CC BY
11FTAMP: 68.37.29
¥.А. АБЫЛАЕВА, A.A. САРДАР, А.К. ТУРСУНОВА, Ш.М. ТУРБЕКОВА,
Г.Д. АБИШЕВА
Ж. Жиембаев атындагы ^азак eсiмдiк коргау жэне карантин гылыми-зерттеу институты,
Алматы, ^азакстан e-mail: ablay.ula@mail.ru
АЛМАТЫ ОБЛЫСЫ ЖАГДАЙЫНДА SOLANUM L YCOPERSICUM (ЦЫЗАНАЦ) ОЦШАУЛАНГАН ПАТОГЕНД1 САЦЫРАУ^¥ЛА^ТАРДЫ ИЗОЛЯЦИЯЛАУ
ЖЭНЕ ИДЕНТИФИКАЦИЯЛАУ
doi:10.53729/MV-AS.2023.03.15
TY^H
Solanum lycopersicum (кызанак) - 6ykm элемде тутынылатын ец мацызды кекешс дакылы. Оныц енд1р1с1н шектейтш непзп факторлардыц 6ipi сацыраукулак аурулары. Крршаган ортаныц белгш бip абиотикалы; жэне биотикалык факторларыныц, атап айтканда зиянды микроорганизмдердщ негiзiнде пайда болатын аурулар кешеншщ дамуы жемiс ешмдшпнщ темендеуше экеледi жэне кызанактыц жогары жэне теракты eнiмдiлiгiн алуга теpiс эсер етед^ Корганыс шараларыныц негiзi - ол кебшесе ауру коздыргыштарыныц тYpлiк к¥рамы мен биологиялык еpекшелiктеpiн бшуге негiзделедi. Осыган CYЙене отырып, кызанакты фитопатогендерден коргау шараларын уйымдастырып, аурудыц дамуын шектеуге ыкпал ететiн гылыми негiзделген эдiстеpдi камтуы керек.
Зерттеу жумысыныц eзектiлiгi - Алматы облысы Карасай ауданы жагдайында кызанак дакылыныц «Ламадор» сортында кездесетiн Fusarium, Alternaria жэне Aspergillus туыстыгына жататын сацыраукулактар класикалык жэне молекулалык-генетикалык эдiстеp аркылы тYpлiк курамга дейiн аныкталды.
Макалада S. lycopersicum дакылыныц сацыраукулак ауру коздыргыштары баяндалган. Дакылдыц негiзгi аурулары: кешетгердщ залалдануы, фузариоздык солу, коцыр дак, сактау кезiндегi жемютердщ шipуi. Ауру белгiлеpi бар кызанак Yлгiлеpiнен бeлiнiп алынган патогендерге морфологиялык-культуралдык касиеггеpi бойынша фитопатологиялык жэне молекулалык-генетикалык зерттеулер жYpгiзiлiп, тYpге дейiн идентификация жасалынды. ДэстYpлi микологиялык эдiстеpдi бipлесiп колдану нэтижесiнде кызанак дакылынан алынган 4 изоляттыц iшiнде Fusarium туыстыгыныц 2 тYpi: Fusarium equiseti жэне Fusarium oxysporum изоляттары, Alternaria туыстыгынан: Alternaria alternata, Aspergillus туыстыгынан: Aspergillus flavus аныкталды.
Кштп сездер: ITS-аймак, кызанак, патоген, идентификация,праймер.
^ызанак - элемде ец кеп тутынатын кекенютердщ 6ipi. ^ызанак eндipу каркыны артуымен катар еарудщ тYpлi эдiстеpi пайда болып, ^ipri уакытта эpтYpлi экологиялык жагдайларда жэне Yнемi жацарып туратын сорттар eсipiлуде. Кец аукымды эртараптандыру, eсiмдiк шаруашылыгыныц кYшеюi жэне элемдш сауда жYЙесi эсipесе жаца аурулар пайда болган жерлерде фитосанитарлык жагдайды жаксартуга септiгiн тигiзiп жатыр [1]. ^аз1рп уакытта ауылшарушылыгы дакылдарына 8,5 мыцга жуык ауру коздыргыштары зиян келтсредг Зиянды агзалардыц эсеpiнен жалпы eнiм тапшылыгы жыл сайын вегетациялык кезецде орта есеппен 30-35% жэне дайын eнiмдi тасымалдау жэне сактау кезещнде 15-25% курайды [2]. ^ызанак, бактериялар мен сацыраукулактардыц дамуы Yшiн жаксы орта болып табылады, залалданган eнiм iшiнаpа немесе толык жарамсыз болады [3].
Бiздiц елiмiзде де ец кеп таралган кeкeнiс дакылдарыныц бipi - кызанак. Бул оныц жогары ешмдшгше, пайдаланудыц эpтYpлiлiгiне, жогары биологиялык кундылыгына жэне eнiмнiц жогары дэмiне байланысты [4]. Елiмiзде кызанак дакылы ашык жэне коргалган танапта кецiнен еаршедг Соцгы жылдары кызанак eнiмдiлiгiнiц темендеуше жэне жемю сапасыныц нашарлауына сацыраукулак, вирустык жэне бактериялык ауру
243
коздыргыштарыныц тYрлерiмен залалдануы эсер еттi. Сонымен катар климаттык жагдайлардыц eзгеруi жэне тYрлi зиянкестердщ терiс эсерi ыкпал етiп отыр [5].
^азiргi уакытта елiмiзде кызанак eсiрумен негiзiнен фермерлер мен жалга алушылар айналысады. Олардыц кeпшiлiгi фитосанитарлык нормалар мен талаптарды орындамайды, атап айтканда, ауыспалы епсп сактамайды, себу алдында тукымдарды зарарсыздандырмайды. Муныц бэрi тYрлi инфекциялардыц жиналуына жэне аурулар, зиянкестер мен арамшептердщ кец таралуына ыкпал етедi. Эаресе, сацыраукулак аурулары айтарлыктай зиянды. Олардыц шшде ец кеп таралган жэне зиянды тYрлерiне фитофтороз, альтернариоз, фузариум жэне ботритиоз коздыргыштары жатады. Бул аурулар кызанак жемстершщ сапасына айтарлыктай эсер етед^ оцай еритiн кeмiрсулар, минералдар мeлшерi азаяды, сонымен катар адам денсаулыгына зиянды органикалык косылыстар жинакталады. Аталган ауру тYрлерiмен залалданган алкапта 50-60% eнiмдi жогалтады [6]. Барлык патогендi аурулардыц eзiндiк ерекшелiктерi бар. Ашык танап жагдайында бiр агроэкологиялык аймактагы патогендердiц кешендi курамы жэне зияндылык децгейi эртYрлi болады. Осы жагдайда, корганыс шараларын жYргiзу барысында коздыргыштардыц тYрлiк курамы мен биологиялык ерекшелiктерiн, олардыц дамуына эсер ететш коршаган орта факторларын бшу мацызды. Сондыктан, корганыс шараларын уакытылы жэне тиiмдi жYргiзу жэне халыкаралык стандарттардыц талаптарына сэйкес сапалы жогары eнiм алу Yшiн, аурулардыц диагностикалык белгiлерiн, олардыц коздыргыштарыныц биоэкологиялык ерекшелштерш жаксы мецгеру керек. Зерттеу жумысыныц максаты Алматы облысы, ^арасай ауданында eсiрiлген кызанак ауруларыныц коздыргыштарыныц тYрлiк курамын, олардыц морфологиялык-культуралдык жэне молекулалык-генетикалык сипаттамаларын аныктау болды.
Зерттеу материалдары мен эд1стер1
Зерттеу жумыстары зертханада жэне танаптык жагдайда жYргiзiлдi. Танаптык кiшi мeлдектi тэжiрибе жумыстары: ашык танапта ^шета кeшiрiп отыргызу, eсiмдiктiц eсуiн бакылау, eнiмдi жинау - ^^шс шаруашылыгы жэне бакша шаруашылыгы туралы тэжiрибелiк iс эдiстемесi (1992) жэне ^^шс дакылдарын мемлекеттiк сорттык сынау эдiстемесi (1985) бойынша жYргiзiлдi.
^ызанактыц ауруларына есеп - оныц тамырларын визуалды карау жэне eнiмдерiн жинау барысында жYргiзiлдi. Дакылдыц сацыраукулак ауруларыныц тYрлiк курамын зерттеу Yшiн бYкiл вегетациялык кезецде залалдану белгiлерi бар Yлгiлер жиналды (жапырактары, жемютер^ жемiс тYЙiнi, тамыры).
Зерттеу жумыстары кызанактыц «Ламадор» сортына жYргiзiлдi. Жумыс барысында ауру коздыргыштары жэне олардыц тYрлiк курамы аныкталды. Аталмыш eсiмдiктегi кездесетiн фитопатогендi сацыраукулактардыц тYрлiк курамын аныктау Yшiн, стандартты эдiстер колданылды. Зертханалык жагдайда закымдалган eсiмдiк Yлгiлерiне микробиологиялык талдау жYргiзiлдi [7]. ^ызанактыц сау жэне ауру тiндерiнiц (жапырактары, сабактары, жемiстерi) шекарасында ауру коздыргыштарымен залалданган мYшелерiнен усак фрагменттерi агынды суда, содан кейiн тазартылган суда мукият жуылып, спиртте зарарсыздандырылды (бактериялардан зардап шеккен мYшелерден баска), CYЗгi кагазына (стерильдi суга малынган) жэне картоптыц декстрозды агарлы ортасына койылды. Эскен колонияларга М.К. Хохряковтыц эдютемес бойынша 7-тэулiкте микроскопиялык препарат жасалынды. ^ызанактыц сацыраукулак ауруларыныц коздыргыштарын eсiру Yшiн ец колайлы коректiк орта болып: картопты агар (КА), картопты-декстрозды агар (КДА) жэне Чапек агары (ЧА) iрiктелiнiп алынды.
Патогендердiц конидиальды споралары биологиялык эдiспен (микроскоптыц ^мепмен) аныкталды. Спора болмаган жагдайда зерттеу материалы жасанды коректiк ортага егшдь ТYP курамын аныктау Yшiн отандык жэне шетелдiк авторлардыц аныктамалык куралдары пайдаланылды.
Молекулалык-генетикалык зерттеу бeлiмi келес кезецдерден турады: жалпы ДНК-ны окшаулау, ПТР бойынша амплификация, ПТР ешмш секвенирлеу, секвенирлеуден алынган нэтижелердi деректер корындагы мэлiметтермен салыстырмалы талдау (сэйкестендiру).
Окшауланган сацыраукулактыц таза культураларынан, ДНК-ны белш алу «Проба-ГС» (ООО «НПО ДНК-Технология», Ресей) реагентсмен, eндiрушiлердщ арнайы хаттамасы бойынша орындалды.
Окшауланып алынган ДНК Yлгiлерiн жэне амплификацияланган ПТР eнiмдерiн тексеру Yшiн агарозды гельдегi электрофорез эдiсi пайлаланылды. Окшауланган ДНК-ны сапалы аныктау Yшiн Yлгiлер электрофорез Yшiн келденец камерада этидий бромидi косылган 1% агарозды гельде белшдь Эталон ретшде Generuler (Thermo Scientific, US) маркерi колданылды. Электрофорез нэтижелерi гельдi кужаттау жYЙесi трансиллюминатор Quantum-ST 5 (Vilbert Lourmat) аркылы талданды.
ПТР талдау ITS 1 (5' TCC GTA GGT GAA CCT GCG G '3) жэне кер ITS 4 (5' TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC '3) праймерлерi аркылы жYзеге асырылды [8]. ПТР реакцисына кажетп реагенттер коспасында (25 мкл) 4 мкл HF буферi (Thermo scientific), 0,5 мкл дезоксирибонуклеозид трифосфаты (dntp) коспасы, праймерлердщ эркайсысыныц 0,3 мкл коспасы, ДНК полимераза фермент Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Thermo scientific) 0,2 мкл жэне 2 мкл ДНК болды нысаны болды. Реакция SimpliAmp Thermo Cycler (Life Technologies Corporation) термоциклершде келес режимдерi бойынша жYргiзiлдi: бастапкы денатурация - 98°С, температурада 30 сек, 98°С - 10 сек, 60°- 20 сек жэне 72°C-30 соцгы узарту 72°C температурада 5 мин.
ПТР фрагменттерш бегде коспалардан тазарту «ExoSap ITTM» реактивтершщ жиынтыгын колдану аркылы жYргiзiлдi.
ITS аймактыц нуклеотидтер т1збепшц трелей реттiлiгiн аныктау Сенгер бойынша (Applied Biosystems , Genetic Analyzer 3500) секвенаторында жYзеге асырылды.
Секвенирлеуден алынган деректердi биоакпараттык талдау жэне гомологиялык нуклеотидтер тзбегш iздеу GenBank жэне Bold Systems ашык генетикалык деректер базасында жYргiзiлдi [9-10].
Зерттеу нэтижелер1 жэне оларды талдау
Аурудыц зияндылыгын темендету Yшiн ауру коздыргыштарыныц тYрлiк курамын жэне биологиялык ерекшелштерш бiлу кажет. Кызанак дакылынан окшауланган сацыраукулак коздыргыштарыныц тYрлiк курамы аныкталды. Оларга сацыраукулактар тYрiнен Alternaria, Fusarium, аскомицет тYрiнен Aspergillus аныкталды. Фитопатогендердщ морфологиялык белгiлерiн аныктау картопты-декстрозды коректiк ортада жYргiзiлдi.
Fusarium - колониялар Yлпiлдек, ак тYCтi. Микроскоптык препарат нэтижесiнде макро жэне микроконидиялар аныкталды. Микроконидиялар 1-2 жасушалы, децгелек, сопакша, кейде сэл кисык. Макроконидиялардыц пiшiнi - орак, эллипс тэрiздi. Шетiндегi жасуша сэл тарылган, догал тэрiздес. Макроконидиялардыц эдетте 3-5 жасушалы. Элшемдерг 20-60x4-7 мкм [11].
Alternaria - егш жинауга дешн жэне одан кейiн ауылшаруашылык ешмдерше, соныц iшiнде дэндi дакылдарга, жемютер мен кeкeнiстерге зиян келтiретiн сацыраукулактардыц барлык жерде кездесетiн бiр тYрi. Alternaria бiрнеше тYрi eсiмдiк патогенезшде мацызды рел аткаратын фитотоксиндер жэне адамдар мен жануарларга зиянды болуы мYмкiн микотоксиндер болып саналатын кайталама метаболиттердi шыгаруга кабiлеттi [12].
Aspergillus - шамамен 300-ден астам аныкталган зец тYрлерiнен туратын сацыраукулактар тукымдасы. Aspergillus эртYрлi коршаган орталарда кездесед^ себебi ол ылгалдылыгы жогары ортада жаксы кeбейедi. Сацыраукулак денесi мицелийден турады. Мицелий жука, тYтiкшелi, бозгылт тYCтi, кец тармакталган, жука кабыргалы гифалардан турады. Кейбiр гифалар субстратта тармакталады, ал кейбiреулерi коректiк ортадагы затты сiцiру Yшiн субстратка енш орналасады. Конидиялар усак сфера тэрiздi, бiр жасушалы, бiр
ядролы немесе кеп ядролы, кара, коцыр немесе сары-жасыл tyctí болып келедi жэне ауа агымдары аркылы таралады. Олар колайлы субстратта есiп, урык TYTÍrÍH шыгарады. ¥рык TYTiri септумга айналады, тармакталып, мицелий тYзедi [13].
Fusarium spp.
колонияныц корекпк ортада есу1 микроскоптык курылымы
Alternaria spp.
микроскоптык курылымы
колонияныц корект1к ортада есу1
Aspergillus spp.
микроскоптык курылымы
колонияныц корект1к ортада есу1
Сурет 1 - Картопты-декстрозды агар корекпк ортасында ес1ршген сацыраукулактардыц морфологиялык-микроскоптык ерекшел1ктер1
1-суретте керсетiлгендей, аныктамалык нускаулыктар бойынша аныктау кейде дэл бола бермейпш белгiлi. Осыган байланысты, белiнiп алынган фитопатогендi сацыраукулактарды тYрге дейiн аныктау Yшiн молекулалык-генетикалык эдiстермен растау жYргiзiлдi. Секвенирлеу эдiсi аркылы кызанак дакылы ауруларыныц коздыргыштары Fusarium, Alternaria, Aspergillus штамдарыныц нуклеотидтiк тiзбегi аныкталды.
Келес зерттеу жумысы iрiктелiп алынган сацыраукулактарды молекулалык-генетикалык идентификациялау бойынша жYргiзiлдi. Кез-келген молекулалык-генетикалык зерттеулердiц бастапкы кезецi ДН^-ны белiп алу болып табылады. Осыган
орай, зерттеу жумысында мицелийлi сацыраукулактардан геномдык ДН^-ны окшаулау бойынша жумыс жасалынды.
Бiрiншi кезецде, ДНК бeлiп алу Yшiн, «Проба-ГС» (ООО «НПО ДНК-Технология», Ресей) коммерциялык eндiрушiлер усынган хаттама бойынша жYргiзiлдi. Зерттеулер нэтижесiнде бул хаттама мицелий сацыраукулактарынан ДН^-ны белш алу кезiнде тиiмдi екендiгi аныкталды. Микромицеттердщ ДНК окшаулау нэтижелерiн аныктау 1% агарозды гельдеп электрофорез эдiсi кемепмен жYргiзiлдi. Осы коммерциялык жинакты пайдалану аркылы геномдык ДНК белшш алынды (Сурет 2).
Сурет 2 - Сацыраукулактардыц ДНК электрофореграммасы
2-суретте кeрсетiлгендей, геномдык ДНК экстракциясыныц нэтижеа барлык Yлгiлерде оц болды.
ПТР жYргiзу Yшiн геннiц таксономиялык мацызды аймактары транскрипцияланган iшкi аралык (ITS) факторы ITS 1/ITS4 эмбебап праймерлершщ кeмегiмен жYзеге асырылды. ПТР ешмдерш тексеру максатында 1% агарозды гельдеп электрофореграмма жасалынды. Тiзбектiц кYтiлетiн мелшерь570 ж.н. (Сурет 3).
U4
1000 ж.н 750 ж.н 500 ж.н 250 ж.н
М SL1 SL2 SL3 SL4
Сурет 3 - Изоляттардыц ITS 1/ITS4 праймерлер1мен амплификациясы
3-суретте керсетшгендей, ITS1/ITS4 праймерлерiмен амплификациялау нэтижешнде шамамен 570 ж.н. туратын ДН^ тiзбектерi алынды, бул учаскенщ елшемше сэйкес келедi.
ITS аймагыныц нуклеотидтер тобегшщ т1келей реттшп (Applied Biosystems, Genetic Analyzer 3500) генетикалык анализаторында енд1руш1 компанияныц усыныстарына сэйкес журпзшд1.
Алынган нуклеотидтер т1збегш GENEBANK дереккорындагы кол жет1мд1 т1збектермен салыстыру BLASTN багдарламасы аркылы жузеге асырылды.
Зерттелетш штаммдарда ITS аймагын филогенетикалык талдау нэтижелер1 генетикалык кашыктыкты есептеудщ кластерл1к эдюш Neiighbor-Joining пайдалана отырып, MEGA7 багдарламасында салынган филогенетикалык агаштар туршде усынылган.
А
MG594514.1 Fusarium equiseti
- OR136459.1 Fusarium equiseti
• SL1
IMK629373.1 Fusarium oxysporum AY387705.1 Fusarium oxysporum -MG594507.1 Fusarium fujikuroi
MG654673.1 Fusarium fujikuroi
_ _ MT560206.1 Fusarium redolens
MT560205.1 Fusarium redolens
- -KJ125534.1 Fusarium chlamydosporum
-OL832262.1 Fusarium tricinctum
4 KX058548.1 Fusarium avenaceum KU852642.1 Fusarium avenaceum
IMH582400.1 Fusarium solani EU329711.1 Fusarium solani
I-1
0.005
Б
ON845669.1 Aspergillus flavus ORÜ51631.1 Aspergillus flavus • SL2
L MK429758.1 Aspergillus burnettii
- NR 154725.1 Aspergillus hancockii -NR 184866.1 Aspergillus lanuginosus
- NR 121481.1 Aspergillus fumigatus
I-OL444887.1 Aspergillus niger
I NR Ü77143.1 Aspergillus awamori
— NR 185394.1 Aspergillus verrucosus
IMZ901307.1 Aspergillus puulaauensis MT732782.1 Aspergillus puulaauensis I MZ713409.1 Aspergillus nidulans
- ON68Ü864.1 Aspergillus nidulans
ON68Ü864.1 Aspergillus nidulans(2) -EU982035.1 Aspergillus awamori
I-1
0.2
Сурет 4 - SL1 штамына ITS yчаскесi непзшде салынган филогенетикалык агаш. Талдауга GenBank-те NCBI сакталган 9 типтiк штамдар тiзбектерi енгiзiлген (А). SL2 штамына ITS учаскес негiзiнде салынган филогенетикалык агаш. Талдауга GenBank-те NCBI сакталган 12 типтш
штамдар тiзбектерi енпзшген (Б)
Жогарыдагы суретте (сурет 4) керсетшгендей, SL1 штамы Fusarium equiseti мен ал SL2 штамы Aspergillus flavus шатмдарыныц нуклеотидт1к т1збектер1мен б1регей тармакта байланысканын керем1з.
А
MT560381.1 Fusarium oxysporum
- MT560342.1 Fusarium oxysporum
• SL3
MG594514.1 Fusarium equiseti
- MT558569.1 Fusarium equiseti
KX463000.1 Fusarium culmorum
- MG594507.1 Fusarium fujikuroi
- DQ453703.1 Fusarium culmorum
IM H582400.1 Fusarium solani JF740931.1 Fusarium solani - MG654673.1 Fusarium fujikuroi
I MT560206.1 Fusarium redolens MT560204.1 Fusarium redolens
I-1
0.01
Б
• SL4
0R214972.1 Alternaria alternata 0R214971.1 Alternaria alternata 0R206502.1 Alternaria alternata 0P886854.1:36-518Alternaria alternate JF780937.1Alternaria simsimi
I JF417574.1 Alternaria panax JF417567.1 Alternaria panax
NR 166228.1Alternaria chlamydosporifera MH856084Alternaria gypsophilae
— FJ433875.1 Alternaria infectoria
l_|KY0
KY009902.1 Alternaria infectoria
NR 166229.1 Alternaria aconidiophora
Сурет 5 - SL3 штамына ITS yчаскесi негiзiнде салынган филогенетикалык агаш. Талдауга GenBank-те NCBI сакталган 6 типтiк штамдар тiзбектерi енгiзiлген (А). SL4 штамына ITS учаскес негiзiнде салынган филогенетикалык агаш. Талдауга GenBank-те NCBI сакталган 13 типтш
штамдар тiзбектерi енгiзiлген (Б)
5-суретте SL3 штамына ец жакын Fusarium oxysporum екенш, сонымен б1рге, SL4 штамыныц Alternaria alternata б1р тармакта байланысканын керуге болады.
Сонымен, филогенетикалык агаш Neighbor-Joining (NJ) эдюш колдану аркылы ITS учаскес непзшде курастырылды. Молекулалык-генетикалык талдау нэтижес бойынша
штаммдар темендепдей идентификацияланды: SL1- Fusarium equiseti, SL2- Aspergillus flavus, SL3- Fusarium oxysporum, SL4- Alternaria alternata.
Корытынды
^ызанак (Solanum lycopersicum) - элемдеп ец кеп колданыска ие кекешс болып табылады. Ылгалдылыгы ^урамында судыц мелшерi 94,5%, ягни жогары болгандыктан, бул кекенiс тYрi тYрлi ауру коздыргыштарымен залалданады. Кептеген патогендi сацыраукулактар, кызанак жемютершщ енiмдiлiгi мен сапасына терiс эсер ететiн болгандыктан, непзп зерттеу нысаны болып табылады.
^ызанак дакылдарыныц патогендi сацыраукулактар себебшен пайда болатын ауруларымен кYрес шараларын жYргiзу Yшiн, ец алдымен патогендi дурыс аныктау мацызды. Осыган орай, Алматы облысы, ^арасай ауданында еаршген «Ламадор» сортына жататын, ауру белгiлерi бар кызанак дакылдарына дэстYрлi микологиялык жэне молекулалык-генетикалык эдiстердi уштастыра отырып зерттеу жYргiздiк.
ЖYргiзiлген зерттеулерге сэйкес, ауру белriлерi бар дакылдардан сацыраукулактардыц таза культуралары белiнiп алынып, дэстYрлi микологиялык эдiстер аркылы морфологиялык-культуралдык касиеттерi сипатталды. Алайда, кейбiр аурулардыц сырткы белгiлерi уксас болгандыктан, патогендi накты аныктау киынга согады. Сол себепт], казiргi уакытта молекулалык-генетикалык эдiстердi пайдалану аркылы ауру коздыргыштарды тYрге дешн идентификациялау тиiмдi саналады. Зерттеу корытындысы бойынша, кызанак дакылыныц изоляттарыныц шшен екi Fusarium тYрi: Fusarium equiseti жэне Fusarium oxysporum, Alternaria alternata, Aspergillus flavus тYрлерi идентификацияланды.
Каржыландыру
Зерттеулер ^Р АШМ 2021-2023 жж. 267 «Еылымныц жэне гылыми зерттеулердiц колже^мдшпн дамыту» бюджеттiк багдарламасыныц 101 «Гылыми зерттеулердщ жэне iсшаралар субъектiлерiн багдарламалык нысаналы каржыландыру» кiшi багдарламасы бойынша «Жемю, кекенiс, дэндi, малазыктык, буршак дакылдары мен есiмдiктер карантинiн коргаудыц кешендi жYЙелерiн эзiрлеу жэне жетiлдiру» М^Ж жумыс жоспарына сэйкес жYргiзiлдi. Авторлар осы зерттеулердi жYргiзуге кемектескеш Yшiн эрiптестерiне алгыс бiлдiредi.
Эдебиеттер:
1 Dominique Blanchard. Tomato Diseases Identification, Biology and Control. Second Edition, 2013. 415 P. (https://books.google.kz/books?id=_Sc6_OjjXUC&printsec=frontcover&hl=ru&source=gbs_ViewAPI&r edir_esc=y#v=onepage&q&f=false)
2 О. А. Паластрова. Болезни томата и обоснование мер борьбы с ними в условиях Курганской области: диссертация / - Курган : КГСХА, 2006. - 153 с. (https://cyberleninka.ru/article/n/bolezni-tomata-i-obosnovanie-mer-borby-s-nimi-v-usloviyah-kurganskoy-oblasti/viewer)
3 О. А. Паластрова, А. С. Степановских. Защита томата от болезней в Зауралье : моногр. / -Куртамыш : Куртамышская типография, 2007. - 136 с. - ISBN 978-5-98271-079-6 : 99.84 р
4 Исмаилова Э. Т. и др. Морфологические и молекулярно-генетические характеристики возбудителей основных грибных болезней томатов, произрастающих в Алматинской области //Вестник КазНУ, серия биологическая. - 2017. - С. 75 (chrome-extension://efaidnbmnnnibpcajpcglclefindmkaj/https://elibrary.kaznu.kz/wp content/uploads/2021/06/vestnik-kaznu.-seriya-biologicheskaya_2017-1-70.pdf)
5 Смоляная Н.М. и др. Видовой состав основных возбудителей болезней томата. Сборник материалов Всероссийской (национальной) научно-практической конференции [Электронный ресурс]:материалы Всеросс. (национальной) науч.-практич. конф., посвящ. 100-летию со дня рождения С. И. Леонтьева 2019 / - 488 с. (https://agro.omgau.ru/nauka/sbomiki-nauchnykh-
statej/item/138-materialy-vserossij skoj -natsionalnoj -nauchno-prakticheskoj -konferentsii-posvyashchennoj-100-letiyu-so-dnya-rozhdeniya-s-i-leonteva.html)
6 Джаймурзина А.А., Карбозова Р.Д., Есжанов Т.К., Умиралиева Ж.З. Система защиты томата от болезней на Юго-Востоке Казахстана // Земледелие, агрохимия, кормопроизводство, агроэкология, лесное хозяйство // Известия. - 2012. - № 3. - С. 21-24 (doi: 10.37884/1-2022/08)
7 Егоров Н.С. Практикум по микробиологии. - М.: Изд-во Москва, 1976. - 307 с (https://studizba.com/files/show/djvu/2947-1-a-i-netrusov-m-a-egorov--praktikum-po.html)
8 White T.J. Amplification and direct sequencing offungal ribosomal DNA genes for phylogenetics / T.J. White, T. Bruns, S.B. Lee, J.W- Taylor // PCR Protocol a Guide to Methods and Applications.-Academic Press.- 1990.- N.Y.- P.315-322 (https://www.researchgate.net/publication/223397588_White_T_J_T_D_Bruns_S_B_Lee_and_J_W_Tay lor_Amplification_and_direct_sequencing_of_fungal_ribosomal_RNA_Genes_for_phylogenetics)
9 National Center for Biotechnology Information [Электронный ресурс].-URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov (дата обращения 30.11.22)
10 Barcode of life data system [Электронный ресурс].-URL: https://www.boldsystems.org(дата обращения 30.11.22)
11 Fusariumsolani. Электронный ресурс: (https://www.pesticidy.ru/pathogens/Fusarium_solani)
12 A. Patriarca, G. Vaamonde, V.F. Pinto. Alternaria. Encyclopedia of Food Microbiology, 2017, Pages 14 (doi:10.1007/978-1-4939-6707-0_2)
13 Aspergillus: Habitat, reproduction and importance. Электронный ресурс: (https://www.biologydiscussion.com/fungi/aspergillus-habitat-reproduction-and-importance-ascomycotina/24000)
У.А. АБЫЛАЕВА, А.А. САРДАР, А.К. ТУРСУНОВА, Ш.М. ТУРБЕКОВА,
Г.Д. АБИШЕВА
Казахский научно-исследовательский институт защиты и карантина растений им. Ж. Жиембаева, Алматы, Казахстан e-mail: ablay.ula@mail.ru
ИЗОЛИРОВАНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПАТОГЕННЫХ ГРИБОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ SOLANUM LYCOPERSICUM (ТОМАТ) В УСЛОВИЯХ
АЛМАТИНСКОЙ ОБЛАСТИ
Аннотация
Solanum lycopersicum (томат) - самая важная овощная культура, потребляемая во всем мире. Одним из основных факторов, ограничивающих его производство, являются грибковые заболевания. Развитие комплекса болезней, возникающих на основе определенных абиотических и биотических факторов окружающей среды, в частности вредных микроорганизмов, приводит к снижению урожайности плодов и отрицательно сказывается на получении высокой и стабильной урожайности томата. В основе защитных мероприятий лежит знание видового состава и биологических особенностей возбудителей болезней. Исходя из этого, следует организовать мероприятия по защите томатов от фитопатогенов и включить научно обоснованные методы, способствующие ограничению развития болезни.
Актуальность исследовательской работы заключается в том, что в условиях Карасайского района Алматинской области грибы, относящиеся к родам Fusarium, Alternaria и Aspergillus, встречающиеся у сорта томата «Ламадор», были идентифицированы до видового состава с помощью классических и молекулярно - генетических методов.
В статье описаны возбудители грибковых заболеваний культуры S. lycopersicum. Основные болезни культуры: заражение рассады, фузариозное увядание, бурая пятнистость, гниль плодов при хранении. Были проведены фитопатологические и молекулярно-генетические исследования по морфологическим и культуральным свойствам патогенов, выделенных из образцов томата с признаками болезни, и проведена идентификация до вида. В результате совместного применения традиционных микологических методов из 4 изолятов, полученных из культуры томата, были идентифицированы 2 родственных вида Fusarium : Fusarium equiseti и Fusarium oxysporum, из
родственных видов Alternaria : Alternaria alternata, так же из родственных видов Aspergillus: Aspergillus flavus.
Ключевые слова: ITS-участок, томат, патоген, идентификация,праймер.
IRSTI: 68.37.29
U.A. ABYLAEVA, A.A. SARDAR, A.K. TURSUNOVA, Sh.M. TURBEKOVA,
G.D ABISHEVA
Kazakh Research Institute of plant protection and quarantine named after Zh. Zhiembayev,
Almaty, Kazakhstan e-mail: ablay.ula@mail.ru
ISOLATION AND IDENTIFICATION OF PATHOGENIC FUNGI ISOLATED FROM SOLANUM LYCOPERSICUM (TOMATO) IN THE CONDITIONS OF THE ALMATY
REGION
doi:10.53729/MV-AS.2023.03.15
Abstract
Solanum lycopersicum (tomato) is the most important vegetable crop consumed worldwide. One of the main factors limiting its production are fungal diseases. The development of a complex of diseases arising on the basis of certain abiotic and biotic environmental factors, in particular harmful microorganisms, leads to a decrease in fruit yield and has a negative effect on obtaining a high and stable yield of tomatoes. The basis of protective measures is the knowledge of the species composition and biological characteristics of pathogens. Based on this, it is necessary to organize measures to protect tomatoes from phytopathogens and include scientifically based methods that contribute to limiting the development of the disease.
The relevance of the research work lies in the fact that in the conditions of the Karasai district of the Almaty region, fungi related to the Fusarium, Alternaria and Aspergillus found in the tomato variety "Lamador" were identified to the species composition using classical and molecular genetic methods.
The article describes the pathogens of fungal diseases of S. lycopersicum culture. The main diseases of the culture: infection of seedlings, fusarium wilting, brown spotting, rot of fruits during storage. Phytopathological and molecular genetic studies were carried out on the morphological and cultural properties of pathogens isolated from tomato samples with signs of the disease, and identification to the species was carried out. As a result of the joint application of traditional mycological methods, 2 related species of Fusarium were identified from 4 isolates obtained from tomato culture: Fusarium equiseti and Fusarium oxysporum, from related species of Alternaria: Alternaria alternata, as well as from related species of Aspergillus: Aspergillus flavus.
Keywords: ITS-region, tomato, pathogen, identification,primer.
Tomatoes are one of the most consumed vegetables in the world. Along with the increase in the rate of tomato production, various methods of cultivation appear, and currently varieties are grown in different environmental conditions and constantly updated. Large - scale diversification, increased crop production and the World Trade System contribute to improving phytosanitary conditions, especially in areas where new diseases have appeared [1]. Currently, about 8.5 thousand pathogens cause damage to agricultural crops. The total product deficit due to harmful organisms is on average 30-35% annually during the growing season and 15-25% during the transportation and storage period of finished products [2]. Tomatoes are a good substrate for the development of bacteria and fungi, the infested product becomes partially or completely unsuitable [3].
One of the most common vegetable crops in our country is tomatoes. This is due to its high yield, variety of use, high biological value and high taste of the product [4]. In the country, the tomato crop is widely grown in open and protected soil. In recent years, a decrease in tomato yield
and a deterioration in fruit quality has been affected by infestation with fungal, viral and bacterial pathogens. At the same time, changes in climatic conditions and the negative impact of various pests contribute [5].
Currently, the cultivation of tomatoes in the country is mainly carried out by farmers and tenants. Most of them do not comply with phytosanitary norms and requirements, in particular, do not observe crop rotation, do not disinfect seeds before sowing. All this contributes to the accumulation of various infections and the widespread spread of diseases, pests and weeds. Fungal diseases are especially harmful. Among them, the most common and harmful species include pathogens of late blight, alternariosis, fusarium and botrytis. These diseases significantly affect the quality of tomato fruits, the amount of easily soluble carbohydrates, minerals is reduced, as well as the accumulation of organic compounds harmful to human health. In the field infected with these types of diseases, 50-60% are productive [6]. All pathogenic diseases have their own characteristics. In the conditions of open soil, the complex composition of pathogens in one agroecological zone and the level of harmfulness will be different. In this case, in the process of carrying out protective measures, it is important to know the species composition and biological features of pathogens, environmental factors affecting their development. Therefore, for timely and effective implementation of protective measures and a high-quality tomato harvest in accordance with the requirements of international standards, it is necessary to better master the diagnostic signs of diseases, the bioecological features of their pathogens. The purpose of the research work was to determine the species composition of pathogens of tomato diseases grown in Karasay district, Almaty region, their morphological, cultural and molecular genetic characteristics.
Materials and methods of research
Research work was carried out in laboratory and field conditions. Field small-scale experimental work was carried out on: planting seedlings in open ground, plant growth control, harvesting - the methodology of experimental work on vegetable growing and horticulture (1992) and the methodology of State varietal testing of vegetable crops (1985).
The calculation of diseases of tomatoes was carried out in the process of visual inspection of the roots and harvesting of products [13]. To study the species composition of fungal diseases of tomatoes, samples with signs of infestation were collected during the entire growing season (leaves, fruits, fruit nodules, roots).
Research work was carried out on the tomato variety "Lamador". In the course of the work, pathogens and their species composition were identified. Standard methods were used to determine the species composition of phytopathogenic fungi found in this plant. Microbiological analysis of affected plant samples was carried out in laboratory conditions [7]. To determine the species composition of phytopathogenic fungi found in tomato plants, standard methods were used. At the border of healthy and diseased tissues of tomatoes (leaves, stems, fruits), small fragments of organs affected by pathogens were thoroughly washed in running water, then purified water, sterilized in alcohol (except for organs affected by bacteria), placed on filter paper (soaked in sterile water) and in a dextrose agaric medium of potatoes. The grown colonies were microscopy for 7 days according to the methodology of M. K. Khokhryakov. To determine the most suitable nutrient medium for growing pathogens of fungal diseases of tomatoes, the growth medium of colonies of phytopathogens was studied: potato (PA) and potato-dextrose (PDA) Agars, Chapeca Agar (Cha).
In the absence of spores, the research material was grafted onto an artificial nutrient medium. Reference tools of domestic and foreign authors were used to determine the species composition.
The Department of molecular genetic research consists of the following stages: isolation of common DNA, amplification by PCR, comparative analysis (identification) of the PCR product (sequencing), data obtained from sequencing with data from the database.
From pure fungal cultures, DNA extraction was carried out with a reagent" «Проба-ГС» (ООО «НПО ДНК-Технология», Russia), according to a special protocol of manufacturers.
The method of electrophoresis in agarose gel was used to test isolated DNA samples and amplified PCR products. For qualitative determination of isolated DNA, the samples were separated in a 1% agarose gel with the addition of ethidium bromide in a horizontal chamber for electrophoresis. The generuler (Thermo Scientific, US) marker was used as a benchmark. The results of electrophoresis were analyzed using the gel documentation system transilluminator Quantum-ST 5 (Vilbert Lourmat).
PCR analysis was carried out using its 1 (5'TCC GTA GGT GAA CCT GCG G '3) and reverse its 4 (5'tcc TCC GCT TAT TGA TAT GC' 3) primers [8]. In the mixture of reagents required for the PCR reaction (25 |iL), there were 4 |iL of HF buffer (Thermo scientific), 0.5 |iL of deoxyribonucleoside triphosphate (dntp) mixture, 0.3 |iL of each of the primers mixture, DNA polymerase enzyme Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Thermo scientific) 0.2 ^L and 2 |iL of DNA. The reaction was carried out in the Thermocycle SimpliAmp Thermo Cycler (Life Technologies Corporation) according to the following mode: initial denaturation - 98°C, temperature 30 sec, 98°C - 10 sec, 60°- 20 sec and final extension 72°C-30 for 5 min at 72°C.
Purification of PCR fragments from foreign impurities was carried out using a set of reagents "ExoSap ITTM".
Determination of the direct sequence of nucleotide sequences of the its region was carried out in the Senger sequencer (Applied Biosystems , Genetic Analyzer 3500).
Bioinformatics analysis of data from sequencing and the search for homologous nucleotide sequences was carried out in the open genetic database GenBank and Bold Systems [9-10].
Results and discussion
To reduce the harmfulness of the disease, it is necessary to know the species composition and biological characteristics of pathogens. The species composition of fungal pathogens isolated from tomato plants has been established. They were identified by Alternaria from the type of immature fungi, Fusarium, Aspergillus from the type of ascomycetes. The determination of morphological signs of phytopathogens was carried out on a potato - dextrose nutrient medium.
Fusarium-colonies are fluffy, white in color. Macro and microconidia were detected under the microscope. Microconidia are 1-2-cell, rounded, Oval, sometimes slightly curved. The Shape of macronidias is sickle, elliptical. The cell at the edge is slightly narrowed, obtuse. Macroconidias are usually 3-5-cell. Dimensions: 20-60x4-7 microns [11].
Alternaria is a ubiquitous type of fungus that causes damage to agricultural products, including cereals, fruits, and vegetables, before and after harvesting. Several species of Alternaria are capable of producing secondary metabolites, which are considered phytotoxins that play an important role in plant pathogenesis and mycotoxins that can be harmful to humans and animals [12].
Aspergillus is a genus of fungi consisting of more than 300 identified mold species. Aspergillus is found in different environments because it reproduces well in environments with high humidity. The body of the fungus consists of mycelium. The mycelium consists of thin, tubular, pale colored, widely branched, thin-walled hyphae. Some hyphae branch out in the substrate, and some settle by penetrating the substrate to absorb the substance in the culture medium. Conidia are small spherical, unicellular, single-core or multi-core, black, brown or yellow-green in color. Conidia spread through air currents. They grow in a suitable substrate and produce a germ tube. The germ tube turns into a septum, branches and forms a mycelium [13].
Fusarium spp.
colony growth in a nutrient medium microscopic structure
Alternaria spp.
colony growth in a nutrient medium
microscopic structure
Aspergillus spp.
colony growth in a nutrient medium
microscopic structure
Figure 1-Morphological and microscopic features of mushrooms grown in a potato dextrose Agar
nutrient medium
It is known that identification by determinants is sometimes not accurate, as shown in Figure 1. In this regard, confirmation was carried out by molecular genetic methods for the identification of isolated phytopathogenic fungi to the species. Using the sequencing method, the nucleotide sequence of Fusarium, Alternaria, Aspergillus strains, the causative agents of tomato crop diseases, was determined.
The following research work was carried out on molecular genetic identification of selected fungies. The initial stage of any molecular genetic research is DNA sequencing. In this regard, in the research work, work was carried out to isolate genomic DNA from mycelial fungi.
At the first stage, work was carried out on the protocol proposed by commercial manufacturers of «Проба-ГС» (ООО «НПО ДНК-Технология», Russia) for DNA extraction. As a result of research, it was found that this protocol is effective in extracting DNA from mycelium fungi. Determination of the results of DNA isolation of micromycetes was carried out using the method of electrophoresis in 1% agarose gel. Using this commercial kit, genomic DNA was isolated (figure 2).
Figure 2 - DNA electrophoregram of fungi
The result of genomic DNA extraction was positive in all samples, as shown in Figure 2. For PCR, taxonomically important regions of the gene were transcribed using the iits internal transcribed spacer (ITS) factor ITS 1/ITS4 universal primers. In order to test PCR products, an electrophoregram of 1% agarose gel was performed. The expected size of the amplicon is 570 b.p.
(Figure 3).
u
L. j
1000 ж.н 750 ж.н 500 ж.н 250 ж.н
M SL1 SL2 SI3 SL4
Figure 3 - amplification of isolates with ITS1/ITS4 primers
Amplification with ITS1/ITS4 primers, as shown in Figure 2, resulted in amplicons of about 570 b.p., which corresponds to the size of the site.
Direct sequencing of nucleotide sequences of the ITS region (Applied Biosystems, Genetic Analyzer 3500) was carried out in accordance with the recommendations of the manufacturing company.
Comparison of the obtained nucleotide sequences with the available sequences in the GENEBANK database was carried out using the BLASTN program.
The results of phylogenetic analysis of the ITS region in the studied strains are presented in the form of phylogenetic trees built in the MEGA7 program using Neiighbor-Joining, a cluster method for calculating genetic distances.
А
MG594514.1 Fusarium equiseti OR136459.1 Fusarium equiseti • SL1
MK629373.1 Fusarium oxysporum AY387705.1 Fusarium oxysporum - MG594507.1 Fusarium fujikuroi
MG654673.1 Fusarium fujikuroi MT560206.1 Fusarium redolens MT560205.1 Fusarium redolens
-KJ125534.1 Fusarium chlamydosporum
OL832262.1 Fusarium tricinctum KX058548.1 Fusarium avenaceum KU852642.1 Fusarium avenaceum
MH582400.1 Fusarium solani EU329711.1 Fusarium solani
ч:
В
O N845669.1 Aspergillus flavus OR051631.1 Aspergillus flavus » SL2
■ MK429758.1 Aspergillus burnettii ■ NR 154725.1 Aspergillus hancockii
■ NR 184866.1 Aspergillus lanuginosus NR 121481.1 Aspergillus fumigatus
■ OL444887.1 Aspergillus niger I NR 077143.1 Aspergillus awamori NR 185394.1 Aspergillus verrucosus
IMZ901307.1 Aspergillus puulaauensis MT732782.1 Aspergillus puulaauensis MZ713409.1 Aspergillus nidulans O N680864.1 Aspergillus nidulans O N680864.1 Aspergillus nidulans(2)
■ EU982035.1 Aspergillus awamori
Figure 4-a phylogenetic tree built on the basis of the ITS region for the SL1 strain. The analysis included 9 typical strain sequences with NCBI stored in GenBank (a). A phylogenetic tree built on the SL2 strain based on ITS site. The analysis included 12 typical strain sequences with NCBI stored in GenBank (B)
As shown in the figure above (Figure 4), we see that the strain SL1 is linked in a unique branch to the nucleotide chains of the Fusarium equiseti and the strain SL2 to the shatms of Aspergillus flavus
А
MT560381.1 Fusarium oxysporum MT560342.1 Fusarium oxysporum • SL3
MG594514.1 Fusarium equiseti MT558569.1 Fusarium equiseti KX463000.1 Fusarium culmorum MG594507.1 Fusarium fujikuroi
DQ453703.1 Fusarium culmorum
MH582400.1 Fusarium solani JF740931.1 Fusarium solani MG654673.1 Fusarium fujikuroi
IMT560206.1 Fusarium redolens MT560204.1 Fusarium redolens
В
• SL4
OR214972.1 Alternaria alternata OR214971.1 Alternaria alternata OR206502.1 Alternaria alternata OP886854.1:36-518Alternaria alternate JF780937.1Alternaria simsimi
I JF417574.1 Alternaria panax JF417567.1 Alternaria panax
NR 166228.1Alternaria chlamydosporifera MH856084Alternaria gypsophilae
— FJ433875.1 Alternaria infectoria
KY009902.1 Alternaria infectoria
NR 166229.1 Alternaria aconidiophora
Figure 5-a phylogenetic tree built on the basis of the ITS site for the SL3 strain. The analysis included 6 Typical strain sequences with NCBI stored in GenBank (A). A phylogenetic tree built on the SL4 strain based on ITS reagion. The analysis included 13 typical strain sequences with NCBI stored
in GenBank (B)
So, the phylogenetic tree was compiled on the basis of the ITS site using the Neighbor-Joining (NJ) method. According to the results of molecular genetic analysis, strains were identified as follows: SLl-Fusarium equiseti, SL2 - Aspergillus flavus, SL3 - Fusarium oxysporum, SL4 -Alternaria alternata.
Conclusion
Tomato (Solanum lycopersicum) is the most widely used vegetable in the world. With a moisture content of 94.5%, that is, higher, this type of vegetable is infected with various pathogens. Many pathogenic fungi are the main object of study, as they are the main source of diseases that negatively affect the yield and quality of tomato fruits.
To carry out measures to combat diseases of tomato crops caused by pathogenic fungi, first of all, the correct identification of the pathogen is the most important event. In this regard, in our research work, we conducted a study of tomato crops with signs of the disease, combining traditional mycological and molecular genetic methods.
Tomato crops were carried out on tomato crops of the "Lamador" variety, grown in the Karasai District of the Almaty region. According to the conducted research, pure fungal cultures were isolated from tomato crops with signs of the disease and morphological and cultural properties of isolated isolates were described using traditional mycological methods. However, due to the fact that some diseases have similar external symptoms, it is difficult to accurately identify the pathogen. For this reason, it is currently considered effective to identify pathogens before the species through the use of molecular genetic methods. As a result of the study, two Fusarium species were identified among the isolates of the tomato crop: Fusarium equiseti and Fusarium oxysporum, Alternaria alternata, Aspergillus flavus.
Funding
The research was carried out in accordance with the work plan of the Ministry of Agriculture of the Republic of Kazakhstan 2021-2023. 267 under subprogram 101 "Program-targeted financing of subjects of scientific research and activities" of the budget program "Development of accessibility of science and scientific research" PTF "Development and improvement of integrated protection systems for fruit, vegetable, grain, fodder, legumes and plant quarantine". The authors thank their colleagues for their help in conducting these studies.
References:
1 Dominique Blanchard. Tomato Diseases Identification, Biology and Control. Second Edition, 2013. - 415 P. (https://books.google.kz/books?id=_Sc6_OjjXUC&printsec=frontcover&hl=ru&source=gbs_ViewAPI&r edir_esc=y#v=onepage&q&f=false)
2 O. A. Palastrova. Bolezni tomata i obosnovanie mer bor'by s nimi v uslovijah Kurganskoj oblasti: dissertacija / - Kurgan : KGSHA, 2006. - 153 s. (https://cyberleninka.ru/article/n/bolezni-tomata-i-obosnovanie-mer-borby-s-nimi-v-usloviyah-kurganskoy-oblasti/viewer)
3 O. A. Palastrova, A. S. Stepanovskih. Zashhita tomata ot boleznej v Zaural'e : monogr. / -Kurtamysh : Kurtamyshskaja tipografija, 2007. - 136 s. - ISBN 978-5-98271-079-6:99.8 (http://www.dslib.net/fito-patologia/bolezni-tomata-i-obosnovanie-mer-borby-s-nimi-v-uslovijah-kurganskoj -oblasti .html)
4 Ismailova Je. T. i dr. Morfologicheskie i molekuljarno-geneticheskie harakteristiki vozbuditelej osnovnyh gribnyh boleznej tomatov, proizrastajushhih v Almatinskoj oblasti //Vestnik KazNU, serija biologicheskaja.-2017.S.75
(chromeextension://efaidnbmnnnibpcajpcglclefindmkaj/https://elibrary.kaznu.kz/wpcontent/uploads/2021 /06/vestnik-kaznu.-seriya-biologicheskaya_2017-1-70.pdf)
5 Smoljanaja N.M. i dr. Vidovoj sostav osnovnyh vozbuditelej boleznej tomata. Sbornik materialov Vserossijskoj (nacional'noj) nauchno-prakticheskoj konferencii [Jelektronnyj resurs] : materialy Vseross. (nacional'noj) nauch.-praktich. konf., posvjashh. 100-letiju so dnja rozhdenija S. I. Leont'eva 2019 / - 488 s (https://agro.omgau.ru/nauka/sborniki-nauchnykh-statej/item/138-materialy-vserossijskoj-natsionalnoj-nauchno-prakticheskoj -konferentsii-posvyashchennoj - 100-letiyu-so-dnya-rozhdeniya-s-i-leonteva.html)
6 Dzhajmurzina A.A., Karbozova R.D., Eszhanov T.K., Umiralieva Zh.Z. Sistema zashhity tomata ot boleznej na Jugo-Vostoke Kazahstana // Zemledelie, agrohimija, kormoproizvodstvo, agrojekologija, lesnoe hozjajstvo // Izvestija. - 2012. - № 3. - S. 21-24 (doi: 10.37884/1-2022/08)
7 Egorov N.S. Praktikum po mikrobiologii. - M.: Izd-vo Moskva, 1976. - 307 s (https://studizba.com/files/show/djvu/2947-1-a-i-netrusov-m-a-egorov--praktikum-po.html)
8 White T.J. Amplification and direct sequencing offungal ribosomal DNA genes for phylogenetics / T.J. White, T. Bruns, S.B. Lee, J.W- Taylor // PCR Protocol a Guide to Methods and Applications.-Academic Press.- 1990.- N.Y.- P.315-322 (https://www.researchgate.net/publication/223397588_White_T_J_T_D_Bruns_S_B_Lee_and_J_W_Tay lor_Amplification_and_direct_sequencing_of_fungal_ribosomal_RNA_Genes_for_phylogenetics)
9 National Center for Biotechnology Information [Jelektronnyj resurs].-URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov (data obrashhenija 30.11.22)
10 Barcode of life data system [Jelektronnyj resurs].-URL: https://www.boldsystems.org(data obrashhenija 30.11.22)
11 Fusariumsolani. Jelektronnyj resurs: (https://www.pesticidy.ru/pathogens/Fusarium_solani)
12 A. Patriarca, G. Vaamonde, V.F. Pinto. Alternaría. Encyclopedia of Food Microbiology, 2017, Pages 14 (doi : 10.1007/978-1 -4939-6707-0_2)
13 Aspergillus: Habitat, reproduction and importance. Jelektronnyj resurs: (https://www.biologydiscussion.com/fungi/aspergillus-habitat-reproduction-and-importance-ascomycotina/24000)
