CC BY
31
УДК 618.444:578.825.12
АКТИВНОСТЬ SH-ГРУПП В СИНЦИТИОТРОФОБЛАСТЕ ВОРСИНОК ХОРИОНА ПРИ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ
М.Т.Луценко
Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания, 675000, г. Благовещенск, ул. Калинина, 22
РЕЗЮМЕ
Цель исследования - определить состояние активности SH-групп в синцитиотрофобласте ворсинок хориона при рецидиве цитомегаловирусной инфекции (ЦМВИ) в сроке беременности 5-7 недель. Для оценки активности SH-групп, выявляемых по методу Барнетта-Зелигмана, исследованы 15 ворсинчатых хорионов в сроке 8-9 недель, полученных при медицинском аборте от женщин с рецидивом ЦМВИ (титр антител IgG 1:1600) в сроке 5-7 недель. Контролем служили 15 ворсинчатых хорионов от ЦМВ-серонегативных женщин на тех же сроках беременности. Анализ парафиновых срезов, окрашенных по методу Барнетта-Зелигмана, выполняли цитофотометрическим методом по программе Scion. В результате исследования выявлено снижение содержания SH-групп в наружной мембране синцитиотрофобласта ворсинок хориона при рецидиве ЦМВИ (титр антител IgG 1:1600) в сроке 5-7 недель до 10,6±0,4 усл. ед. (контроль - 20,5±0,8 усл. ед., p<0,001). Таким образом, экспрессия ЦМВ на поверхности синцитиотрофобласта ворсинок хориона, которая наиболее вероятна в период рецидива инфекции, ассоциирована со снижением содержания SH-групп и нарушением трофических процессов в фетоплацентарном барьере на ранних этапах развития эмбриона.
Ключевые слова: цитомегаловирусная инфекция, беременность, синцитиотрофобласт ворсинок хориона, SH-группы.
SUMMARY
THE ACTIVITY OF SH-GROUP IN SYNCYTIOTROPHOBLAST OF CHORION VILLI AT CYTOMEGALOVIRUS INFECTION
M.T.Lutsenko
Far Eastern Scientific Center of Physiology and
Pathology of Respiration, 22 Kalinina Str., Blagoveshchensk, 675000, Russian Federation
The aim of the research is to define the state of SH-group activity in syncytiotrophoblast of chorion villi under the relapse of cytomegalovirus infection (CMVI) at the stage of pregnancy of 5-7 weeks. To estimate the activity of SH-group identified by Barrnett-Seligman method 15 villous chorions of 8-9 weeks obtained at the medical abortion from women with the relapse of CMVI (IgG antibody titer was 1:1600) at the stage of 5-7 weeks were studied. The control group included 15 villous chorions from CMV-seronegative women at the same stages of pregnancy. The analysis of paraffin sec-
tion dyed by Barrnett-Seligman method was done by cytophotometric method by Scion program. As a result of the study the decrease of SH-group concentration was found out in the outer membrane of syncytiotro-phoblast of chorion villi under CMVI relapse (IgG antibody titer was 1:1600) at the stage of 5-7 weeks till 10.6±0.4 arb. units (the control was 20.5±0.8 arb. units, p<0.001). Thus, the expression of CMV at the surface of chorion villi syncytiotrophoblast which is the most evident during the relapse of infection is associated with the decrease of SH-group concentration and the disturbance of trophic processes in fetoplacental barrier at the early stages of embryo development.
Key words: cytomegalovirus infection, pregnancy, syncytiotrophoblast of chorion villi, SH-groups.
В белковой молекуле среди боковых цепей аминокислотных остатков большая роль принадлежит SH-группам. Это объясняется их высокой химической реакционноспособностью при вступлении в разнообразные реакции со многими типами соединений. Наряду с этим привлекает внимание существенное значение SH-групп для специфических функций ряда ферментов, гормонов и других биологически активных белков, способствующих выполнению метаболических процессов в организме [2, 3, 7, 8].
В настоящее время установлено, что SH-группы играют важную роль во многих физиологических процессах: мышечном сокращении, регуляции проницаемости мембран, окислительном фосфорили-ровании [4, 5]. Многие реагенты могут оказывать блокирующее влияние на SH-группы [6]. Торможение активности ряда ферментов под влиянием реагентов на SH-группы обусловлено нарушением трехмерной структуры (конформации) этих ферментов. Такое нарушение может происходить либо в результате разрыва внутримолекулярных связей, в образование которых вовлечены SH-группы, либо в результате деформирующего действия ингибитора, присоединяющегося к SH-группе на соседние участки макромолекулы белка. В роли ингибиторов молекул белка клеточных мембран могут выступать антигены многих вирусов, поскольку они, сливаясь с мембраной клеток, в которую они проникают, вызывают нарушение конформации белков и подавляют активность SH-групп.
Цель исследования - определить состояние активности SH-групп в синцитиотрофобласте ворсинок хориона при рецидиве цитомегаловирусной инфекции (ЦМВИ) в сроке 5-7 недель.
Материалы и методы исследования
Исследованы 30 ворсинчатых хорионов в сроке 8-9 недель, из которых 15 получены при медицинском
аборте от серопозитивных женщин с рецидивом ЦМВИ (титр антител IgG 1:1600) в сроке 5-7 недель (основная группа) и 15 - от ЦМВ-серонегативных женщин на тех же сроках беременности (контрольная группа).
Критерии включения в основную группу: лабора-торно подтвержденный молекулярно-биологическими и серологическими методами исследования рецидив ЦМВИ в сроке 5-7 недель, наличие в периферической крови беременных на момент исследования титра антител класса IgG к ЦМВ 1:1600, стойкая клиническая ремиссия герпесвирусной инфекции. К критериям исключения относили первичную ЦМВИ, обострение других воспалительных заболеваний экстрагениталь-ной патологии и инфекций, передающихся половым путем.
Рецидив ЦМВИ устанавливали на основании результатов комплексного исследования периферической крови: при наличии антител класса IgM или четырехкратного и более нарастания титра антител класса IgG к ЦМВ в парных сыворотках в динамике через 10 суток, при индексе авидности антител класса IgG к ЦМВ более 65%, а также в случае выявления ДНК ЦМВ методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в крови, моче, в соскобах с буккального эпителия или слизистой оболочки шейки матки.
Исследования выполнены в лаборатории механизмов этиопатогенеза и восстановительных процессов дыхательной системы при неспецифических заболеваниях легких и акушерском отделении патологии беременности при ДНЦ ФПД, Городской клинической больнице г. Благовещенска с учетом требований Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации (World Médical Association Déclaration of Helsinki, 2008) и Правил клинической практики в Российской Федерации, утвержденных приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. №266. Работа одобрена комитетом по биомедицинской этике при ДНЦ ФПД (решение №88 от 12.01.2015 г.) в соответствии с принципами конвенции о биомедицине и правах человека, а также общепризнанными нормами международного права. Все женщины подписали письменное информированное согласие.
У обследуемых беременных взятие крови проводили из локтевой вены в стандартные вакуумные пробирки с коагулянтом в количестве 5 мл для получения образцов мононуклеарных клеток. Для серологических исследований использовали кровь, не содержащую антикоагулянты. Выделение мононуклеарных клеток крови для ПЦР проводилось с использованием раствора фиколл-урографина плотностью 1,077 г/мл (ООО «НПО ДНК-технология», Россия). Серологические исследования проводили в парных сыворотках с интервалом 10-14 суток.
Верификация ЦМВ, определение типоспецифиче-ских антител, индекса авидности осуществляли методами ИФА на спектрофотометре Stat Fax 2100 (США) с использованием тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск), ДНК ЦМВ выявляли методами ПЦР на ап-
парате ДТ-96 с использованием наборов НПО «ДНК-технология» (Россия).
Активность SH-групп в синцитиотрофобласте ворсинок хориона определяли гистохимическим методом по Барнетту-Зелигману с диоксидинафтилдисульфи-дом (ДДД) [9] на парафиновых срезах после фиксации 4% раствором параформальдегида на фосфатном буфере (рН 7,4). Оценка активности SH-групп проводилась цитофотометрическим методом с помощью компьютерной программы Scion (США).
Статистический анализ и обработку данных проводили с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.0. Для определения достоверности различий использовали непарный параметрический критерий Стьюдента. Данные представлены как среднее арифметическое (M) ± стандартная ошибка среднего (m).
Результаты исследования и их обсуждение
Устойчивость клеточных мембран, в том числе и фетоплацентарного барьера, а также антиокислительные свойства ферментных систем цитозоля во многом определяются функциональной активностью SH-групп. Дитиол-дисульфидные превращения в активных центрах некоторых окислительных ферментов играют большую роль в промежуточных стадиях переноса электронов и протонов от субстратов к акцепторам, а именно, в процессах тканевого дыхания. Кроме того, SH-группы могут участвовать в образовании связей между ферментами и субстратами или кофакторами. Наконец, SH-группы участвуют в стабилизации каталитически активной конформации белковой молекулы ферментов. Торможение активности ряда ферментов обусловлено нарушением их конформационной структуры, которое может происходить либо в результате разрыва внутримолекулярных связей, в образование которых вовлечены SH-группы, либо в результате деформирующего воздействия ингибитора, присоединяющегося к SH-группе на соседние участки макромолекулы белка. Во многих случаях имеет место разрыв S-S-связей, что приводит к утрате белком его уникальной конформации и биологической активности. Результатом таких взаимообусловленных процессов может явиться нарушение структурной целостности белкового компонента мембран фетопла-центарного барьера, а также функциональной активности ряда ферментов цитозоля, что определяет изменение обменных и метаболических процессов, осуществляемых между матерью и развивающимся плодом в условиях рецидива ЦМВИ, наиболее опасного в ранние сроки беременности.
Доказательством явилось значительное снижение содержания SH-групп в синцитиотрофобласте ворсинок хориона до 10,6±0,4 усл. ед. (контроль - 20,5±0,8 усл. ед., p<0,001) при рецидиве ЦМВИ (титр антител IgG к ЦМВ 1: 1600) в сроке 5-7 недель (рис. 1, 2).
Одним из механизмов, запускающих каскад мем-бранодестабилизирующих процессов, является экспрессия ЦМВ на клеточной поверхности. Связыванию наружной мембраны ЦМВ с мембраной клетки и его
проникновению внутрь клетки способствуют тегу-ментные белки gP64. В процессе слияния вируса и клетки нарушается конформационная устойчивость белков клеточной мембраны, происходит дезинтеграция фосфолипидного слоя, что, по мнению многих авторов [7, 8], является решающим фактором в подавлении активности SH-групп, входящих в состав
в
шкл
....
о
Рис. 1. Синцитиотрофобласт ворсинки хориона в сроке 9 недель беременности при рецидиве ЦМВИ в сроке 7 недель. Интенсивность реакции на SH-группы снижена (10,6±0,4 усл. ед.). Окраска по методу Бар-нетта-Зелигмана с реактивом ДДД. Увеличение: 15x100.
ЛИТЕРАТУРА
1. Плацентарная недостаточность / Т.С.Быстрицкая. М.Т.Луценко, Д.С.Лысяк, В.П.Колосов. Благовещенск, 2010. 135 с.
2. Ильин В.С., Титова Г.В. Химические факторы регуляции активности и биосинтеза ферментов. М.: Медицина, 1969. 360 с.
3. Кленова Н.А., Кленов Р.О. Механизмы генерации пептидов эритроцитами человека // Вестник СамГУ. Естеств.-науч. серия. Биология. 2006. №7(47). С.75-79.
4. Активность ферментов антиоксидантной защиты и окисление мембранных белков эритроцитов при некоторых патологиях беременности / Н.М.Козлова, Л.П.Касько, А.Г.Кутько, В.А.Петрович, Т.А.Сержан, Э.И.Слобожанина // Изв. Нац. академии наук Беларуси. Сер. мед. наук. 2010, №3. С.97-102.
5. Нагиев Э.Р., Газимагомедова М.М. Структурно-функциональное состояние мембран эритроцитов при остром отравлении метафосом и введении перфторана // Биомед. химия. 2003. Т.49, №2. С.138-144.
6. Патент 2142135 RU. Способ диагностики пре-морбидного состояния / В.Н.Потапов; опубл. 27.11.1999.
7. Торчинский Ю.М. Сульфгидрильные и дисуль-фидные группы белков. М.: Наука, 1971. 228 с.
8. Baker B.R. Design of active-site-directed irreversible enzyme inhibitors. New York: Wiley & Sons, 1967. 202 p.
мембранных белков и белков цитозоля. В результате усиливаются процессы перекисного окисления липи-дов и окислительной денатурации белков мембраны, изменяется состав и свойства белков цитозоля синци-тиотрофобласта ворсинок хориона [1], что и приводит к нарушению трофических процессов на ранних этапах развития эмбриона.
Рис. 2. Синцитиотрофобласт ворсинки хориона в сроке 9 недель беременности. Контроль. Интенсивность реакции на SH-группы высокая (20,5±0,8 усл. ед.). Окраска по методу Барнетта-Зелигмана с реактивом ДДД. Увеличение: 15x100.
9. Lillie R.D. Histopatologic technic and practical histochemistry. 3d ed. New York: McGraw-Hill, 1965. 642 p.
REFERENCES
1. Bystritskaya T.S., Lutsenko M.T., Lysyak D.S., Ko-losov VP. Placental insufficiency. Blagoveshchensk; 2010 (in russian).
2. Ilyin V.S. Titov G.V Khimicheskie faktory regulyatsii aktivnosti i biosinteza fermentov [Chemical factors regulating enzymes activity and biosynthesis]. Moscow: Med-itsina; 1969 (in russian).
3. Klenova N.A., Klenov R.O. Mekhanizmy generatsii peptidov eritrotsitami cheloveka [Mechanisms of peptides generation by erythrocytes of a man]. Vestnik Samarskogo gosudarstvennogo universiteta. Estestvenno-nauchnaya seriya. Biologiya 2006; 7:75-79 (in russian).
4. Kozlova N.M., Kas'ko L.P., Kut'ko A.G., Petrovich VA., Serzhan T.A., Slobozhanina E.I. Aktivnost'fermentov antioksidantnoy zashchity i okislenie membrannykh belkov eritrotsitov pri nekotorykh patologiyakh beremennosti [Activity of antioxidant defence enzymes and membrane proteins oxidation in erythrocytes of women with some pathologies of pregnancy]. Izvestiya Natsional'noy akademii nauk Belarusi. Seriya meditsinskikh nauk 2010; 3:97-102 (in russian).
5. Nagiev E.R., Gazimagomedova M.M. Strukturno-funktsional'noe sostoyanie membran eritrotsitovpri ostrom otravlenii metafosom i vvedenii perftorana [The effect of
perftoran on structure-functional state of erythrocyte membrane in acute intoxication with metaphos]. Biomeditsin-skaya khimiya 2003; 49(2):138-144 (in russian).
6. Potapov VN. Patent 2142135 RU. Sposob diagnos-tiki premorbidnogo sostoyaniya (Patent 2142135 RU. A method of diagnosing premorbid state); published 27.11.1999 (in russian).
7. Torchinskiy Y.M. Sul'fgidril'nye i disulfidnye gruppy belkov [Sulfhydryl and disulfide groups of proteins]. Moscow: Nauka; 1971 (in russian).
8. Baker B.R. Design of active-site-directed irreversible enzyme inhibitors. New York: Wiley & Sons; 1967.
9. Lillie R.D. Histopatologic technic and practical histochemistry. 3d ed. New York: McGraw-Hill; 1965.
Поступила 03.04.2015
Контактная информация Михаил Тимофеевич Луценко,
доктор медицинских наук, профессор, академик РАН, руководитель лаборатории механизмов этиопатогенеза и восстановительных процессов дыхательной системы при НЗЛ, Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания,
675000, г. Благовещенск, ул. Калинина, 22.
E-mail: [email protected] Correspondence should be addressed to Mikhail T. Lutsenko, MD, PhD, Professor, Academician of RAS, Head of Laboratory of Mechanisms of Etiopathogenesis and Recovery Processes of the Respiratory System at Non-Specific Lung Diseases, Far Eastern Scientific Center of Physiology and Pathology of Respiration, 22 Kalinina Str., Blagoveshchensk, 675000, Russian Federation.
E-mail: [email protected]
