициировать развитие аллергического бронхолегоч-ного аспергиллеза (АБЛА), тогда как у иммунокомпро-метированных пациентов с гипоиммунным ответом способны вызывать угрожающее жизни заболевание -инвазивный аспергиллез легких (ИАЛ) [2-5]. Ежегодно во всем мире регистрируют около 200000 случаев ИАЛ, что составляет, по оценкам исследователей, приблизительно только половину фактических случаев инвазивного микоза, вызванного плесневыми грибами. Показатели летальности ИА в некоторых регионах варьируют от 50 до 100% из-за ошибок в диагностике и
Í--
назначении неправильных стратегий лечения [6].
Триазолы занимают ключевую позицию среди ан-тимикотиков: препаратом выбора для терапии ИАЛ является вориконазол, а лекарственным средством профилактики микозов у онкогематологических пациентов и при трансплантации стволовых клеток, наряду с вориконазолом, - позаконазол.
Действие азолов заключается в подавлении синтеза эргостерола - ключевого компонента клеточной мембраны гриба (аналога холестерина клеток животных) за счет связывания с ферментом семейства цитохром Р450 ланостерол 14 альфа-деметилазой (Сур51). Сур51 находится во внешней мембране эндоплазматическо-го ретикулума и катализирует биосинтез эргостерола. Рассматривают два механизма взаимодействия азолов с Сур51: либо путем неконкурентного связывания, которое приводит к деметилированию предшественника эргостерола и дальнейшему блокированию его синтеза, либо путем конкурентного связывания с железом гем-группы фермента. Так или иначе, происходит накопление метилированных в 14 позиции стеролов, которые, вызывая изменения в текучести мембраны, а затем ее разрушение, ингибируют рост и пролиферацию клеток гриба [7-9].
Для аспергиллов описаны две причины возникновения резистентности к азоловым препаратам: первая - мутагенез, индуцированный длительной терапией азолами пациентов с хроническим аспергиллезом легких; вторая - селекция азол-устойчивых изолятов и повсеместное их распространение в результате применения азольных фунгицидов в сельском хозяйстве в Европе (преимущественно в Нидерландах) и США,
включая цветоводство. Кроме того, с внедрением современных молекулярно-генетических подходов диагностики стали чаще идентифицировать новые крип-тические виды Aspergillus spp., которые обладают природной (первичной) резистентностью к азолам [10, 11].
Ключевые механизмы резистентности микроорганизмов к препаратам, ингибирующим рост клеток, представлены на рисунке 1 на примере Aspergillus fumigatus. Исторически изучали два фундаментальных аспекта, имеющих решающее значение для адаптации микромицета к азольному стрессу: снижение сродства к азолам фермента Cyp51 за счет полиморфных вариантов кодирующей области гена и изменение транскрипционной активности гена (его экспрессии) из-за генетических перестроек промотера.
В настоящее время молекулярные механизмы, влияющие на возникновение фенотипически устойчивых штаммов Aspergillus spp., подразделяют на следующие категории: (1) структурные изменения белка Cyp51, которые приводят к снижению его сродства с азолами; (2) повышенная экспрессия белка-мишени в клетке, требующая увеличения терапевтического уровня азо-лов; (3) увеличение функциональной активности систем клеточного эффлюкса, приводящее к снижению внутриклеточной концентрации препарата; (4) ферментативная деградация лекарственного препарата и (5) активация альтернативных путей действия препарата [1, 12].
С 1994 г. (с момента использования азолов в медицине) стали появляться данные об устойчивых к азо-лам изолятах A. fumigatus в клинической практике. В Нидерландах в период с 1994 по 2007 гг. отмечали рост
Рис. 1. Основные типы ключевых механизмов резистентности микромицетов к препаратам азолового ряда (модифицировано с Hagiwara et al., 2016). Примеры молекулярных механизмов, определенные у Aspergillus fumigatus,
приведены на рисунке в рамочке.
плесневых грибов А. fumigatus, резистентных к итра-коназолу, от 1,7% до 6%. Немного позже волна роста азол-резистентных клинических изолятов А. fumigatus захватила Великобританию: в 2004 г. их количество составило 5%, в 2008 - 14%, в 2009 - 20%. Затем резистентность А. fumigatus к азолам приобрела глобальное распространение, охватив подавляющее большинство развитых стран Европы (Австрию, Бельгию, Данию, Францию, Германию, Ирландию, Италию, Польшу, Португалию, Испанию, Швецию и Турцию) [13, 14], а также Канаду, Соединенные штаты Америки, Индию, Китай, Корею [15, 16], причем большая часть азол-ре-зистентных изолятов обладала перекрестной устойчивостью к вориконазолу и позаконазолу.
Спектр модификаций СУР51А, ассоциированных с формированием пан-резистентного фенотипа изолятов А. fumigatus, включает тандемные повторы промоторной области гена в сочетании с точечными мутациями кодирующей области. Наиболее распространенная комбинация модификаций, приводящая к повышенной экспрессии гена, которая ассоциирована с пан-резистентностью к азолам, представляет тандемный повтор 34 пары оснований (п.о.) (TR34) промотора СУР51А, сцепленный с заменой в 98 позиции лейцина на гистидин (TR34 / L98H). Следующие по частоте встречаемости генетические перестройки, ассоциированные с формированием резистентности к вориконазолу, составляют комбинацию тандемного повтора в 46 п.о. промоторной области СУР51А и две однонуклеотидные замены: в позиции 121 тирозина на фенилаланина и в позиции 289 треонин на аланин ^46 / У12№ / Т289А) [12, 14].
Подобные механизмы формирования резистентности к азолам ^34 / L98H или TR46 / У12№ / Т289А) были описаны как для природных, так и для клинических изолятов А. fumigatus. Генетическое сходство азол-резистентных изолятов А. fumigatus, выделенных из разных источников, предполагает или общее экологическое происхождение, или общий механизм образования, так как азольные фунгициды (пенконазол, дифеноконазол, тетраконазол и тебуконазол) имеют химическое сходство с лекарственными препаратами азольного ряда [8]. Отметим, что уровень летальности (88%) значительно выше у пациентов с ИАЛ, вызванным устойчивыми к противогрибковой терапии изо-лятами, несущими комбинацию генетических вариантов TR34 / L98H или TR46 / У12№ / Т289А, по сравнению с показателями летальности (30-50%) больных с аспергиллезной инфекцией, этиологическими агентами которой являлись изоляты дикого типа [14].
Независимым механизмом формирования устойчивости к азолам у А. fumigatus является приобретение несинонимичных мутаций в кодирующей области СУР51А, влияющих на аффинитет препарата к ферменту-мишени. Замена глицина в 54 и 138 позициях ^54, G138) ассоциировалась с формированием резистентности к итраконазолу и позаконазолу, в то время как резистентность к вориконазолу коррелировала с наличием мутации G448S. Аминокислотная замена 220 ме-тионина (М220) в белковой последовательности также приводила к проявлению пониженной чувствительности к триазолам. Причем точечные мутации G54E/R/V и M220I/V/T/K СУР51А преимущественно были зарегистрированы у пациентов, получающих длительную
терапию азолами (в течение примерно 4 месяцев) в случаях хронического аспергиллеза. Отметим, что изоляты A. fumigatus с мутацией G54, кроме клинического происхождения, были выделены из окружающей среды в Индии, Танзании, Румынии и Германии. В научной литературе встречаются и другие точечные генетические варианты P216L, F219C, F219I, A284T, Y431C, G432S и G434C, ассоциированные с формированием устойчивости, при этом такие полиморфные варианты, как F46Y, M172V, N248T, D255E и E427K были идентифицированы и в устойчивых, и в чувствительных к азолам штаммах [12, 14].
Использование противогрибковой профилактики у онкогематологических пациентов и при трансплантации стволовых клеток снизило частоту возникновения ИАЛ, но изменило баланс заболеваемости ИМ, вызванных нитчатыми патогенами, в сторону Aspergillus non-fumigatus [11], вследствие чего в клинической практике стали приобретать все большую актуальность представители секций Flavi, Terrei и Nigri, являющиеся вторыми по распространенности этиологическими агентами ИАЛ.
В России резистентность к препаратам азолового ряда среди грибов Aspergillus spp. встречается пока достаточно редко (3-6%) и затрагивает исключительно клинические изоляты Aspergillus non-fumigatus. В настоящее время в РФ не зарегистрировано ни одного случая выделения клинического изолята A. fumigatus с мутациями TR34 / L98H или TR46 / Y121F / T289A, которые преобладают среди азол-резистентных представителей рода по всему миру [13]. Аминокислотный полиморфизм Cyp51A, ассоциированный с формированием резистентности к азолам, у видов Aspergillus non-fumigatus, изучен значительно хуже. Таким образом, понимание молекулярных механизмов формирования резистентности к триазолам данных этиологических агентов поможет как своевременно достоверно определять чувствительность микромицета к предполагаемой антимикотической терапии, так и способствовать разработке альтернативных противогрибковых препаратов.
Цель данной работы заключалась в изучении генетического полиморфизма CYP51A, влияющего на аминокислотную структуру белка, ассоциированного с формированием резистентности видов Aspergillus non-fumigatus (A. flavus, A. niger, A. terreus), у клинических изолятов, выделенных на территории РФ, и метаданных базы данных Национального центра биотехнологической информации США (NCBI).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Характеристика клинических изолятов Aspergillus spp., включенных в анализ.
Для молекулярно-генетического анализа нуклео-тидной последовательности гена CYP51A были взяты 5 резистентных к азолам клинических изолятов грибов рода Aspergillus spp.: A. terreus и A. flavus были резистентны к вориконазолу, A. niger и A. flavus - к кетоко-назолу, A. flavus обладали мультирезистентностью (во-риконазол, итраконазол), а также 6 штаммов Aspergillus spp. соответствующих видов из Российской коллекции патогенных грибов (РКПГ), чувствительных к азолам (табл. 1). Видовая принадлежность подтверждена методом секвенирования региона ITS (протокол CLSI
M18). Чувствительность к противогрибковым препаратам определена методом серийных разведений (EUCAST - The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing).
Таблица 1
Клинические изоляты Aspergillus spp., включенные в исследование
Клинический иэоляг Видоили идентификация Устойчивость к
Ch №1 A.tcrreus VRC
RCPF-111Í67 A.terreus 5
Кг №2 A. flav us VRC. ITR
Pav №3 A. flatus KTZ
RCPF-13B2Í800 A.fíavtis VRC
RCPF-1247Í1094 A. Fla v us S
Ваг №4 A.niger KTZ
RCPF-1249/B00-2 A.niger s
RCPF-1345 A.niger (id
Ког №5 A.calidoustus VRC, ITR
RCPF-11/266 A.calidoustus nd
ITC - итраконазол; VRC - вориконазол; KTZ - кетоконазол;
S - чувствительный штамм; ND - не определена.
Определение нуклеотидной последовательности гена CYP51A, кодирующего 14-альфа ланостерол де-метилазу.
Была проанализирована полная последовательность гена cyp51A, включая промотерную область, ам-плифицированная с помощью праймеров, подобранных к последовательностям референтных штаммов. Дизайн посадки праймеров представлен на рисунке 2, структура - в таблице 2.
Для проведения ПЦР использовали стандартные реагенты фирмы Синтол (Россия). Амплификацию гена CYP51A Aspergillus spp. проводили по следующей программе: предварительный нагрев - 95 °С 5 мин; 35 цикла: 95 °С 30 сек, 57 °С 45 сек, 72 °С 1 мин; и конечный этап элонгации - 72 °С 10 мин. Продукты ПЦР очищали на колонках Centri-Sep columns (Princeton Separations, США). Секвенирование осуществляли с применением набора реагентов BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США) на приборе ABI PRISM 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Hitachi, Япония). Нуклеотидные последовательности CYP51A клинических изолятов Aspergillus spp. были выровнены с референсной последовательностью из базы данных GenBank (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Затем нуклеотидные последовательности были транслированы и выровнены для анализа аминокислотной последовательности с использованием программы Variant Reporter ver. 1.1.
Рис. 2. Дизайн проведения анализа нуклеотидного полиморфизма гена CYP51A грибов рода Aspergillus.
Таблица 2.
Название Последовательность (5'-3') направление Размер фрагмента
Asperqillus flavus
AFI001 GACTAGGACAAGAACAACCTAG F амплификация/ секвенирование cvp51A 2140п.о./ 001-004 930 п.о.
AFI002 GACTGCTTTCATGGAACAGATC R
AFI003 TAAGACTGATCCACCCCTTG F секвенирование cyp51A 003-005 1023п.о.
AFI004 GGACAATCATACACAATGTCGG R
AFI005 CCTTGATGAGATTTTGATGAAGGG F 005-002 802 п.о.
AFI006 CATGATCTGGAACCTCATGC R
Aspergillus niger
AN001 TGTCTAGAGTCCAGTTGACTG F амплификация/ секвенирование сур51А 2279п.о./ 001-004 926 п.о.
AN002 CTTTGGCTATGGACTGAATGC R
AN003 CATTACTTGCTGTCGCAGGC F секвенирование сур51А 003-005 942 п.о.
AN004 GTTTGCCATTGAGGATGAAATCG R
AN005 GCTCGGATGAGAGAAATCTAC F 005-002 937 п.о.
AN006 TCGAAGAAGACGAGTGTTGC R
Aspergillus terreus
AT001 GGTTTACTGGATTGCGAAAGG F амплификация/ секвенирование сур51А 2211п.о./ 001-004 856 п.о.
AT002 GACTGAGTCTACCTATCATGC R
AT003 CGATCCGTATGCTTTCTTTGC F секвенирование сур51А 003-005 863 п.о.
AT004 GTTGACGTCTTTGAGTTTGCC R
AT005 CATGATCTGGAACCTCATGC F 005-002 864 п.о.
AT006 ACCTGTTCCTGGTAGAGCTC R
Анализ аминокислотного полиморфизма Cyp51A (по метаданным базы Национального центра биотехнологической информации США, NCBI)
Анализ аминокислотных замен Cyp51A был параллельно проведен на депонированных последовательностях базы данных Национального центра биотехнологической информации США (NCBI) NCBI Protein
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/). Для извлечения информации из базы данных было произведено три текстовых поиска по ключевым словам «Aspergillus flavus Cyp51A», «Aspergillus niger Cyp51A», «Aspergillus terreus Cyp51A», в результате которых было получено 5, 38 и 2 последовательности соответственно. Выборки были дополнены оригинальными аминокислотными последовательностями и проанализированы в Mega 5.2 [17].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Изменение аминокислотной структуры Cyp51, зашифрованное в первичной структуре гена, - ключевой механизм формирования резистентности к препаратам азолового ряда у подавляющего большинства медицински значимых микромицетов. При приобретении микромицетом резистентности к азолам генетические модификации происходят в триплетах нуклеотидов, кодирующих аминокислоты, потенциально участвующие в связывании с лекарственным препаратом, уменьшая сродство фермента к антими-котику, но не затрагивают область генов, влияющих на функциональную активность Cyp51. Однонуклео-тидные генетические вариации CYP51A, приводящие к аминокислотным заменам, рассматривают в настоящее время как основной механизм формирования резистентности к препаратам азолового ряда у грибов рода Aspergillus. Присутствие в геноме гриба таких мутаций может влиять на структуру, стабильность и функциональность Cyp51A, препятствуя тем самым связыванию с субстратом и формируя различные модели устойчивости к азолам.
В то время как определенно доказано, что одно-нуклеотидные генетические вариации CYP51A у A. fumigatus являются ключевым механизмом формирования резистентности, их роль у видов Aspergillus non-fumigatus в адаптации к действию азолов плохо исследована. В ходе нашей работы мы изучили аминокислотный полиморфизм белка Cyp51A, ассоциированный с нуклеотидными вариациями гена, в резистентных к азолам штаммах A. flavus, A. niger, A. terreus, представленных в РКПГ, и белковых последовательностей, депонированных в базу данных NCBI Protein (Рис. 3).
Рис. 3. Аминокислотный полиморфизм белка CYP51A, ассоциированный с формированием резистентности
к препаратам азольного ряда, грибов видов Aspergillus non-fumigatus. Темным цветом выделены аминокислотные замены, идентифицированные в ходе данного исследования таргетным секвенированием гена cyp51A клинических изолятов Aspergillus non-fumigatus, выделенных на территории РФ (некоторые полиморфные варианты определены впервые, некоторые совпадают с полученными ранее мировыми данными (объяснение в тексте)).
Наиболее изученным в аспекте азол-резистентно-сти после A. fumigatus, по литературным сведениям и данным базы NCBI Protein, является A. flavus, обладающий единственной доказанной аминокислотной заменой А205Т гена CYP51A, влияющей на адаптацию гриба к действию азолов. Данный аминокислотный полиморфизм присутствовал в двух изученных нами изолятах A. flavus, выделенных на территории РФ, и был неоднократно описан в научной литературе [18, 19]. Но отметим, что замена в позиции 205 аланина на треонин является не единственным механизмом приобретения толерантности к азолам у данного вида Aspergillus, существует большое количество литературных данных, подтверждающих отсутствие мутаций в CYP51A у клинических штаммов, устойчивых к действию триазолов [20, 21].
По результатам нашего исследования и мировым данным, при изучении роли аминокислотного полиморфизма Cyp51A в формировании резистентности к азолам у грибов секции Nigri (в том числе A. niger) не получено однозначных показателей: полиморфные генетическими варианты CYP51A зачастую не ассоциировались с повышенными значениями MIC для азо-лов. Сообщалось, что мутации CYP51A у A. niger и A. tubingensis в основном указывают на сниженную восприимчивость к итраконазолу и/или вориконазолу. В ходе нашего исследования было просеквенировано три последовательности CYP51A клинических изо-лятов A. niger с различной чувствительностью к препаратам азольной группы (табл. 1). Аминокислотные замены Q228R и H506N присутствовали в геноме всех клинических изолятов, изученных в ходе данной работы, не зависимо от чувствительности микромицета к антимикотикам, тогда как аминокислотный полиморфизм Т57А был идентифицирован только у резистентных к азолам штаммов. Отметим, что аминокислотная замена Q228R ранее была ассоциирована с формированием резистентности [22], но полученные нами показатели ставят этот факт под сомнение. Т57А описан нами впервые, и доказательство его вовлечения в механизм резистентности у грибов A. niger требует дополнительных исследований.
При анализе нуклеотидных последовательностей гена CYP51A грибов видов Aspergillus non-fumigatus наибольшим нуклеотидным полиморфизмом обладал клинический изолят A. terreus, устойчивый к азолам: в ходе изучения были выявлены следующие аминокислотные замены - S8T, L26F, K64R, Q270R, V336A, Q419H, A478F, по сравнению с чувствительными штаммами и типовой последовательностью гена базы NCBI. Исследования механизмов резистентности к азолам грибов A. terreus скудны, и на сегодняшний день описана только одна аминокислотная замена CYP51A - M217, которая оказывает потенциальное влияние на чувствительность микромицета к итрако-назолу и позаконазолу. В отношении A. terreus больше изучены механизмы формирования резистентности к
амфотерицину В [10].
Недавно (в 2010 г.) было показано, что у многих нитчатых аскомицетов происходит дупликация гена CYP51, в том числе и у Aspergillus spp., которые имеют межвидовое различие в количестве паралогов CYP51, расположенных на разных хромосомах. В состав генома некоторых видов, таких как A. fumigatus, A. nidulans и A. niger, входит два паралога (CYP51A и CYP51B), других - A. flavus и A. oryzae - три паралога (CYP51A, CYP51B и CYP51C). Кроме того, A. terreus и критические виды (A. carbonarius) секции Nigri, по-видимому, также содержат три паралога Cyp51, о которых в настоящее время нет достоверных сведений (номера доступа этих белков - XP_001218650 и OOF93749 соответственно) [1].
Паралоги Cyp51 имеют общее происхождение, а потом эволюционную дифференциацию в две линии паралогичных белков (Cyp51A и Cyp51B). Третья линия (Cyp51C), по-видимому, может происходить от дублирования как гена CYP51A, так и CYP51B в зависимости от вида. Некоторые исследователи предполагают, что эволюционные механизмы адаптации гриба к воздействию азолов и дубликации CYP51 - единые, поскольку дупликация генов обладает большим адаптивным потенциалом. Предполагают, что штаммы с двумя или более копиями гена будут иметь большую толерантность к воздействию азолов по сравнению со штаммами с одной копией гена. Однако эта гипотеза пока не имеет экспериментального подтверждения.
Функциональный анализ показал, что все паралоги фермента имеют один и тот же субстрат и сопоставимые функции. Полагают, что Cyp51A и Cyp51B работают в компенсаторной манере при синтезе эргостерола, и только одновременный нокаут CYP51A и CYP51B приводит к гибели гриба. Интересно, что нокаут CYP51A приводит к повышению чувствительности к азолам, не влияя на уровень экспрессии CYP51B.
На основании анализа всех данных о функциональной роли генов паралогов Cyp51 предполагают, что CYP51A (или CYP51C - у некоторых видов) кодирует основную ферментативную активность и играет роль в адаптации к действию азольных препаратов, тогда
как CYP51B представляет собой функционально избыточный фермент, который может иметь потенциально альтернативные функции, которые еще предстоит определить.
По всей видимости, у большинства видов Aspergillus non-fumigatus паралоги Cyp51 могут играть ключевую роль в формировании резистентности. У A. flavus па-ралог Cyp51C, ответственный у данного вида за основную ферментативную активность, наиболее полиморфен по сравнению с Cyp51A и Cyp51B. Определенно доказано влияние аминокислотных замен S240A, Y319H и комбинации S196F/A324P/N423D/V465M в белке Cyp51C A. flavus на чувствительность микромицета к вориконазолу [18, 20, 21]. Также для A. flavus показан новый механизм резистентности к азолам, не зависящий от полиморфных генетических вариантов CYP51: мутация гена yap1 транкскрипционного фактора bZIP - регулятора ответа на оксидативный стресс [23].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, аминокислотная замена А205Т гена CYP51A ассоциируется с формированием резистентности к азолам у клинических изолятов A. flavus, но не является доминирующим механизмом. По всей видимости, аминокислотный полиморфизм паралога Cyp51C играет ключевую роль в адаптации к действию азольных препаратов у данного вида.
На основании полученных данных можно предположить, что аминокислотные замены Cyp51A не ассоциируются с формированием резистентности к азолам грибов секции Nigri (в том числе A. niger). Нами впервые идентифицирован аминокислотный полиморфизм Т57А у резистентных к азолам штаммов A. niger.
Отметим, что данные о механизмах резистентности к азолам у A. terreus практически отсутствуют. Результаты секвенирования показали, что CYP51A A. terreus обладает большим полиморфизмом, что требует дальнейшего изучения.
Данные, полученные в ходе исследования моле-кулярно-генетических механизмов резистентности Aspergillus spp., могут быть использованы для разработки тест-системы для быстрого и точного определения чувствительности грибов к антимикотикам.
ЛИТЕРАТУРА
1. Perez-Cantero A., Lopez-Fernandez L., Guarro-Artigas J., Capilla J. Update and recent advances on azole resistance mechanisms in Aspergillus. International Journal of Antimicrobial Agents. 2019. pii: S0924-8579(19)30254-7. [Epub ahead of print]
2. Zelante T., Pieraccini G., Scaringi L., et al. Learning from other diseases: protection and pathology in chronic fungal infections. SeminImmunopathol. 2016; 38: 239-248.
3. Dewi I.M., van de Veerdonk F.L., Gresnigt M.S. The multifaceted role of T-helper responses in host defense against Aspergillus fumigatus. J. Fungi (Basel). 2017; 3 (4): E55.
4. de Araujo E.F., Feriotti C., de Lima Galdino N.A., et al. The IDO-AhR axis controls Th17/Treg immunity in a pulmonary model of fungal infection. Front. Immunol. 2017; 8: 1-15.
5. Choera T., Zelante T., Romani L., Keller N.P. A multifaceted role of tryptophan metabolism and indoleamine 2,3-dioxygenase activity in Aspergillus fumigatus - host interactions. Front. Immunol. 2018; 8: 1-11.
6. Brown G.D., Denning D.W., Gow N.A.,et.al. Hidden killers: human fungal infections. Sci. Transl. Med. 2012; 4 (165): 1-9.
7. Parker J.E., Warrilow A.G.S., Price C.L., et.al. Resistance to antifungals that target CYP51. J. Chem. Biol. 2014; 7: 143-161.
8. Dudakova A., Spiess B., Tangwattanachuleeporn M., et.al. Molecular tools for the detection and deduction of azole antifungal drug resistance phenotypes in Aspergillus species. Clinical Microbiology Reviews. 2017; 30: 1065-1091.
9. Zhang J., Li L., Lv Q., et.al. The fungal CYP51s: their functions, structures, related drug resistance, and inhibitors. Frontiers in Microbiology. 2019; 10: 691.
10. Shahandashti R.V., Lass-Florl C. Antifungal resistance in Aspergillus terreus: A current scenario. Fungal Genetics and Biology. 2019; 131: 103247.
11. Friedman D.Z.P., Schwartz I.S. Emerging fungal infections: new patients, new patterns, and new pathogens. Journal of Fungi. 2019; 5: 67.
12. Hagiwara D., Watanabe A., Kamei K., Goldman G.H. Epidemiological and genomic landscape of azole resistance mechanisms in Aspergillus fungi. Frontiers in Microbiology. 2016; 17: 1362.
13. Van der Linden J. W.M., Arendrup M.C., Warris A., et.al. Prospective multicenter international surveillance of azole resistance in Aspergillus fumigatus. Emerging Infectious Diseases. 2015; 21(6): 1041-1044.
14. Chowdhary A., Sharma C., Meis J.F. Azole-resistant aspergillosis: epidemiology, molecular mechanisms, and treatment. The Journal of Infectious Diseases. 2017; 216 (Suppl.3): S436-S444.
15. Denning DW, Bowyer P. Voriconazole resistance in Aspergillus fumigatus: should we be concerned? Clin. Infect. Dis. 2013; 57(4): 521-3.
16. Cho S-Y., Lee D.-G., Kim W.-B., et.al. Epidemiology and antifungal susceptibility profile of Aspergillus species: comparison between environmental and clinical isolates from patients with hematologic malignancies. Journal of Clinical Microbiology. 2019; 57 (Is.7): e02023-18
17. Tamura K, Stecher G, Peterson D, et.al. MEGA6: molecular evolutionary genetics analysis version 6.0. Mol. Biol. Evol. 2013; 30(12): 2725-2729.
18. Paul R.A., Rudramurthy S.M., Meis J.F., et.al. A novel Y315H substitution in CYP51C associated with azole resistance in Aspergillus flavus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2015; 59 (10): 6615-6619.
19. Sharma C., Kumar R., Kumar N., et.al. Investigation of multiple resistance mechanisms in voriconazole-resistant Aspergillus flavus clinical isolates from a chest hospital surveillance in Delhi, India. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2018; 62 (Is.3): e01928-17.
20. Choi M.J., Won E.J., Joo M.Y., et.al. Microsatellite typing and resistance mechanism analysis of voriconazole-resistant Aspergillus flavus isolates in South Korean Hospitals. Agents and Chemotherapy. 2019; 63 (Is.2): e01610-18.
21. Rudramurthy S.M., Paul R.A., Chakrabarti A., et.al. Invasive aspergillosis by Aspergillus flavus: epidemiology, diagnosis, antifungal resistance, and management. Journal of Fungi. 2019; 5: 55.
22. Iatta R., Nuccio F., Immediato D., et.al. Species distribution and in vitro azole susceptibility of Aspergillus section Nigri isolates from clinical and environmental settings. Journal of Clinical Microbiology. 2016; 54 (9): 2365-2372.
23. Ukai Y., Kuroiwa M., Kurihara N., et.al. Contributions of yapl mutation and subsequent atrF upregulation to voriconazole resistance in Aspergillus flavus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2018; 62 (Is.11): e01216-18.
Поступила в редакцию журнала 03.10.19
Рецензент: А.Е. Гончаров
