CC BY
29
АЛЬТЕРНАТИВНЫЕ ФОРМЫ мРНК АЛЬФА-ЦЕПИ РЕЦЕПТОРА ИНТЕРЛЕЙКИНА-2 (CD25) И ЕГО СЫВОРОТОЧНЫЙ УРОВЕНЬ У БОЛЬНЫХ РАКОМ ПОЧКИ
© Гуррам Н.*, Хаффарессас Я.*, Новиков Д.В., Преснякова Н.Б., Алясова А.В., Новиков В.В.
НИИ молекулярной биологии и региональной экологии ННГУ им. Н.И. Лобачевского, г. Нижний Новгород Нижегородская государственная медицинская академия
Минздравсоцразвития, г. Нижний Новгород Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. акад. И.Н. Блохиной Роспотребнадзора, г. Нижний Новгород
Впервые показано, что при раке почки в опухолевых очагах и периферической крови больных обнаруживаются полноразмерная и две альтернативные формы мРНК гена IL-2RA. Увеличение разнообразия этих форм мРНК в опухолевых очагах больных раком почки сопровождается повышением сывороточного уровня растворимой IL-2RA, что, по-видимому, является проявлением неодинаковой модуляции иммунных процессов разными формами IL-2RA. Обнаружено, что концентрация sCD25 в сыворотке крови увеличивается, а количество пациентов, имеющих альтернативные формы IL-2RA. уменьшается при увеличении стадии заболевания.
Ключевые слова мРНК, альфа-цепь рецептора интерлейкина-2, CD25 антиген, рак почки.
Известно, что взаимодействие клеток иммунной системы между собой осуществляется как за счет непосредственных межклеточных контактов, так и путем секреции множества растворимых белковых факторов, называемых лимфокинами [1]. Одним из наиболее важных и хорошо изученных лимфо-кинов, участвующих в процессе развития и усиления иммунного ответа, является интерлейкин-2 (IL-2). Он представляет собой цитокин, взаймодейст-вующий в первую очередь с Т-клетками, В-клетками и естественными киллерами. Связывание IL-2 с его рецептором приводит к пролиферации Т-кле-ток, повышению цитолитических функции естественных киллеров, а также увеличению выработки антител В-клетками [2]. Рецептор IL-2 это тример-ный белок состоящий из трёх субъединиц: IL-2Ra, IL-2RP, и IL-2Ry. Наибольшим сродством к IL-2 обладает комплекс всех трёх субъединиц, хотя связывать этот лиганд может как а субъединица (IL-2RA, IL-2Ra, CD25 антиген, белок p55, Tac антиген), так и комплекс в и у единиц (рис. 1).
* Аспирант кафедры Молекулярной биологии и иммунологии ННГУ им Н.И. Лобачевского.
* Магистрант кафедры Молекулярной биологии и иммунологии ННГУ им Н.И. Лобачевского.
Рис. 1. IL-2R обладающие высоким сродством, средним сродством и низким сродством связывания с лигандом [3]
IL-2R экспрессируется главным образом на поверхности активированных Т-лимфоцитов, и в меньшей степени на поверхности активированных B-клеток, естественных киллеров, моноцитов и эозинофилов. Он также обнаружен на злокачественно трансформированных клетках крови и на клетках солидных опухолей [4].
Известно, что при транскрипции одного и того гена за счет альтернативного сплайсинга при созревании мРНК и за счет посттрансляционных модификаций может образоваться несколько различных (альтернативных) видов мРНК. Для матричной РНК рецептора гена IL-2RA показано существование нескольких альтернативных форм. Две из них - форма с делецией экзона 4 (CD25Exo4Del), ответственного за связывание Ш-2 [5.6], и форма с делецией экзонов 4 и 5 (CD25Exo4-5Del) - кодируют рецептор не способный связывать лиганд. Изменение спектра альтернативных форм мРНК, кодирующих поверхностные антигены и в том числе альфа-цепь рецептора интерлейкина-2 (IL-2Ra, или CD25), влияет на активацию клеток иммунной системы [7].
Растворимая форма а-цепи рецептора интерлейкина-2 (sIL-2Ra или sCD25), соответствующая внеклеточной части молекулы, образуется путем протеолитического расщепления мембранной формы. Сывороточный уровень sIL-2R служит маркером активации Т-лимфоцитов- при высокой концентрации sIL-2R иммунные реакции, связанные с этими клетками, менее выражены [8].
В данной работе впервые рассмотрены патерны экспрессии IL-2RA у больных с разными стадиями рака почки. Предполагалось, что исследование набора мРНК, кодирующих полноразмерную и альтернативные формы ]Ь-2КЛ, в образцах периферической крови и опухолевых очагов больных
раком, определение растворимой формы IL-2RA в сыворотке крови, а также сопоставление параметров экспрессии IL-2RA со стадиями заболевания позволят выявить критерии, значимые для функциональной оценки состояния иммунной системы у больных раком почки.
Материалы и методы
Исследовано 64 образца периферической крови и опухолевых очагов и 50 образцов сыворотки крови больных раком почки (T1-4N0-2M0-2) проходивших лечение в Приволжском окружном медицинском центре, г. Нижний Новгород. Возраст больных находился в диапазоне от 34 до 72 лет, средний возраст составил 53 лет. Кровь для исследования забирали до хирургического вмешательства. В качестве контроля использовали 50 образцов периферической крови, полученных от здоровых волонтеров.
Нативную исследуемую ткань и кровь в соотношении 1: 1 смешивали с лизирующим буферным раствором, содержащим 4 М гуанидин-тиоцианат, 0.5 % Тритон Х-100, 25 мМ цитрата натрия, рН 7.0. Биологические образцы хранили при -200С до использования. Суммарную РНК выделяли из образцов крови и опухолевой ткани методом фенол-хлороформной экстракции с последующей преципитацией изопропиловым и 75 % этиловым спиртом [9].
Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием прайме-ра CD25-R1, и обратной транскриптазы M-MuLV («Promega», USA). После реакции обратной транскрипции пробу разводили в 50 мкл воды, свободной от нуклеаз. 2 мкл полученной смеси использовали в ПЦР. Программа инкубации реакционной смеси в первом раунде ПЦР: 94°С - 2 мин, (94°С -30 сек, 57°С - 30 сек, 72°С - 45сек) - 30 циклов, 72°С - 5 мин. Во втором раунде: 94°С - 2 мин, (94°С - 30 сек, 57°С - 30 сек, 72°С - 45сек) - 25 циклов, 72°С - 5 мин. Результаты ОТ-ПЦР оценивали методом электрофореза в 1.5 % агарозном геле в присутствии бромида этидия.
Для определения нуклеотидной последовательности фрагменты кДНК вырезали из агарозного геля с последующей элюцией с использованием набора DNA Extraction Kit («Fermentas», Латвия) согласно рекомендациям производителя. Реакцию терминирования дидезоксинуклеозидтрифосфата-ми, меченными флюоресцентными красителями, проводили с использованием набора BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit («Applied Biosystems», USA). К 5 мкл ДНК добавляли 1 мкл BigDye Terminator, 2 мкл буфера и 0.5 мкл праймера, инкубировали при 94°С в течение 5 мин и проводили 25 циклов ПЦР по следующей программе: 94°С - 10 сек, 50°С - 10 сек, 62° - 4 мин. Реакционную смесь переосаждали изопропанолом, разводили в 20 мкл деионизованного формамида и прогревали при 94°С в течение 5 мин. Затем проводили анализ первичной нуклеотидной последовательности одноцепо-чечной ДНК с использованием генетического анализатора ABI Prizm 3130 Genetic Analyzer («Applied Biosystems», USA).
Иммуноферментный анализ: Определение уровня растворимого CD25 антигена в сыворотке крови выполнено двухсайтовым иммуноферментным методом [10] с использованием моноклональных антител ИК0-105, специфичных к sCD25 и меченных пероксидазой хрена, а также поликлональных антител, специфичных к мембранным антигенам мононуклеарных клеток крови человека. Моноклональные антитела ИК0-105 предоставлены Российским онкологическим научным центром им. Н.Н. Блохина.
Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета программ Statistica v. 10.0. Анализ различий относительных частот обнаружения мРНК в группах проводили с использованием статистического критерия сравнения пропорций. Для представления исследованных количественных показателей были использованы медиана, 25 и 75 процентили. Межгрупповой анализ количественных показателей проводили с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни. При анализе качественных и количественных признаков различия считали статистически значимыми при р < 0,05.
Результаты и их обсуждение
При исследовании образцов периферической крови больных раком почки установлено следующее. Во всех исследованных пробах крови обнаруживалась мРНК кодирующая полноразмерную форму CD25 антигена. мРНК с делецией четвертого экзона (CD25Exo4Del) была детектирована в 65 % образцов крови больных раком почки (24/37). Вариант сплайсинга мРНК IL-2Ra без 4 и 5 экзонов (CD25Exo4-5Del) в исследуемых образцах выявлен в 32 % случаев (12/37) (рис. 2). Форма мРНК, кодирующая CD25Exo4Del чаще содержалась в образцах крови, чем форма, кодирующая CD25Exo4-5Del (р = 0.0153). Частота детекции обеих альтернативных форм была статистически значимо ниже частоты детекции полноразмерной формы мРНК (для формы CD25Exo4Del - р = 0.0011, а для CD25Exo4,5Del p < 0,001).
При исследовании образцов опухолевых очагов больных раком почки обнаружено, что ген IL-2RA экспрессируется в 93 % случаев (25 из 27). У двух больных не зафиксировано ни одной из форм мРНК IL-2Ra. В 89 % случаев (24 из 27) детектирована мРНК полноразмерной формы IL-2Ra, альтернативные формы мРНК CD25Exo4Del и CD25Exo4-5Del обнаружены в 78 % (21 из 27) и 56 % (15 из 27) образцов, соответственно (рис. 2). Количество случаев детекции варианта сплайсинга мРНК IL-2Ra без экзонов 4 и 5 было статистически значимо ниже, чем частота детекции полноразмерной формы мРНК (р = 0,0067). При этом у больных, имевших метастазы (как региональные, так и отдалённые) после удаления опухоли (у 11 из 37 больных) частота выявления полноразмерной формы мРНК CD25 была статистически значимо выше, чем частота обнаружения формы мРНК CD25Exo4-5Del (р = 0.0048) (табл. 1).
■ - экспрессия гена 1Ь-2ЯА в крови. □ - экспрессия гена 1Ь-2ЯА в опухолевых очагах.
* - статистически значимые различия по сравнению с частотой обнаружения мРНК полноразмерной формы 1Ь-2ЯА: р < 0,05.
" - статистически значимые различия по сравнению с частотой обнаружения мРНК СБ25Ехо4М: р = 0.0153.
Рис. 2. Частота обнаружения мРНК полноразмерной и альтернативных форм ГЬ-2ЯА в крови и в опухолевых очагах больных раком почки
Таблица 1
Частота обнаружения альтернативных форм мРНК IL-2Ra в опухолевых очагах больных раком почки при наличии или отсутствии метастазов
Метастазы мРНК CD25 мРНК CD25Exo4Del мРНК CD25Exo4-5Del
нет 23/26 (88 %) 22/26 (84 %) 17/26 (65 %)
есть 11/11 (100 %) 9/11 (82 %) 5/11 (45 %)*
Примечание:
В столбцах числитель дроби - это количество пациентов, имеющих указанную в верхней строке форму мРНК; знаменатель дроби - общее количество больных в данной группе; в скобках - % больных от общего их количества в группе, имеющих указанную в верхней строке форму мРНК.
* - статистически значимые различия по сравнению с частотой выявления мРНК CD25 (р = 0.0048).
При сравнении частоты обнаружения различных форм мРНК у больных с разными стадиями заболевания обнаружено, что полноразмерная форма мРНК детектируется в пробах опухолевых очагов почти у всех больных. У пациентов, имеющих III и IV стадии заболевания содержание альтернативных форм мРНК статистически значимо меньше, чем полноразмерной формы мРНК (табл. 2).
Зафиксировано, что у больных некоторыми лимфомами Tac-позитивны-ми клетками осуществляется более интенсивная продукция интерлейкина-2 по сравнению с клетками без экспрессии Tac [11]. CD25-положительные ра-
ковые клетки предположительно делятся более интенсивно и характеризуются хромосомной нестабильностью, что может являться причиной агрессивности опухоли. Эти данные дают основание предположить, что в опухолевых клетках альфа-цепь рецептора интерлейкина-2 участвует в запуске путей передачи сигналов, управляющих прогрессией клеточного цикла. Кроме этого, показано, что гиперэкспрессия в генетических измененных опухолевых клетках приводит к повышению уровня экспрессии генов ингибиторов апоптоза и, как следствие, выживания этих клеток.
Таблица 2
Частота обнаружения мРНК полноразмерной и альтернативных форм IL-2Ra в опухолевых очагах больных раком почки по стадиям заболевании
Стадия заболевания мРНК CD25 мРНК CD25Exo4Del мРНК CD25Exo4-5Del
I стадия 15/18 (83 %) 13/18 (72 %) 10/18 (55 %)
II стадия 8/8 (100 %) 7/8 (87 %) 5/8 (62 %)
III стадия 6/6 (100 %) 5/6 (83 %) 2/6 (33 %)* р = 0.0158
IV стадия 5/5 (100 %) 3/5 (60 %) 2/5 (40 %)* р = 0.0427
Примечание:
Числитель дроби - количество пациентов, имеющих указанную в верхней строке форму мРНК есть; знаменатель дроби - общее количество больных в данной группе; в скобках - % больных от общего их количества в группе, имеющих указанную верхней строке форму мРНК.
* - статистически значимые различия по сравнению с частотой выявления полноразмерной формы мРНК CD25 (р < 0,05).
При помощи иммуноферментного анализа сыворотки крови больных раком почки обнаружено, что уровень растворимых молекул IL-2RA (sCD25) в среднем был 442.4 ± 23 U/ml. Как было обнаружено при исследовании группы здоровых (50 человек) этот параметр в среднем равен 406 ± 21U/ml. То есть в обследованной в данной работе группе больных sCD25 превышал норму более, чем в 1.2 раза. Изменения уровня sIL-2Ra отмечены при таких заболеваниях, как многие формы рака, аутоиммунные и инфекционные заболевания, кризы отторжения при пересадке органов. Во многих случаях, определение содержания растворимого IL-2Ra в сыворотке крови может являться прогностическим критерием течения заболевания [12,13].
Обнаружено, что с увеличением стадии заболевания, среднее значение уровня sCD25 в сыворотке, а также количество пациентов, у которых этот показатель больше, чем у здоровых повышается (табл. 3). При этом выявлены статистически значимые различия средних значений содержания растворимых молекул sCD25 у пациентов, имеющих разные стадии рака почки. У пациентов, имеющих стадию II этот показатель был меньше, чем у пациентов имеющих стадию III (р = 0.0317), а sCD25 на стадии III в среднем был меньше, чем на стадии IV (р = 0.0303).
Таблица 3
Сывороточное содержание растворимых молекул зСБ25 у больных раком почки на разных стадиях заболевания по сравнению с нормой: 406 ± 21 Ед/мл
Стадия заболевания Сывороточный уровень sCD25 Ед/мл Количество случаев sCD25 > 406.0 Ед/мл / численность группы
I стадия 434.1±25 9/25
II стадия 453.2±16 8/14
III стадия 488.6±70* 5/6
IV стадия 644.7±9" 5/5
Примечание:
* - статистически значимые различия по сравнению со значением 406 ± 21 Ед/мл (норма)
р = 0.0471.
" - статистически значимые различия по сравнению с Ш-й стадией (р = 0.0303).
При сравнении сывороточного уровня растворимых молекул CD25 у больных раком почки при наличии мРНК полноразмерной и альтернативных форм CD25 в опухолевом очаге (мРНК+) и при их отсутствии (мРНК-) обнаружено, что если в образцах опухолей детектировались все формы мРНК как полноразмерные, так и с делециями, то уровень растворимых молекул CD25 был более высокий (441.3 ± 29 Ед/мл) чем у здоровых (sCD25 = 406 ± ± 21 Ед/мл) и чем у больных, отличающихся тем, что в их образцах из опухолевого очага отсутствовали те или иные формы мРНК (sCD25 = 330.6 ± ± 49 Ед/мл) (рис. 3). Эти данные позволяют предполагать, что повышение сывороточного уровня молекул sCD25 у больных раком почки по сравнению с нормой было связано с наличием мРНК кодирующих как полноразмерную так и альтернативные формы IL-2RA в клетках опухолевых очагов.
Ед/мл
50(1 45« 400 ¿50 300 250 200 150 100 50 о
МРНК+ мРНК-
* - статистически значимые различия по сравнению с 406 ± 21 Ед/мл (норма) р = 0.0452
Рис. 3. Сывороточный уровень растворимых молекул CD25 у больных раком почки при наличии мРНК полноразмерной и альтернативных форм CD25 в опухолевом очаге (мРНК+) и при их отсутствии (мРНК-)
Сопоставляя полученные результаты с данными других исследователей можно сделать следующие выводы. Результаты оценки различных форм мРНК показали, что при раке почки также как и при других онколоогиче-ских заболеваниях по-видимому наблюдается высокая тканевая экспрессия IL-2RA. Так известно, что гиперэкспрессия IL-2RA в опухолевых клетках имеется при раке легкого [14], простаты [15], молочной железы [16], а также при лейкемиях [17-19].
Известно, что высокая экспрессия IL-2Ra в неопластических клетках приводит к повышению их пролиферативной, трансформирующей активности и устойчивости к лекарственным препаратам. В том числе показана способность IL-2 стимулировать пролиферацию опухолевых клеток [12]. Недавние исследования также показали, что чрезмерно высокая тканевая экспрессия IL-2RA в опухолевых клетках коррелирует с плохим прогнозом для пациента [20]. Наличие различных форм мРНК в пробах периферической крови IL-2RA можно расценивать, как реакцию клеток иммунной системы на наличие онкологического заболевания даже на его первых стадиях. Считается, что гиперпродукция растворимой формы IL-2Ra характеризует более поздние стадии развития онкологических заболеваний человека и/или неблагоприятный прогноз для пациента [12]. Исследования, проведенные in vitro показали, что sCD25 антиген в определенной концентрации может нейтрализовать IL-2-зависимые функции иммунной системы, конкурируя за циркулирующий IL-2 с мембранной формой [21]. Кроме этого, снижение плотности экспрессии мембранного вследствие протеолитического шеддинга также снижает уровень активации Т-клеток [22]. Результаты, полученные нами при исследовании больных раком почки, подтверждают данные, полученные другими авторами при исследовании пациентов с другими онкологическими заболеваниями, у пациентов, имеющих IV стадию заболевания
наблюдалось значительное превышение растворимой формы IL-2RA.
* * *
Результаты детектирования различных форм мРНК рецептора CD25 образцов периферической крови, и опухолевых очагов, и определение sCD25 с помощью иммуноферментного анализа сыворотки крови, впервые проведенный у больных раком почки, показали, что с помощью подхода использованного в работе можно получить информацию, имеющую ценность для прогнозирования течения заболевания. Можно предполагать, что в регуляции пролиферативной способности как клеток иммунной системы, так и клеток опухоли важное значение имеет не только наличие или отсутствие, различных мембранных и растворимых форм IL-2RA у лейкоцитов, но и их соотношение. Полученные данные показали, что при раке почки клетки опухоли имеют возможность использовать цитокины для увеличения их численности и активно препятствуют пролиферации клеток иммунной системы.
Список литературы:
1. База знаний по биологии человека [Электронный ресурс]: Веб сайт. -Режим доступа: http://humbio.ru/humbio/il-2/0000386a.htm.
2. Dendorfer U., Maslinski W., Remillard B., Strom T.B. Interleukin-2 and the interleukin-2 receptor // Transplant Sci. - 1993. - V 26, № 3. - P. 83-91.
3. Wei L., Jian-Xin L., Warren J. Interleukin-2 at the Crossroads of Effector Responses, Tolerance, and Immunotherapy // Immunology Center, USA. - 2013. -V 38, № 1. - P. 13-25.
4. Ярилин А.А., Добротина Н.А. Введение в современную иммунологию. - Н.Новгород: ННГУ 1997. - 238 с.
5. Cosman D., et al. Cloning, sequence and expression of human interleukin-2 receptor // Nature. - 1984. - Vol. 312, № 5996. - P. 768-771.
6. Choi C., et al. Homo sapiens interleukin-2 receptor mRNA, alternatively spliced, partial cds [Электронный ресурс] // Submitted Neurology, Yonsei University. - Shinchon-dong, South Korea, 1997. - Режим доступа: www.ncbi. nlm.nih.gov/nuccore/AF008556.1.
7. Sarquis M.S., Agrawal S., Shen L. Distinct expression profiles for PTEN transcript and its splice variants in Cowden syndrome and Bannayan-Riley-Ruvalcaba syndrome // Am. J. Hum. Genet. - 2006. - V 79, № 1. - P. 23-30.
8. Симбирцев А.С. Интерлейкин-2 и рецепторный комплекс интерлей-кина-2 в регуляции иммунитета // Иммунология. - 1998. - № 6. - С. 3-8.
9. Chomszynski P., Sacchi N., et al. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Anal. Biochem. -1987. - V 162, № 1. - P. 156-159.
10. Иммунологические методы / Под ред. Г. Фримеля. - М.: Медицина, 1987. - 472 с.
11. Peuchmaur M., Emilie D., Crevon C. et al. IL-2 mRNA expression in Tacpositive malignant lymphomas // Am. J. Pathol. - 1990. - V 136. - P. 383-390.
12. Kuhn D.J., Dou Q.P. et al. The role of interleukin-2 receptor alpha in cancer // Front. Biosci. - 2005. - V. 10. - P. 1462-1474.
13. Bien E., Balcerska A. et al. Serum soluble interleukin 2 receptor alpha in human cancer of adults and children: a review // Biomarkers. - 2008. - V 13, № 1. - P. 1-26.
14. McDoniels-Silvers A.L., Stoner GD., Lubet R.A. Differential expression of critical cellular genes in human lung adenocarcinomas and squamous cell carcinomas in comparison to normal lung tissues // Neoplasia. - 2002. - V 4. - P. 141-150.
15. Royuela M., De Miguel M.P., Bethencourt F.R., Fraile B., Arenas M.I. IL-2, its receptors, and bcl-2 and bax genes in normal, hyperplastic and carcinomatous human prostates: immunohistochemical comparative analysis // Growth Factors. - 2000. - V 18. - P. 135-146.
16. Garcia-Tunnon I., Ricote M., Ruiz A. et al. Interleukin-2 and its receptor complex (alpha, beta and gamma chains) in in situ and infiltrative human breast
cancer: an immunohistochemical comparative study // Breast Cancer Res. - 2004. -V 6, № 1. - P. 1-7.
17. Araki K., Harada K., Nakamoto K., Shiroma M., Miyakuni T. Clinical significance of serum soluble IL-2R levels in patients with adult T cell leukaemia (ATL) and HTLV-1 carriers // Clin Exp Immunol. - 2000. - V. 119. - P. 259-263.
18. Pui C.H., Ip S.H., Iflah S., Behm F.G, Grose B.H., Dodge R.K., Crist W.M., Furman W.L., Murphy S.B. Rivera GK. Serum interleukin 2 receptor levels in childhood acute lymphoblastic leukemia // Blood. - 1988. - V 71. - P. 1135-1137.
19. Knauf W.U., Langenmayer I., Ehlers B., Mohr B., Adorf D., Nerl C.H., Hallek M., Zwingers T.H., Emmerich B., Thiel E. Serum levels of soluble CD23, but not soluble CD25, predict disease progression in early stage B-cell chronic lymphocytic leukemia // Leuk Lymphoma. - 1997. - V 27. - P. 523-532.
20. Kuhn D.J., Dou Q.P. et al. The role of interleukin-2 receptor alpha in cancer // Biomarkers. - 2008. - V 13, № 11. - P. 1-26.
21. Rhind G.S., Shek N.P., Shinkai S., Shephard J.R. Effects of moderate endurance exercise and training on in vitro lymphocyte proliferation, interleukin-2 (IL-2) production, and IL-2 receptor expression // Eur. J. Appl. Physiol. - 1996. -V. 74, № 4. - P. 348-360.
22. Huang A., Quinn H., Glover C. et al. The presence of interleukin-2 receptor alpha in the serum of colorectal cancer patients is unlikely to result only from T cell up-regulation // Cancer Immunol. Immunother. - 2002. - V 51, № 1. - P. 53-57.
