CC BY
57
УДК 611.018.4/.6:616-003.93:57.08
А.И. Лебедева
АЛЛОГЕННЫЙ ГУБЧАТЫЙ БИОМАТЕРИАЛ -
ИНГИБИТОР ФИБРОЗА ПОВРЕЖДЕННОЙ СКЕЛЕТНОЙ МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ
ФГБУ «Всероссийский центр глазной и пластической хирургии» МЗ РФ, Уфа
Контактная информация
Лебедева Анна Ивановна, к.б.н., старший научный сотрудник отдела морфологии адрес: 450075 Уфа, ул. Р. Зорге, 67/1; тел. (347)2934235 e-mail: ¡[email protected]
Статья поступила 23.09.2014, принята к печати 24.11.2014.
Резюме
Применение аллогенного губчатого биоматериала при глубоком повреждении скелетной мышцы способствует полному восстановлению дефекта. Продукты биодеградации биоматериала ингибируют профиброген-ную клеточную активность (TGF- В1, FGF-B, Vimentin) и снижают скорость коллагенообразования, тем самым стимулируют миогистогенез. В группе животных без использования биоматериала в результате заживления дефекта происходило образование рубца с дальнейшим перерождением в жировую ткань. Использовались гистологические, иммуногистохимические и электронномикроскопические методы исследования.
Ключевые слова: аллогенный губчатый биоматериал, регенерация, фиброгенные цитокины, скелетная мышечная ткань.
A.I. Lebedeva
ALLOGENEIC SPONGIFORM BIOMATERIAL
- FIBROSIS INHIBITOR OF THE DAMAGED SKELETAL MUSCULAR TISSUE
FSBI «Russian Eye and Plastic Surgery Center» of the Health Ministry of the Russian Federation, Ufa
Abstract
The use of allogeneic spongiform biomaterial in deep damaged skeletal tissue contributes to complete defect restoration. The biomaterial biodegradation products inhibit profibrogenic cellular activity (TGF-B1, FGF- B, Vimentin) and reduce collagen formation speed, thereby stimulate myohistogenesis. During the defect restoration process, scarring formation with further degeneration into adipose tissue took place in a group of animals when there were not used the biomaterial. Histological, immunohistochemical and electron microscopic methods of the investigation were used.
Key words: allogenic biomaterial sponge, regeneration, fibrogenic cytokines, skeletal muscle tissue.
Введение
Как правило, глубокие повреждения скелетной мышцы вызывают воспалительную реакцию, исходом которой является формирование рубца [3]. Существующие технологии коррекции мышечных дефектов - аутопластика, аллопластика, ксенопла-стика, клеточные технологии, генная терапия - являются трудоемкими, травматичными и сопряжены с осложнениями [2].
Одним из перспективных направлений в регенеративной медицине является тканевая инженерия с использованием биодеградируемых трансплантатов [4].
При их применении необходимо учитывать степень фиброзирования регенерата. Разработанные в ФГБУ «Всероссийский центр глазной и пластической хирургии» МЗ РФ биоматериалы Алло-плант (Патент РФ на изобретение №2189257, ТУ 9398-001-04537642-2011) изготавливаются из када-верной аллогенной волокнистой соединительной ткани, после имплантации биодеградируют, а продукты резорбции (коллаген и протеогликаны) являются эффективными биостимуляторами клеточных элементов и регуляторами паранхиматозно-стромальных взаимодействий [6; 7].
Цель исследования - определение фибро-генных факторов в скелетной мышечной ткани и раскрытие морфологических аспектов регенерации после пластики дефекта АГБ.
Материалы и методы
Для исследования использовали половозрелых аутбредных крыс линии Wistar обоего пола массой от 0,18 до 0,2 кг. Животные были получены из питомника лабораторных животных Рапполово. Работу проводили с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ Минвуза от 13 ноября 1984 г. №724). В контрольной группе (n=36) производилось выделение икроножной мышцы, а также малоберцового нерва, который не повреждали. В икроножной мышце моделировали дефект длиной 3-4 мм, который ушивали викрилом. В опытной группе (n=36) в аналогичный дефект укладывали АГБ соответствующих размеров и фиксировали викрилом. Из опыта животных выводили путем инсуффляции летальной дозы паров фторотана. Забор аутопсий-ного материала проводили через 3; 7; 14; 30; 60 и 90 суток после эксперимента. Кусочки ткани фиксировали в 10 %-ном р-ре нейтрального формалина, обезвоживали в серии спиртов возрастающей концентрации и заливали в парафин по общепринятой методике. Гистологические срезы готовили на микротоме LEICA RM 2145 (Германия), окрашивали гематоксилином и эозином, по Ван Гизону, по Маллори. Для иммуногистохимических исследований парафиновые срезы толщиной 4 мкм окрашивали с помощью иммуногистостейнера Leica Microsystems Bond™ (Германия).
В качестве первичных антител применяли: трансформирующий фактор роста B1 (TGF-B1), vimentin, фактор роста фибробластов Ы (FGF В1) в разведении 1:300 (Santa Cruz Biotechnology, США). Для демаскировки использовали непрямую стреп-тавидин-биотиновую систему детекции Leica BOND (Novocastra™, Германия). Оценку специфичности реакции проводили при окрашивании срезов без первичных антител. Подсчет клеток производили в 20 полях зрения каждого образца (n=6) при увеличении ><400. Исследование и визуализацию препаратов проводили с использованием микроскопа Leica DMD 108 (Германия) со специализированным программным обеспечением управления настройками и захвата изображения. Для электронномикроскопического исследования кусочки тканей фиксировали в 2,5%-ном растворе глютаральдегида, приготовленного на какодилат-ном буфере (рН 7,2-7,4) с дофиксацией в 1 %-ном растворе OsO4 на том же буфере. Материал обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и заливали в эпон-812 по общепринятой методике. Предварительно готовили полутонкие срезы толщиной 1 мкм, окрашивали их толуидиновым синим на 2,5%-ном растворе безводной соды. На данных срезах выбирали участки для электронно-микроскопического исследования. Полутонкие и ультратонкие срезы готовили на ультратоме ЕМ UC 7 (Leica, Германия). Ультратонкие срезы контрастировали 2%-ным водным раствором уранил-ацетата, цитратом свинца по Рейнольдсу и изучали в трансмиссионном микроскопе JEM-1011 (Jeol, Япония) при ускоряющем напряжении 80 kB. Для обработки числовых данных использовали параметрический дисперсионный анализ по Р. Фишеру при помощи критерия Fd и непараметрический (ранговый) дисперсионный анализ по Краскелу-Уоллесу с использованием для сравнения отдельных выборок рангового U-критерия [12].
Результаты и обсуждение
После резекции мышцы в контрольной группе через 7-14 суток стадия острого воспаления развилась до пролиферативной. Дефект замещался грануляционной тканью, представленной плотными пучками коллагеновых волокон, инфильтрированных макрофагами, фибробластическими и иммуно-генными клетками.
Среди клеток соединительной ткани преобладали клетки фибробластического ряда: мезен-химные клетки, юные фибробласты и зрелые фиб-робласты с активной коллагенсинтетической (кол-лагенобласты II типа) деятельностью (рис. 1).
На 21 сутки в месте дефекта выявлялись признаки трансформации грануляционной ткани в жировую. На фоне разрастания волокнистой соединительной ткани выявлялись как единичные жировые капли, так и их скопления (рис. 2).
В цитоплазме фибробластов помимо характерной хорошо развитой саркоплазматической сети наблюдались разнокалиберные липидные капли, которые накапливались и заполняли весь объем цитоплазмы, смещая ядро на периферию клетки (рис. 3). В патологической зоне в условия гипоксии и воспаления известна способность трансформации фибробластических клеток в адипоциты [1; 5].
Спустя 30 суток в результате заживления формировался неадекватный регенерат, состоящий из жировой и плотной волокнистой соединительной тканей. Данный исход был обусловлен актива-
цией деятельности клеток фибробластического дифферона с усиленной коллагенпродуцирующей активностью.
В опытной группе после имплантации АГБ в начальные сроки 3-7 суток в паратравматической зоне обнаруживались признаки острого воспаления, обусловленные механическими воздействиями, возникшими вследствие оперативного вмешательства. В центральной области трансплантата выявлялась сеть фибриновых волокон на фоне экссуда-тивного пропитывания. Через 7-14 суток фаза острого воспаления менялась на пролиферативную. Рыхлая сеть коллагеновых волокон, инфильтрированная макрофагальными и фибробластическими клетками разрасталась центростремительно - от периферии к центру. Фибробласты содержали суженные каналы ГЭР и классифицировались как коллагенобласты I типа - клетки с умеренным синтезом коллагена (рис. 4).
Через 14 суток АГБ подвергался постепенной биодеградации и резорбции фагоцитарными макрофагами, доля которых доминировала среди соединительнотканных клеток [8]. В зоне трансплантации формировался мышечно-соединительно-тканный регенерат с преобладанием васкуляризи-рованной рыхлой неоформленной волокнистой соединительной ткани. Наряду со стромальными клетками обнаруживались миогенные клетки, образующие почки роста и тяжи новообразованных тонких мышечных волокон, ориентированных вдоль вектора нагрузки, т.е. параллельно каналам предсуществующего АГБ (рис. 5).
Через 30 суток в очаге трансплантации обнаруживался мышечно-соединительнотканный регенерат с преобладанием мышечной ткани. А через 60-90 суток зона дефекта замещалась полноценной мышечной тканью, где пучки мышечных волокон были окутаны эндо- и перимизием (рис. 6).
Неравнозначный механизм заживления скелетной мышечной ткани в контрольной и опытной группах может быть обусловлен определенной ци-токиновой нагрузкой клеток гистиона. Цитокин TGF- ß1 оказывает противовоспалительный эффект и является промотором фиброза и иммуносупрес-сором - блокирует активацию лимфоцитов и макрофагов [14].
Его повышенное содержание в мышечной ткани приводит к ее дисрегенерации и атрофии [13]. При исследовании динамики клеток, секрети-рующих TGF-ß1, влияние фактора «наличия/отсутствия» АГБ в этом случае оказалось ничтожным, хотя и значимым (n2=2%, F=6,3, p<0,02). Наиболее сильное воздействие на количество данных клеток оказывал фактор времени - ^=40%, F=26, p<<0,0001 (табл. 1).
Через 3 суток количество TGF-ß1+-KreTOK в контрольной группе почти в 9 раз превышало численность таковых в опытной - 17,2±6,6 против 2±1,5. В контроле число клеток достигало максимума (в среднем 26,4±13,8) на 7 день и соответствовало накоплению фибробластических клеток в регенерате. А после имплантации АГБ пиковые значения TGF-ß1+-KreTOK наблюдались лишь через 14 суток (14,4±4,9), что в 1,8 раз меньше. Это могло способствовать задержке пролиферативной стадии воспаления и препятствовать накоплению коллагена в реактивной зоне. К данному сроку число клеток в контрольной группе значимо снижалось до 18,5±7,4 (p<0,02) и к 30 суткам резко падало до «следовых» значений (1,6±1,3), а через два месяца они не встречались вовсе.
Рис. 1. Коллагенобласт II типа с резко расширенными каналами ГЭР через 14 суток после нанесения дефекта в скелетной мышечной ткани. Электронограмма. Увеличение х 10 000.
Рис. 2. Формирование соединительнотканного регенерата с трансформацией в жировую ткань через 21 сутки после нанесения дефекта в скелетной мышечной ткани. Окраска гематоксилином и эозином.
Рис. 3. Преадипоцитарный фибробласт через 21 сутки после нанесения дефекта в скелетной мышечной ткани. Электронограмма. Увеличение х 6 000.
Рис.4. Юный фибробласт в контакте со зрелым коллагенобластом I типа через 7 суток после имплантации АГБ. Электронограмма. Увеличение х 4 000.
Рис. 5. Новообразованный соединительнотканно-мышечный регенерат с преобладанием соединительнотканного компонента в периферической зоне через 14 суток после имплантации АГБ. Окраска гематоксилином и эозином.
Рис. 6. Новообразованная мышечная ткань в зоне трансплантации АГБ спустя 30 суток. Окраска по Маллори.
Рис. 7. Динамика численности клеток после применения АГБ и в контроле, секретирующих. Ось ординат - среднее число клеток. ГДИ -границы доверительного интервала для средних, ±СО - стандартная ошибка среднего значения.
а: ТСБ- В1+, б - РОР-В1+ , в: У1шеп1ш+. Ось абсцисс - дни.
Изменение количества TGB-B1+^ клеток в опытной и контрольной группах
Таблица 1
TGF-B1 3 суток 7 суток 14 суток 30 суток 2 мес 3 мес
АГБ 2±1,5 10,5±6,1 14,4±4,9 11,1 ±9,2 6,3±3,3 2,3±0,8
Контроль 17,2±6,6 26,4±13,8 18,5±7,4 1,6±1,3 0 0
Таблица 2
Изменение количества РОР-Ь1 + клеток в опытной и контрольной группах___
FGF-b1 3 суток 7 суток 14 суток 30 суток 2 мес 3 мес
АГБ 2,2±1,1 11,6±8,9 1,9±1,3 1,3±0,9 1,2±0,9 0,4±0,5
Контроль 26,1±5,2 36±11,4 8,3±4,0 1,5±1,5 0 0
Таблица 3
Изменение количества vimentin + клеток в опытной и контрольной группах___
vimentin 3 суток 7 суток 14 суток 30 суток 2 мес 3 мес
АГБ 1,2±0,6 2,7±1,5 0,6±0,5 1,1 ±0,7 0,4±0,5 0,3±0,4
Контроль 22±6,6 24,1 ±4,5 25,1±9,2 0,9±0,7 0 0
После применения АГБ снижение численности ТОБ-В1 -клеток наблюдалось в период 30-90 суток и носило пролонгированный (2,3±0,8) характер (критерий Краскела-Уоллеса в опыте х2=33, р<< 0,0001, в контроле ^13,6, р<0,004 (рис. 7, А)). Подобная динамика способствовала увеличению длительности регенерационного периода, что вероятно содействует индукции всех элементов мышечной ткани.
БОГ-В1 известен как мощный стимулятор ангиогенеза, пролиферации и роста фибробластов, отвечающих за секрецию экстраклеточного мат-рикса [11]. Численность БОГ-В1 -клеток в период 0-30 суток зависела как от фактора наличия/отсутствия (контроль) АГБ (^2=26%; Б= 115,8,
р<<0,0001), так и от сроков наблюдения (^2=42%, Б=61,5, р<<0,0001). Достаточно выраженным оказалось сочетанное влияние обоих факторов (^2=16%, Б=23,2, р<<0,0001). Различие значений в опыте и в контроле состояло не в динамике изменения количества БОГ-В1 -клеток во времени, а в уровне этих изменений (табл. 2). Через 3 суток после начала эксперимента количество БОГ-В1 -клеток после имплантации АГБ и в контроле составляло 2,2±1,1 и 26,1 ±5,2 соответственно, т.е. различалось практически на порядок. На седьмой день число клеток параллельно друг другу увеличивалось, но различие между обеими группами продолжало оставаться троекратным (11,6±8,9 и 36±11,4 соответственно).
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ АЛЛОГЕННЫЙ ГУБЧАТЫЙ БИОМАТЕРИАЛ... 43
На 14 день среднее число FGF-b1-клеток в Проведенные исследования показывают, что опытной группе снижалось до первоначального в контрольной группе в пролиферативной фазе уровня и выходило на «фазу плато» (1,9±1,3), а в воспаления наиболее активной является фибробла-контроле оказалось ниже исходного уровня стическая деятельность. Выраженная экспрессия (8,3±4,0) в три раза, но по-прежнему оставалось FGF-ß1+-^eTOK и TGF-ß+-KreTOK в ранней стадии многократно выше, чем после применения АГБ. заживления сопровождалась усиленной миграцией Однако через 1 месяц после начала эксперимента мезенхимных клеток и поддержке их дифферен-численность FGF-ß1+-KreTOK в опыте и контроле не циации в фибробластические клетки - коллагеноб-снижалась, а выравнивалась, составив соответст- ласты II типа. Данные аспекты способствовали ин-венно 1,3±0,9 и 1,5±1,5 (U-критерий: Z=0,04, тенсивному синтезу коллагеновых волокон и стре-p>0,96). Критерий Краскела-Уоллеса был высоко мительному фиброзированию мышечного дефекта значим: опыт - х2=3б,8, p<<0,0001, контроль - с последующим перерождением в жировую ткань Х2=33,7, p<<0,0001 (рис. 7, Б). Высокая концентра- за счет трансформации фибробластов в адипоциты. ция FGF-ß1+ клеток в контрольной группе обуслав- Установлено, что in vitro экстракты биомате-ливает развитие гранулематозной ткани с домини- риала "Аллоплант" являются ингибитором клеточ-рованием в гистионе фибробластоподобных клеток, ной пролиферации, в частности - фибробластов особенно в период 7 суток. [10]. А in vivo происходит дозированная экстракция За усиление междифферонной гетероморфи- гиалуроновой кислоты и сульфатированных ГАГ-рии тканевых элементов в реактивной зоне мышеч- ов (дерматан- и кератансульфатов) из АГБ, которые ного регенерата и экспрессию профиброгенных играют структурно-информативную роль для фиб-факторов могут отвечать Vimentin1+ клетки [9]. При робластов через посредничество макрофагов и ре-исследовании численности Vimentin+-KreTOK фак- гулируют паренхиматозно-стромальные взаимоот-тор «наличия/отсутствия» АГБ оказывал менее вы- ношения [7]. После применения АГБ в регенерате раженное влияние (1^=27%, F=278, p<<0,0001). Бо- определялось низкое/умеренное содержание FGF-лее существенным было влияние фактора времени ß1 -клеток и TGF-ß+-KreTOK, чему способствовал и сочетанное действие обоих факторов: ^=34%, дефицит Vimentin+-KreTOK. Таким образом, для F=69, p<<0,0001 и ^2=29%, F=59, p<<0,0001 coot- полноценной регенерации скелетной мышечной ветственно. Количество Vimentin+-клeтoк в кон- ткани актуально не только стимулирование резерв-троле значительно превышало таковое в опытной ного пула миопрогениторных клеток, а подавление группе в период 0-14 суток и соответствовало раз- профиброгенных факторов, способствующих избы-витию провизорной недифференцированной грану- точному коллагеногенезу. Следовательно, продук-лематозной ткани с наличием обильной сосудистой ты резорбции трансплантата создают микроокру-сети и малодифференцированных мезенхимных и жение, которое оказывает селективное воздействие зрелых фибробластических клеток (табл. 3). К 30 на миграцию и пролиферацию фибробластических суткам число таких клеток в контрольных препара- клеток и индуцирует резервный пул миопрогени-тах резко снижалось с практически стабильных торных клеток. 22±6,6; 24,1±4,5 и 25,1±9,2 на 3-й, 7-й и 14-й день наблюдений до «следового» уровня 0,9±0,7 и фак- Выводы тически совпадало с таковым в опытных препаратах в тот же срок - 1,1±0,7. 1. При заживлении глубоких повреждений Резкое снижение массы клеточных элемен- скелетной мышечной ткани выявляется тов может быть обусловлено накоплением стро- выраженная экспрессия профиброген-мальных элементов - коллагена и жирового пере- ных цитокинов FGF-ß1+ и TGF-ß+, кото-рождения. Через 60-90 дней в контрольной группе рая способствует стремительному синте-Vimentin+-KreTKH не обнаруживались (критерий зу коллагеновых волокон и замещению Краскела-Уоллеса - %2=60, p<< 0,0001). После им- дефекта рубцом с последующей трансплантации АГБ Vimentin+-KreTKH выявлялись в формацией его в жировую ткань. Рост и следовых количествах: через 3 суток - 1±0,5; 7 су- поддержка незрелого регенерата осуще-ток - 3±1,5 (p<0,002); 14-90 суток - 0,5±0,5 ^ 1±0,5. ствляется за счет Vimentin+-клeтoк. Критерий Краскела-Уоллеса показал высокую зна- 2. После применения АГБ исходом зажив-чимость результатов - %2=22, p< 0,0005 (рис. 7, В). ления является восстановление скелет- Слабое проявление мезенхимной реакции ной мышечной ткани. Продукты резорб-может служить признаком зрелости регенерата. Но ции служат супрессором факторов фиб-ее длительность значительно превосходила кон- роза в скелетной мышечной ткани -трольную группу, что могло вызвать развитие рых- FGF-ß1+-, TGF-ß+- и Vimentin+-клeтoк, лой соединительной ткани на всем протяжении за- тем самым, индуцируя развитие всех мещения АГБ. элементов мышечной ткани. Литература 1. Бозо И. Я., Деев Р. В., Пинаев Г. П. "Фибробласт" - специализированная клетка или функциональное состояние клеток мезенхимного происхождения? // Цитология. - 2010. - Т. 2, № 52. - С. 99-109. 2. Булякова Н.В., Азарова B.C. Морфофункциональные особенности тимуса и мышечных регенератов при воздействии лазерного излучения и аллопластики мышечной ткани взрослого животного в область мышечной травмы // Известия РАН. Серия биологическая. - 2009. - № 1. - С. 18-26. 3. Данилов Р.К. Раневой процесс: гистогенетические основы. СПб: ВМедА им. С.М. Кирова, 2008. -308 с. 1Vimentin - белок промежуточных филаментов мезенхимных клеток соединительной ткани, к которым относятся клетки фибробластического дифферона, эндотелиоциты.
№ 4/том 13/2014 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
4. Зорин В.Л., Черкасов В.Р., Зорина А.И., Деев Р.В. Характеристика мирового рынка клеточных технологий // КТТИ. - 2010. - № 3. - С. 96-115.
5. Киселева Е. В., Чермных Э. С, Воротеляк Е. А. и др. Сравнение дифференцировочных потенций фиб-робластоподобных клеток стромы костного мозга, жировой ткани, волосяного сосочка и фибробла-стов дермы человека // Цитология. - 2009. - Т. 1, № 51. - С. 12-9.
6. Лебедева А.И. Структурно-функциональная характеристика макрофагов, выявленных при имплантации биоматериалов (экспериментально-морфологическое исследование): Авторефер. дис... канд. биол. наук. - Уфа, 2004. - 23 с.
7. Лебедева А.И. Регуляция паренхиматозно-стромальных взаимоотношений при коррекции дефектов скелетной мышцы аллогенным биоматериалом // Экспериментальная и клиническая дерматокосме-тология. - 2014. - № 1. - С. 51-6.
8. Лебедева А.И., Муслимое С.А., Мусина Л.А., Гареев ЕМ. Роль резидентных макрофагов в регенерации скелетной мышечной ткани, индуцированной биоматериалом Аллоплант // Биомедицина.. -2014. - № 2. - С. 43-50.
9. Минин A.A., Молдавер М.В. Виментиновые промежуточные филаменты и их роль во внутриклеточном распределении органелл // Успехи биологической химии. - 2008. - Т. 48. - С. 221-5.
10. Мулдашев Э.Р., Уимен Т.Дж., Курчатова H.H. и др. Влияние экстракта трансплантата для пластики века серии Аллоплант на синтез ДНК в культуре клеток // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1994. - №1. - С. 75-9.
11. Пальцев М.А., Иванов A.A. Межклеточные взаимодействия. - М.: Медицина, 1995. - 224 с.
12. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. - М.: МедиаСфера, 2002. - 312 с.
13. Burks T. N., Cohn R. D. Role of TGF-b signaling in inherited and acquired myopathies // Skeletal Muscle. -2011. - P. 1-19.
14. Yoshimura A., Muto G. TGF-ß function in immune suppression // Curr Top Microbiol Immunol. - 2011. -350. - P. 127-147.
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИИ
АГБ
аллогенные губчатые биоматериалы
ГЭР - гранулярный эндоплазматический ретикулюм
