CC BY
20
УДК 544.653.3
Ш. А. Шермухамедов, С. А. Понкратова
АЛГОРИТМЫ КОМПЬЮТЕРНОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ И ПОДСЧЕТА ДРОЖЖЕЙ
В МИКРОФОТОГРАФИЯХ
Ключевые слова: алгоритмы, дрожжи, микроскопия, микрофотографии.
Разработан метод обработки цифровых изображений получаемых фотографированием дрожжевых суспензий под микроскопом. С помощью различных морфологических фильтров, и методом сравнительного анализа, определили характеристики исследуемых проб, определили количественное содержание дрожжевых клеток в исследуемых пробах.
Key words: algorithms, yeast, microscopy, micro photos.
The method of processing digital images obtained by photographing the yeast suspensions under a microscope. Using different morphological filters, and a method of comparative analysis, identified the characteristics of testing samples, identified the quantitative content of the yeast cages in the testing samples
Введение
При производстве спирта основным компонентом технологического процесса служат спиртовые дрожжи, требующие большого внимания и ответственного отношения обслуживающего персонала, что возможно только при помощи микроскопического анализа, как отдельных клеток, так и дрожжевой популяции в целом. По внешнему виду клеток можно определить физиологическое состояние дрожжей и внести коррективы в технологический процесс. Процесс культивирования дрожжей требует внимательного наблюдения за состоянием дрожжей и наличием посторонних микроорганизмов по всем участкам производства. Микробиологический контроль над состоянием дрожжевых клеток на стадиях их размножения в качалочных колбах и биореакторах определяют прямой микроскопией. Существующие методики позволяют проводить необходимый микроскопический анализ, но без определенной практики сложно идентифицировать полученные данные микроскопического анализа и регламентных показателей технологического процесса. Автоматизация идентификации микроорганизмов способствует ускорению процесса анализа и уменьшению затрат на различные ресурсы.
Экспериментальная часть
Микроскоп - незаменимый прибор при производстве с использованием микроорганизмов и без него невозможно эффективное ведение технологического процесса. С его помощью следят за состоянием клеток и определяют:
• количество почкующихся клеток;
• количество мертвых клеток;
• наличие цепей и ветвистых форм;
• наличие посторонних микроорганизмов;
• содержание гликогена в клетках.
Обычно исследуемые пробы дрожжевой суспензии имеет высокую концентрацию, поэтому необходимо разбавление их в разных объемных соотношениях. В противном случае, идентификация клеток вручную занимает много времени и увеличивается погрешность измерения. Обойти эти недостатки можно с помощью современных технологий, исполь-
зуя специальные прикладные программные обеспечения. В настоящее время в данной области существует ряд разработок программно-аппаратных комплексов [1-3], в том или ином объеме реализующих задачу распознавания и подсчета клеток в биологических средах.
Однако специфичность клеточной культуры и условия микрофотографирования (рис.1) затрудняют использования этих программных комплексов, и возникает необходимость разработки новых или изменение существующих алгоритмов идентификации объектов изображения.
а б
Рис. 1 - Образцы изображений полученных в биотехнологической лаборатории: а) Дрожжи 8ассЬагошусез сегеу1з1ае; б) Бактерии пробио-тики
При работе с изображениями, всегда удобно обрабатывать (подсчитывать клетки, определять их геометрические характеристики) бинарные (черно-белые) изображения. Однако не всегда цветные микрофотографии удается преобразовать в бинарное изображение.
Основные трудности, возникающие при этом:
• наличие разделяющихся клеток;
• слипание нескольких клеток;
• наличие посторонних объектов (питательные вещества, посторенняя микрофлора);
• малая интенсивность фона.
Целью данной работы является создание универсального способа и автоматизированной системы распознавания и подсчета клеток [4], способной анализировать клеточный состав различных микробио-
логических сред с высокой скоростью и точностью, в том числе и за счет способности разделять близко расположенные клетки, не требующей наличия у персонала специальных знаний в области математики и программирования.
Модельные расчеты проводились на основе оригинального кода, написанного с помощью программного пакета Matlab, Image Processing Toolbox [5].
Результаты и обсуждение
В нашей работе были, использованы образцы изображений полученных в экспериментальных процессах в лаборатории «Инженерные проблем биотехнологий» спиртовых дрожжей Saccharomyces cere-visiae расы XII [6] и морфологические методы для улучшения качества изображения. Для устранения выше указанных трудностей, исследуемые изображения клеток обрабатывали путем выделения и определения внешних и внутренних границ отдельных объектов, разделяя (расслаивая) изображения на несколько сегментов и размывая однородность фона.
В таблице 1 приведен список дополнительно использованных морфологических фильтров, встроенных в пакет «Image Processing Toolbox» [7, 8], а на рис. 2 показана блок схема алгоритма идентификации дрожжевых клеток.
Таблица 1 - Список использованных морфологических фильтров встроенных в пакет «Image Processing Toolbox»
Функция Используемый вид фильтра Описание фильтра
Bwmorph bridge, clean, dilate, spur, thicken Применяет определенную морфологическую операцию к бинарному изображению.
Adapthisteq CLAHE Увеличивает контраст изображения по шкале яркости (СЬЛИБ).
Fspecial unsharp Создает двумерный фильтр указанного типа.
Imfilter fspecial Фильтрует многомерный образец с многомерным фильтром, формируемым fspecial.
Graythresh graythresh Вычисляет глобальный порог (уровень). Порог -нормализованное значение интенсивности, которое находится в диапазоне [0, 1]
Так как считываемые изображения полноцветные (рис. 3а), то они считываются в виде RGB массива, то есть считывается как трехмерный массив M x N x 3, где, M и N - высота и длина изображения (в пикселях), и 3 - красная, зеленая и синяя состав-
ляющие. Такое представление изображений упрощает их обработку.
Следующим этапом работы было определение числового значения средней интенсивности, которое позволяет предварительно определить объекты на изображении.
Дальше изображение делили на слои по RGB составляющим и параллельно обрабатывали каждый из них.
Рис. 2 - Блок схема алгоритма
Первый слой изображения обрабатывали по красной составляющей (рис. 3б). Параллельно этому проводили обработку относительно контраста, с применением комплекса морфологических фильтров (рис. 3в). Далее изображения накладывали друг на друга (рис. 3г) и выделяли отдельные клетки.
Полученное бинарное изображение позволяет сосчитать количество клеток в исследуемом образце. Кроме того упрощается исследование различных статистических характеристик пробы, такие как распределение частиц по размерам, средний возраст микроорганизмов в пробе и другие.
Q> в <?> &
б)
® © & ° О
распознано - 21
©
©
©
0
д е
Рис. 3 - Изображения соответствующие каждому этапу обработки микрофотографий с дрожжами: а) исходное изображение дрожжевой суспензии; б) бинарное изображение по Я составляющей; в) бинарное изображение после обработки комплексом морфологических фильтров; г) результат наложения (б) на (в); д) Выделенные из (г) клетки дрожжей; е) Вывод результатов подсчета клеток
При окончании всех этапов работ получаем разноцветное изображение с отмеченными красными точками дрожжевых клеток и в верхней части изображения их количество.
Выводы
По результатам обработанных экспериментальных изображений следует, что данный алгоритм достаточно точно определяет количественные характеристики изображений с дрожжами.
В перспективе планируется продолжить работы и расширить тип обрабатываемых изображений -распознаваемых клеток, с помощью усовершенствованных методов обработки изображения, таких как
© Ш. А. Шермухамедов - студент группы 613111, каф. химической кибернетики КНИТУ, 2shermux@gmail.com; А. С. Пон-кратова - доцент той же кафедры.
© S. A. Shermukhamedov - student, Department of Chemical Cybernetics, KNRTU, 2shermux@gmail.com; A. S. Ponkratova -candidate of chemical science, associate Professor Department of Chemical Cybernetics, KNRTU.
преобразование Хафа (Hough Transform) [9], детектор границ Кэнни [10] и разработать методы построения диаграмм распределения клеточных культур по их размеру, на основе получаемых микрофотографий.
Благодарности
Авторы выражают глубокую благодарность Ва-леевой Розе Тимуровне за предоставленные экспериментальные материалы и за помощь при написании этой статьи, а также Шавалееву Марату Фари-довичу за ценные советы и замечания.
Литература
1. Ali Ajdari Rad, Karim Faez, Navid Qaragozlou, Proc. Vllth Digital Image Computing: Techniques and Applications (Sydney, Australia December 10-12, 2003). Dicta 2003, 879-887
2. Michael.D. Abramov, Paulo J. Magalhaes, Suranda J. Ram, "Image processing with ImageJ." Biophotonics International -- Photonic solutions for Biotechnology & Medic, 2004. 36-42
3. Jairo Silva Francisco, Heleno Pinto de Moraes; Eliane Pedra Dias. " Evaluation of the Image-Pro Plus 4.5 software for automatic counting of labeled nuclei by PCNA immunohis-tochemistry" Braz. oral res. vol.18 no.2 Sao Paulo 100-104 (2004);
4. Лихтенберг, Л.А. Атлас производственных дрожжей Saccharomyces cerevisiae расы XII / Л.А. Лихтенберг, Е.А. Двадцатова, В.С. Чередниченко. - М.: Пищевая промышленность, 1999. - 24с.
5. C. M. Thompson and L. Shure. Image processing toolbox [for use with Matlab]. The Math Works, Natick, Massachusetts , (10101), 1995;
6. Валеева Р.Т., Понкратов А.С., Мухачев С.Г., Нуретди-нова Э.И., Шурбина М.Ю. Исследование процессов роста спиртовых дрожжей на сернистокислот-ных гидро-лизатах смеси пшеничной соломы и отрубей // Вестник Казанского технологического университета, 2014, Т.17 №16, С.170 - 172.
7. Lam, L., Seong-Whan Lee, and Ching Y. Suen, "Thinning Methodologies-A Comprehensive Survey," IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence, Vol 14, No. 9, 879 (1992).
8. Zuiderveld, Karel. "Contrast Limited Adaptive Histograph Equalization." Graphic Gems IV. San Diego: Academic Press Professional, 1994. 474-485.
9. Gonzalez, R.C. and Woods, R.E., Digital Image Processing, Prentice Hall, 587-285 (1993).
10. John Canny. " A Computational Approach to Edge Detection." IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence,, vol. PAMI-8, NO. 6, 679-698 (1986).
г
