CC BY
1Н.И. Хамнаева, д-р техн. наук, проф., e-mail: hni@bk.ru В.Д. Олмоева, канд. техн. наук, доц.,e-mail: valius@yandex.ru Восточно-Сибирский государственный университет технологий и управления, г. Улан-Удэ
УДК 579.674
АКТИВНЫЙ ДРОЖЖЕ-БАКТЕРИАЛЬНЫЙ КОНСОРЦИУМ МИКРООРГАНИЗМОВ
ДЛЯ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ С ФУНКЦИОНАЛЬНЫМИ СВОЙСТВАМИ
Изучена возможность получения дрожже-бактериального консорциума микроорганизмов на молочном сырье с использованием штаммов лактозосбраживающих дрожжей, выделенных из экосистем Забайкалья, живых клеток микробной ассоциации кефирных грибков и чистых культур ацидофильной палочки. Для культивирования микробных клеток использован химический состав природной минеральной воды, что позволило обеспечить активность, устойчивость клеток лактозосбражива-ющих дрожжей. Проведено исследование сочетаемости компонентов дрожже-бактериального консорциума и антибиотической активности разработанного консорциума. Доказана сочетаемость дрожжевых клеток, клеток ацидофильной палочки, микробной ассоциации кефирных грибков. Разработанное соотношение культур дрожже-бактериального консорциума обеспечивает его устойчивость к условно-патогенной микрофлоре (E. coli). Приведены данные о накоплении витаминов В1, Вб и фолиевой кислоты в дрожже-бактериальной взвеси, полученной после процесса культивирования микробного консорциума на модифицированной питательной среде. Исследована хранимоспособность консорциума микроорганизмов.
Ключевые слова: консорциум микроорганизмов, продукты питания функционального назначения, лактозосбраживающие дрожжи, питательная среда, условия культивирования, сочетаемость, антибиотическая активность, хранимоспособность.
N.I. Khamnaeva, Dr. Sc. Engineering, Prof.
V.D. Olmoeva, Cand. Sc. Engineering, Assoc. Prof.
ACTIVE YEAST-BACTERIAL MICROBIAL CONSORTIUM FOR PRODUCTION OF FOOD WITH FUNCTIONAL PROPERTIES
The work considers the possibility of yeast-bacterial microbial consortium production using milk raw material and lactose fermenting yeasts (from Transbaikalia region), cells of microbial association of kefir grains and Lactobacillus acidophilus. They use the chemical composition of the natural mineral water for the cultivation of microbial cells, which provides activity, resistance of lactose fermenting yeasts. The work studies the compatibility of yeast-bacterial consortium components and antibiotic activity of its consortium. It proves the compatibility of the yeast cells, cells of Lactobacillus acidophilus, microbial associations of kefir grains. The mix of yeast-bacterial consortium provides its resistance to pathogenic microflora (E.coli). It provides the data on the synthesis of vitamins Bi, B2 and folic acid in yeast-bacterial suspension after the cultivation of the microbial consortium on a modified nutrient medium. The storage stability of the consortium of microorganisms is studied.
Key words: consortium of microorganisms, functional food, lactose fermenting yeasts, nutrient medium, culture conditions, compatibility, antibiotic activity, storage stability.
Введение
Для реализации Концепции государственной политики в области питания населения Российской Федерации до 2020 г. необходимо разработать широкий спектр функциональных продуктов, содержащих ингредиенты, которые приносят пользу здоровью человека, повышают сопротивляемость заболеваниям, улучшают многие физиологические процессы в организме человека, позволяя ему долгое время сохранять активный образ жизни.
Дрожжевые клетки обладают лакто- и бифидогенным, а также сорбционными свойствами и при попадании в кишечник стимулируют рост собственной микрофлоры организма.
В процессе ферментации пищевых субстратов дрожжи обогащают их физиологически активными веществами (1, 2). Не менее актуальной проблемой является поиск новых направлений переработки вторичных ресурсов, образующихся в молочном производстве, из которых значительная часть используется неэффективно, тем самым нанося огромный урон окружающей среде. Особый интерес представляют региональные природные минеральные воды - источники ценных физиологически активных веществ. Усиление функциональных свойств пищевых продуктов - одно из приоритетных направлений для расширения ассортимента и решается путем использования гетеро- и гомоферментативных микроорганизмов, включая пробио-тические микробные клетки Lactobacillus acidophilus 317/402 и дрожжевые культуры, выделенные в Байкальском регионе (3). В связи с этим актуальной и целесообразной является разработка технологии ферментированной основы из молочного сырья с функциональными свойствами на основе дрожже-бактериального консорциума.
Целью исследования является разработка активного дрожже-бактериального консорциума микроорганизмов для получения пищевых продуктов с функциональными свойствами.
Материалы и методы исследования
Объектами исследований служили штаммы лактозосбраживающих дрожжей, выделенные из спонтанных микробных цинозов молочного сырья (заявка о выдаче патента РФ № 2008129628), микробная ассоциация кефирных грибков (А.с. РФ № 1622086), чистые культуры ацидофильных палочек (штамм L. acidophilus 317/402). При проведении экспериментов использовали общепринятые и современные физико-химические, биохимические и микробиологические методы исследований. Титруемую кислотность определяли стандартными методами; антибиотическую активность - методом последовательных разведений по методике М.С. Полонской; количественный учет термофильных и мезофильных лактобактерий - на твердой питательной среде при температуре 40 и 30 °С соответственно; количество дрожжей, сбраживающих лактозу - на картофеле-лактозном агаре; количество дрожжей не сбраживающих лактозу - на среде Сабуро; количество клеток ацидофильной палочки - методом предельных разведений по ТУ 9229-083-00419785-97 «Гидролизованное молоко с агаром»; наращивание биомассы - по оптической плотности фотоколориметричеким методом на концентрационном фотоэлектрическом колориметре КФК-2 при длине волны Х=550 нм; морфологию клеток - окрашиванием метиленовой синью и по Граму. Спектрофотометрию культуральных жидкостей проводили с помощью ИК-Фурье спектрометра Nicolet-380. Содержание витаминов определяли с помощью системы капиллярного электрофореза «Капель- 105М» ЦКП «ВСГУТУ». Статистическую обработку результатов исследований проводили в пакете Statistica 12.0.
Результаты исследования и их обсуждение
При составлении питательной среды для получения чистой культуры микроорганизмов особое внимание уделяется содержанию в среде доступных источников азотистых веществ, углеводов и ростовых факторов, включая минеральные вещества. Анализ физиологических компонентов (значение рН, уровень общей минерализации - 4100,7 мг/л; отсутствие ингибиторов метаболизма микробной клетки - хлор, ртуть, мышьяк, свинец) природной минеральной воды Забайкалья позволил выбрать ее в качестве источника минерального питания для культивирования эу- и прокариотических микробных клеток. При этом за основу была использована среда Сабуро - элективная питательная среда для получения дрожжей. Стандартный состав включает 95 % дрожжевого перевара (80 г прессованных дрожжей на 1 л водопроводной воды), 1% пептона, 4% глюкозы. Проведены исследования по подбору компонентов питательной среды для культивирования лактозосбраживающих дрожжей на основе использования потенциала природных ресурсов. Зависимость выхода биомассы характеризовали по общему микробному числу У1 и количеству активных микробных клеток У2 от количества прессованных дрожжей Х1, минеральной воды Х2 исследовали экспериментально-статистическими методами в несколько этапов.
Экспериментально-статистическим методом изучали зависимость выхода биомассы. Технологический процесс производства питательной среды с введением минеральной воды осуществляется в следующей последовательности: жидкая фракция питательной среды, в которой 50% заменено природной минеральной водой Забайкалья с минерализацией 4,1 г/л используется для приготовления дрожжевого перевара. Количество азотистых веществ составляет 10-12 г на 1 л жидкой фракции. Затем дрожжевой перевар фильтруют и стерилизуют, добавляют 4% лактозы, 1% пептона, перемешивают, повторно стерилизуют, охлаждают. Характер изменения общего микробного числа имеет следующий вид:
Y2 = 3,6205-0,0966*х-0,0807*у+,3856*х*х-0,2168*х*у-0,4076*у*у. (1)
Характер изменения количества активных клеток имеет вид:
Y2 = 3,348-0,1874*х+0,0022*у-0,4237*х*х-0,3634*х*у-0,0202*у*у. (2)
Микрокартина клеток активной биомассы лактозосбраживающих дрожжей, полученных на разработанной среде, представлена на рисунке 1. Из рисунка видно, что по морфологическим свойствам полученные клетки дрожжей не отличаются от клеток, полученных на традиционной среде Сабуро. Клетки дрожжей характеризуются овальной, сферической, изредка цилиндрической формой, почкование одностороннее, расположение одиночное, в парах, редко в маленьких пучках или склеенных массах. Размеры клеток составляют (3,3-3,7)х(4,1-4,5) мкм.
Рисунок 1 - Сканирующая электронная микроскопия дрожжей: а - контроль (увеличение 7000); б - опыт (увеличение 7000); в - контроль (увеличение 10000); г - опыт (увеличение 10000)
Характер роста клеток на твердой питательной среде представлен на рисунке 2. Культу-ральные свойства лактозосбраживающих дрожжей, выращенных на картофеле-лактозном агаре, характеризуются поверхностными круглыми колониями серовато-белого цвета с ровными краями, пастообразной консистенции.
а - контроль б - опыт
Рисунок 2 - Культуральные свойства лактозосбраживающих дрожжей
В ходе дальнейших исследований методом ИК-спектроскопирования был изучен качественный состав культуральной жидкости, полученной при культивировании лактозосбражи-вающих дрожжей на среде Сабуро (контроль), и на разработанной питательной среде (опыт). Полученные спектры приведены на рисунке 3.
Рисунок 3 - ИК-спектр культуральной жидкости, полученной после культивирования лактозосбраживающих дрожжей на питательной среде
Анализ спектров образцов культуральной жидкости, полученной после культивирования лактозосбраживающих дрожжей, свидетельствует о том, что наибольшую активность проявляли штаммы, полученные на разработанной питательной среде.
Подбор условий культивирования лактозосбраживающих дрожжей проводили в соответствии с двухфакторным экспериментом. При этом исследовали зависимость выхода биомассы, степени утилизации лактозы от температуры и дозы посевного материала.
Уравнения регрессии, адекватно описывающие зависимости выхода биомассы (3) и степени утилизации лактозы (4) от изучаемых факторов, имеют вид уравнений второго порядка.
Y1 = -67,24+4,8008*х+4,975*у-0,0788*х*х-0,0454*х*у-0,1975*у*у; (3)
Y2=14,2-0,6988*x-1,1234*y+0,0124*x*x+0,0028*x*y+0,0643*y*y. (4)
Графические интерпретации зависимостей в виде поверхностей отклика представлены на рисунках 4, 5.
Рисунок 4 - Зависимость выхода биомассы Рисунок 5 - Зависимость степени
от температуры культивирования и дозы утилизации лактозы от температуры
посевного материала культивирования и дозы посевного материала
Наилучшими параметрами процесса культивирования выявлены температура 25 °С и доза посевного материала 5%. Полученные данные легли в основу технологии производства активного инокулята лактозосбраживающих дрожжей.
Проведены исследования возможности создания дрожже-бактериального консорциума. Для культивирования дрожже-бактериального консорциума использовали новую питательную среду. Доза вносимого инокулята составила 5 % от объема питательной среды. В качестве контроля использовали инокулят лактозосбраживающих дрожжей, полученный при культивировании на разработанной питательной среде. Результаты исследований представлены на рисунках 6, 7.
Анализ полученных кривых свидетельствует о наибольшей активности консорциума с соотношением культур 1 : 1 : 1. Так, величина активной кислотности изменилась на 0,4 единицы после ферментации вариантом 1; 0,7 единицы - вариантами 2 и 3; 0,9 единицы - вариантом 4. Максимальный сдвиг титруемой кислотности отмечен при культивировании вариантом 4 и составил 18 Т°.
Как видно из данных рисунков 6 и 7, ферментация консорциумом с соотношением 1 часть лактозосбраживающих дрожжей, 0,5 части микробная ассоциация кефирных грибков, 1 часть L. acidophilus 317/402 оказывает значительное влияние на кислотность среды, сдвигая ее в кислую сторону.
Я а
Продолжительность культивирования, ч
Рисунок 6 - Динамика активной кислотности дрожже-бактериального консорциума
Л
н о о и н о ч
о
(D $
н
Продолжительность культивирования, ч
Рисунок 7 - Динамика титруемой кислотности дрожже-бактериального консорциума
Совместная деятельность микроорганизмов требует составления разработки благоприятных сочетаний, которые выбирают на основе их производственных качеств. Из последних наибольшее значение имеют вкус, запах и консистенция готового продукта, также необходимо учитывать активность кислотообразования и антибиотическую активность.
Исследовали антибиотическую активность культур дрожже-бактериального консорциума к условно-патогенному штамму E. coli. Результаты исследований представлены в таблице 1.
Бактериостатический эффект наблюдали при культивировании отдельных культур консорциума в разведениях 1 : 4. Наилучшей антибиотической активностью обладает соотношение культур 1 :1 : 1.
Исследовали сочетаемость культур дрожже-бактериального консорциума.
Результаты исследования культур на сочетаемость приведены в таблице 2.
Данные таблицы 2 свидетельствуют о том, что наибольшим процентом сбраживаемости характеризовалось соотношение культур лактозосбраживающих дрожжей, микробной ассоциации кефирных грибков и ацидофильной палочки - 1 : 1 : 1.
Как известно [4, 5], молочнокислые бактерии в присутствии дрожжей лучше развиваются и дольше сохраняют свою активность. Дрожжи являются ценным источником витаминов и аминокислот, к которым, в свою очередь, требовательны молочнокислые бактерии. А клетки дрожжей для своего развития нуждаются в работе молочнокислых бактерий, так как продуцируемая молочнокислыми бактериями молочная кислота потребляется дрожжами.
Таблица 1
Антибиотическая активность культур активных лактозосбраживающих дрожжей, микробной ассоциации кефирных грибков и L. acidophilus 317/402 и их сочетаний
Антибиотическая активность
Наименование культур разведения
1: 2 1 : 4 1 : 8 1 : 1 1 : 32
Лактозосбраживающие дрожжи - - + + ++
Микробная ассоциация кефирных грибков - - + ++ +++
L. acidophilus 317/402 - - - + ++
Вар. 1: 0,5 части лактозосбраживающих дрожжей, 1 часть микробная ассоциация кефирных грибков, 1,5 части L. acidophilus 317/402 + + ++
Вар. 2: 1,5 части лактозосбраживающих дрожжей, 1 часть микробная ассоциация кефирных грибков, 0,5 части L. acidophilus 317/402 + ++ ++
Вар. 3: 1 часть лактозосбраживающих дрожжей, 1 часть микробная ассоциация кефирных грибков, 1 часть L. acidophilus 317/402 - - + + ++
Условные обозначения: «-» - отсутствие роста тест-культуры; «+» - слабый рост тест-культуры; «++» - средний рост тест-культуры; «+++» - обильный рост тест-культуры
Таблица 2
Сочетаемость культур дрожже-бактериального консорциума
Состав заквасок Число заквасок Сочетаемость компонентов консорциума по активности брожения, % Рост L. acidophilus 317/402 в разведениях культуральной жидкости активных клеток лактозосбраживающих дрожжей и микробной ассоциации кефирных грибков
1:4 1:8 1:16 1:32
Вар. 1 25 50 + ++ ++ ++
Вар. 2 25 50 + ++ ++ ++
Вар. 3 25 50 + + ++ ++
Вар. 4 25 75 +++ +++ +++ +++
Микрокартина препарата дрожже-бактериального консорциума представлена на рисунке 8. Заметны клетки лактозосбраживающих дрожжей, микробной ассоциации кефирных
грибков, лактобактерий.
Рисунок 8 - Микрокартина дрожже-бактериального консорциума
Исследовали содержание витаминов В1, В2, фолиевой кислоты в дрожже-бактериальной взвеси, полученной после процесса ферментации. Результаты исследований приведены в таблице 3.
Таблица 3
Содержание витаминов
Варианты Витамины, мг/100 г
В1- тиамин В2 - рибофлавин Фолиевая кислота
Молочная сыворотка 0,021±0,001 100% 0,065±0,021 100% 0,054±0,018 100%
Ферментированная основа 0,038±0,002 180% 0,071±0,021 109% 0,084± 0,012 156%
Данные о хранимоспособности дрожже-бактериального консорциума приведены на рисунке 9.
Лактозосбражива ющие дрожжи
Мезофильные микроорганизмы
Ацидофильная палочка
О 12 24 36 48 60 72 84 96
Продолжительность хранения, ч
Рисунок 9 - Динамика количественного соотношения микроорганизмов в консорциуме в процессе хранения
Установлено количественное содержание микроорганизмов в составе дрожже-бактериального консорциума, которое остается неизменным в течение 72 ч. Количество лактозосбра-живающих дрожжей составляет (7±1)*108, мезофильных микроорганизмов - (5±1)*106, L. acidophilus 317/402 - (4±1)*108. В последующие 24 ч содержание клеток снижается незначительно: лактозосбраживающих дрожжей - (5±1)*108, мезофильных микроорганизмов -(2±1)*106, L. acidophilus 317/402 - (2±1)*108. Таким образом, определен срок хранимоспособности дрожже-бактериального консорциума - 3 сут, в течение которых количество микробных клеток стабильно.
Выводы
На основании проведенных исследований разработана технология ферментированной основы из молочного сырья с использованием консорциума микроорганизмов, обладающего функциональными свойствами.
Экспериментально обоснован компонентный состав питательной среды с включением природной минеральной воды Забайкалья для получения активного инокулята дрожжей. Выявлено увеличение титра активных клеток лактозосбраживающих дрожжей при культивировании на модифицированной питательной среде. Исследованиями морфологических, культу-рально-физиологических свойств дрожжевых клеток доказано отсутствие изменений микробных клеток.
Разработан способ культивирования лактозосбраживающих дрожжей, подобраны температура (25±2) 0С и доза посевного материала (5%) для роста и накопления биомассы дрожжей.
Получен микробный консорциум на основе активного инокулята дрожжей, микробной ассоциации кефирных грибков и промышленного штамма L. acidophilus 317/402 в соотношении 1 : 1 : 1, обеспечивающее содержание (7±2)*108 КОЕ/см3 клеток дрожжей, (5±1)*106 КОЕ/см3
клеток мезофильных лактобактерий, (4±1)*108 КОЕ/см3 клеток ацидофильной палочки. Изучение процесса взаимного влияния культур разработанного консорциума микроорганизмов свидетельствует о наличии симбиотических отношений.
Библиография
1. Нетрусов А.И., Котова И.Б. Микробиология: учебник. - М.: Академия, 2012. - 379 с.
2. Сидоренко О.Д. [и др.]. Микробиология: учебник. - М: Инфра-М, 2012. - 287 с.
3. Хамнаева Н.И., Доржиева Ч.Б. Выделение чистых культур лактозосбраживающих дрожжей из молочных сред // Хранение и переработка сельхозсырья - 2008. - № 3. - С. 51-53.
4. Хамнаева Н.И., Доржиева Ч.Б. Культивирование дрожжей, выделенных из природных источников // Молочная промышленность. - 2007. - № 6. - С. 34-35.
5. Пат. № 2482173 Российская Федерация, МПК С12Ш/16, C12R1/85. Способ получения питательной среды для культивирования лактозосбраживающих дрожжей / Хамнаева Н.И., Олмоева В.Д.; опубл. 20.05.2013. - Бюл. № 14.
Bibliography
1. Netrusov A.I., Kotova I.B. Microbiology: the textbook. - M.: Academy, 2012. - 379 p.
2. Sidorenko O.D. [et al.]. Microbiology: the textbook. - M.: Infra-M, 2012. - 287 p.
3. Khamnaeva N.I., Dorzhieva Ch.B. Isolation of pure cultures of yeast from dairy environments // Storage and processing of agricultural raw materials - 2008. -N 3. - P. 51-53.
4. Khamnaeva N.I., Dorzhieva Ch.B. Cultivation of yeast isolated from nature-sources // Dairy industry. - 2007. - N 6. - P. 34-35.
5. Pat. N 2482173 Russian Federation IPC / C12N1/16, C12R1 / 85. A process for preparing a nutrient medium for cultivating of lactose fermenting yeasts / Khamnaeva N.I., Olmoeva V.D.; Publ. on 05/20/13. -Bul. N 14.
