Активность протеолитических процессов в сыворотке крови и перитонеальной жидкости в разные стадии перитонита Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»

И.П. ШТУРИЧ, В.Н. ШИЛЕНОК, Л.Н. КИРПИЧЕНОК

АКТИВНОСТЬ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ И ПЕРИТОНЕАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ В РАЗНЫЕ СТАДИИ ПЕРИТОНИТА

УО «Витебский государственный медицинский университет», Республика Беларусь

В статье представлены результаты исследования активности протеолитичес-ких процессов в сыворотке крови и перитонеальной жидкости у 42 больных перитонитом в разные стадии заболевания. Установлено, что при перитоните происходят изменения активности и/или содержания компонентов системы протеолиза в сыворотке крови и перитонеальной жидкости в зависимости от стадии перитонита. В сыворотке крови наиболее значимым изменениям подвергается общая протеолити-ческая активность, которая в стадию полиорганной недостаточности увеличивается в 13,4 раза по сравнению с токсической стадией. В перитонеальной жидкости наиболее лабильным является а1-протеиназиый ингибитор, который резко снижается в токсической стадии - в 3,2 раза по сравнению с реактивной стадией, а затем вновь растет. Повышение общей протеолитической активности в сыворотке крови более 100 нмоль/лЧс является критерием перехода токсической стадии перитонита в стадию полиорганной недостаточности. Снижение содержания а1-антипротеиназного ингибитора в перитонеальной жидкости менее 0,4 г/л является критерием перехода реактивной стадии перитонита в токсическую. Источником протеиназ и их эндогенных ингибиторов является не только печень, но и клетки крови - моноциты, лимфоциты, сегментоядерные нейтрофилы. В соответствии с обнаруженными корреляционными взаимоотношениями, в разные стадии перитонита участвуют различные клетки.

Тяжесть течения перитонита определяет стратегию лечебных мероприятий для каждого больного. Существующие методы оценки тяжести течения перитонита не всегда позволяют определить состояние больного , степень интоксикации и, как следствие, назначить адекватное лечение.

Цель настоящего исследования - на основе исследования интенсивности про -теолиза в сыворотке крови и перитонеальной жидкости изучить возможность использования показателей активности про-теолитических процессов для оценки тяже-

сти течения перитонита и прогнозирования исхода заболевания.

Для этого мы исследовали интенсивность протеолитических процессов в сыворотке крови и перитонеальной жидкости у больных перитонитом на различных стадиях заболевания.

Материалы и методы

Материалом для исследования служила сыворотка крови и перитонеальная жидкость 42 больных перитонитом (13 больных в реактивной стадии, 14 больных в токси-

ческой стадии и 15 больных в стадии полиорганной недостаточности).

В сыворотке крови и перитонеальной жидкости определяли общую протеолити-ческую активность (ОПА) по методу Erlanger B.F. et al. [4] с нашими модификациями, используя в качестве субстрата N-a-бензоил-В,Ь-аргинина паранитроанилида (БАПНА). Основой для определения активности ингибиторов служил метод, предложенный Т. А. Хватовым и В.Б. Беловой [3]. Определяли а1-антипротеиназный ингибитор (АПИ), а2-макроглобулин (МГ), суммарную ингибиторную емкость (СИЕ) (соответствовала сумме активности основных ингибиторов - АПИ + МГ) и индекс протеолиза (ИП). Индекс протеолиза (соотношение общей протеолитической активности к сумме активности основных ингибиторов проте-иназ) отражает напряженность или «управляемость» протеолитических процессов.

Результаты и их обсуждение

Обнаружено, что в реактивную стадию перитонита в сыворотке крови наблюдался рост активности одного из основных ингибиторов протеиназ - АПИ на 46,95% при практически неизмененном содержании

МГ, что приводило к росту СИЕ на 24,27% (табл. 1). Одновременно происходило снижение общей протеолитической активности на 45,43% (табл. 1). Индекс протеолиза при этом также уменьшался (на 56,22%).

В реактивную стадию перитонита имела место четкая корреляционная зависимость между количеством сегментоядерных лейкоцитов и ОПА (г=0,69, р=0,025), а также между содержанием этих лейкоцитов и ИП (г=0,804, р=0,009).

Наблюдаемые изменения, по-видимому, связаны с тем, что в ответ на воспалительный процесс происходит выброс одного из быстрых реактантов острой фазы -АПИ. АПИ способен необратимо связывать протеолитические ферменты, которые обеспечивают измеряемую нами общую проте-олитическую активность. Это объяснение подтверждается и количественной сопоставимостью разнонаправленных изменений АПИ и ОПА (46,95% и 45,43%, соответственно).

В токсическую стадию перитонита активность АПИ снижалась до контрольных значений, а МГ - увеличивалась (на 31 % по сравнению с реактивной стадией), что в результате не сказалось на уровне СИЕ

Таблица 1

Интенсивность протеолитических процессов в сыворотке крови больных перитонитом (реактивная стадия, п=13)

Показатель Контроль Медиана Нижняя квартиль Верхняя квартиль Значение р U-критерий Манна-Уитни*

АПИ, г/л 2,13 3,13 1,14 3,84 0,07

МГ, г/л 3,02 3,28 2,42 3,53 0,006

ОПА, нмоль/л-с 11,16 6,09 0 20,3 0,001

СИЕ, г/л 5,15 6,40 3,29 6,95 0,053

ИП, усл. ед. 2,17 0,95 0 3,08 0,079

Примечание: достоверность изменении изучаемых показателей в группе больных перитонитом в реактивной стадии с показателями в стадии полиорганной недостаточности.

Таблица 2

Интенсивность протеолитических процессов в сыворотке крови больных перитонитом (токсическая стадия, п=12)

Показатель Медиана Нижняя Верхняя Значение р Ц-

квартал ь квартиль критерии Манна-Уитни*

АПИ, г/л 2,11 0,76 2,2 0,019

МГ, г/л 4,3 3,32 24,07 0,025

ОПА, нмоль/л-с 8,12 0 52,79 0,54

СИЕ, г/л 6,41 4,66 26,31 0,78

ИП, усл. ед. 1,27 0 4,36 0,3

Примечание: достоверность изменении изучаемых показателей в группе больных перитонитом в токсической стадии с показателями в реактивной стадии.

(табл. 2). ОПА и ИП имели тенденцию к росту, но достоверно не отличались от уровня предыдущей стадии (табл. 2).

Снижение активности АПИ на фоне роста МГ в токсическую стадию перитонита может быть следствием нескольких причин. Уменьшение активности АПИ может быть связано с необходимостью инактивации массивного количества протеолитических ферментов, поступивших в сыворотку крови как из собственных клеток, так и из микроорганизмов. С другой стороны, изве-

стно, что МГ способен резко усиливать диссоциацию комплексов АПИ-протеиназа, что приводит к освобождению активного ингибитора. Но, поскольку роста СИЕ не наблюдалось, по-видимому, происходит истинное снижение концентрации белка-ингибитора.

Снижение активности АПИ может происходить в результате уменьшения синтетической функции печени, которая является основным продуцентом сывороточных серпиновых ингибиторов. Однако в таком

Таблица 3

Интенсивность протеолитических процессов

в сыворотке крови больных перитонитом (стадия полиорганной недостаточности, п=13)

Показатель Медиана Нижняя Верхняя Значение р Ц-

квартиль квартиль критерий Манна-Уитни*

АПИ, г/л 3,72 3,21 5,6 0,0002

МГ, г/л 4,03 3,69 10,9 0,8

ОПА, нмоль/л-с 108,62 24,36 140,09 0,004

СИЕ, г/л 7,75 6,97 8,17 0,22

ИП, усл. ед. 14,02 3,2 17,2 0,36

Примечание: достоверность изменений изучаемых показателей в группе больных перитонитом в стадии полиорганной недостаточности с показателями в токсической стадии.

случае не наблюдался бы рост активности МГ, так как постоянство пула МГ в системе кровообращения обеспечивается большей частью гепатоцитами [2].

Возможно, уменьшение активности АПИ связано с истощением его периферического пула.

Повышение активности МГ в токсическую стадию может быть связан с ростом его синтеза.

К факторам, стимулирующим биосинтез МГ, относят НББ (фактор, стимулирующий гепатоциты), который продуцируют полиморфноклеточные лейкоциты из пери-тонеального экссудата и из периферического кровотока. Синтез МГ может также осуществляться периферическими моно-нуклеарами, их содержание в токсическую стадию увеличивалось по сравнению с содержанием в реактивную стадию. Возможность лейкоцитов как источника МГ в эту стадию косвенно подтверждается положительной корреляцией этих показателей (г=+0,62, р=0,05).

Биосинтез МГ стимулируется также интерлейкином-6 (ИЛ-6), который индуцирует транскрипцию гена МГ, усиливает секрецию МГ гепатоцитами и одновременно подавляет секрецию а1-протеиназного ингибитора, который является основным ингибитором сыворотки крови.

В токсическую стадию перитонита происходит повреждение печени и из поврежденных гепатоцитов вместе с другими ферментами в кровеносное русло выходят про-теолитические ферменты, так как наблюдается положительная корреляция как между ОПА и АСАТ (г=+0,60, р=0,05), так и между ИП и АЛАТ (г=+0,71, р=0,04) и ИП и АСАТ (г=+0,75, р=0,029).

В стадию полиорганной недостаточности перитонита активность МГ оставалась на предыдущем уровне, в то время как активность АПИ и ОПА резко повышались (соответственно на 76% и на 1237% по

сравнению с предыдущей стадией, табл. 3). ИП в эту стадию также повышался.

Кроме печени АПИ синтезируется мак-рофагальными клетками. Доказано, что связывание комплексов АПИ-протеиназа с соответствующими рецепторами гепатоцитов и макрофагов человека приводит к экспрессии гена АПИ и индуцирует синтез этого белка. Поэтому возможно, что при увеличении активности протеиназ происходит снижение концентрации свободного АПИ и рост концентрации комплексов АПИ-протеиназа. В результате клетки печени отвечают дополнительной продукцией натив-ного ингибитора, что мы и наблюдали в стадию полиорганной недостаточности.

Постоянный рост общей протеолитической активности в динамике развития перитонита обусловлен поступлением протеолитических ферментов из различных источников. Главное значение в развитии протеиназно-ингибиторного дисбаланса имеют гранулоциты и макрофаги, они пер -выми мигрируют в очаг воспаления, принимают участие в формировании гистио-цитарно-гематического барьера.

В реактивную стадию перитонита основным источником протеиназ являются сегментоядерные нейтрофилы, так как наблюдается тесная положительная корреляционная связь между ОПА, ИП и содержанием сегментоядерных нейтрофи-лов (г= +0,69, р=0,025 и г= +0,804, р=0,009, соответственно).

Активация этих клеток в зоне воспаления сопровождается дестабилизацией их мембран, что приводит к выбросу пула активных лизосомальных ферментов. Выход лизосомальных ферментов из клеток индуцирует избирательный протеолиз, который приводит к активации плазменных проферментов систем свертывания и фибриноли-за, калликреин-кининовой системы и системы комплемента. В результате накапливаются биологически активные пептиды:

Таблица 4

Распределение результатов исследования общей протеолитической активности в сыворотке крови больных перитонитом (число случаев)

Показатель Результаты исследований Всего

положительные отрицательные

ИП ЛП ИО ЛО

ОПА 6 3 12 1 22

Примечание: ИП - истинно положительные, ЛП - ложно положительные, ИО - истинно отрицательные, ЛО - ложно отрицательныерезультаты.

кинины, анафилотоксины, а также происходит потребление факторов гемокоагуля-ции, фибринолиза и калликреин-кинино-вого каскада [1].

Судя по корреляционным отношениям, в реактивную стадию перитонита эндогенные ингибиторы протеиназ поставляются не только печенью, но и лейкоцитами, так как имеется тенденция к положительной корреляции между МГ и лейкоцитами (г=+0,59, р=0,05).

В токсическую стадию ингибиторный потенциал пополняется в основном за счет а2-макроглобулина (коэффициент корреляции между МГ и лейкоцитами составляет

+0,62, р=0,05). Отрицательная корреляция между количеством лимфоцитов и ИП (г= -0,71, р=0,03), возможно связана, с разрушением последних, так как количество их в эту стадию перитонита снижалось вдвое.

Возможно, в токсическую стадию перитонита в сыворотке крови циркулируют как собственно сывороточные активированные протеиназы, так и тканевые и микробные протеолитические ферменты.

По-видимому изменяется и функциональное «содержимое» клеток гранулоци-тарного ряда. Если в реактивную стадию сегментоядерные клетки «богаты» протеи-назами (г= +0,69, р=0,025 между ОПА и ко-

Показатель Медиана Нижняя квартиль Верхняя Квартиль Значение р Ц- критерий Манна-Уитни*

АПИ, г/л 0,51 0,46 0,6 0,1

МГ, г/л 0,56 0,47 0,73 0,73

ОПА, нмоль/г-с 9 0,86 17,56 0,5

СИЕ, г/л 1,07 1,02 1,39 0,09

ИП, усл. ед. 8,41 0,81 12,04 0,2

Примечание: достоверность изменении изучаемых показателей в группе больных перитонитом в реактивной стадии с показателями в стадии полиорганной недостаточности.

Таблица 5

Интенсивность протеолитических процессов в перитонеальной жидкости больных перитонитом (реактивная стадия, п=13)

Таблица 6

Интенсивность протеолитических процессов в перитонеальной жидкости больных перитонитом (токсическая стадия, п=14)

Показатель Медиана Нижняя квартиль Верхняя Квартиль Значение р Ц-критерий Манна-Уитни*

АПИ, г/л 0,16 0 0,4 0,003

МГ, г/л 0,6 0,43 0,88 0,88

ОПА, нмоль/г-с 5,14 0 18,45 0,86

СИЕ, г/л 0,76 0,58 1,15 0,01

ИП, усл. ед. 6,8 0 16,17 0,87

Примечание: достоверность изменении изучаемых показателей в группе больных перитонитом в токсической стадии с показателями в реактивной стадии.

личеством сегментоядерных нейтрофилов), то в стадию полиорганной недостаточности наоборот - наблюдалась положительная корреляция между количеством сегментоядерных нейтрофилов и активностью ингибиторов (г= +0,76, р=0,03), а также между количеством лейкоцитов и СИЕ (г= +0,88, р=0,004). Отрицательная корреляционная связь между содержанием, активностью ингибиторов и содержанием моноцитов (г= -0,71, р=0,047) при росте количества последних может свидетельствовать о том, что они функционально неполноценны и не в состоянии секретировать эндогенные ингибиторы протеолитических ферментов.

Протеолитический потенциал сыворотки крови в какой-то мере обеспечивается за счет клеток крови только в реактивной стадии перитонита. Отсутствие корреляции индекса протеолиза с клеточным составом в стадию полиорганной недостаточности свидетельствует о том, что основными источниками и агрессивных проте-иназ, и их эндогенных ингибиторов в эту стадию являются периферические ткани.

Анализируя изменение интенсивности протеолиза в сыворотке крови в диагнос-

тическом плане, необходимо отметить, что при прогрессировании перитонита наиболее динамичными показателями являются ОПА и АПИ. ИП является более интегральным показателем, чем ОПА, который оценивает и агрессивность протеолитических ферментов, и защитную реакцию эндогенных ингибиторов. Однако этот показатель очень сильно варьировал у разных больных, особенно в стадию полиорганной недостаточности: интерквартильный размах в первые две стадии был от 0 до 4,36, в последнюю стадию - от 3,20 до 17,20.

Таким образом, рост (в 13,4 раза) общей протеолитической активности в сыворотке крови больных перитонитом свидетельствует о прогрессировании процесса. Повышение ОПА более 100 нмоль/лс является признаком перехода токсической стадии перитонита в стадию полиорганной недостаточности.

Диагностическая чувствительность этого показателя составляет 66,7%, диагностическая специфичность - 92,3%, процент правильного прогноза - 81,8% (табл. 4).

В перитонеальной жидкости наименьшая активность АПИ имела место в токси-

Таблица 7

Интенсивность протеолитических процессов в перитонеальной жидкости больных перитонитом (стадия полиорганной недостаточности, п=15)

Показатель Медиана Нижняя квартиль Верхняя Квартиль Значение р Ц-критерий Манна-Уитни*

АПИ, г/л 0,77 0,26 1,28 0,002

МГ, г/л 0,58 0,42 0,77 0,79

ОПА, нмоль/г-с 6,4 1,64 9,11 0,84

СИЕ, г/л 1,35 0,8 1,73 0,008

ИП, усл.ед. 4,74 2,74 6,2 0,64

Примечание: достоверность изменении изучаемых показателей в группе больных перитонитом в стадии полиорганной недостаточности с показателями в токсической стадии.

ческую стадию перитонита (в 3,2 раза меньше, чем в реактивную стадию) (табл. 5, 6). В стадию полиорганной недостаточности активность АПИ вновь увеличивалась (в 1,5 раза по сравнению с реактивной и в 4,8 раза по сравнению с токсической стадией) (табл. 6, 7).

Уровень МГ во все стадии перитонита оставался неизмененным.

Характер изменений СИЕ был аналогичен изменениям содержания АПИ. В токсическую стадию СИЕ снижалась в 1,4 раза по сравнению с реактивной стадией, а в стадию полиорганной недостаточности -вновь повышалась (в 1,8 раза по сравнению с предыдущей стадией) (табл. 5, 6, 7).

Общая протеолитическая активность с прогрессированием заболевания имела тенденцию к снижению в токсическую стадию. Наибольшие значения индекса проте-олиза отмечались в реактивную стадию перитонита, затем ИП постепенно снижался в токсическую стадию и еще более - в стадию полиорганной недостаточности (почти вдвое по сравнению с реактивной стадией) (табл. 5, 6, 7).

При анализе корреляционной зависимости показателей протеолиза в перитоне-

альной жидкости и клеточного состава крови обнаружено следующее.

В реактивной стадии перитонита обнаружена положительная корреляционная зависимость между содержанием АПИ в перитонеальной жидкости и индексами интоксикации сыворотки крови - лейкоцитарный индекс интоксикации и лейко-интоксикационный индекс (г= +0,78, р=0,04), а также СИЕ и лейкоцитарный индекс интоксикации (г= +0,75, р=0,05). Это также предполагает участие ингибиторов протеиназ, секретируемых клетками крови, в инактивации протеолитических ферментов, находящихся в перитонеальной жидкости. Существенный вклад, по-видимому вносят моноциты, так как наибольшая корреляция наблюдается для СИЕ и моноцитов (г= +0,71, р=0,03).

Если моноциты являются источником ингибиторной активности, то лимфоциты, вероятно, - источником протеолитической активности (коэффициент корреляции между ИП и лимфоцитами равен + 0,75, р=0,05.

В токсическую стадию перитонита лимфоциты, напротив, вероятно, продуцируют МГ (г= +0,55, р=0,05).

Таблица 8

Распределение результатов исследования содержания а1-протеиназного ингибитора в перитонеальной жидкости больных перитонитом

(число случаев)

Показатель Результаты исследований Всего

положительные отрицательные

ИП ЛП ИО ЛО

АПИ 9 3 10 3 25

Примечание: ИП - истинно положительные, ЛП - ложно положительные, ИО - истинно отрицательные, ЛО - ложно отрицательные результаты.

Таким образом, резкое снижение (в 3,2 раза) содержания АПИ в перитонеальной жидкости больных перитонитом на ранних этапах заболевания свидетельствует о про-грессировании процесса и переходе реактивной стадии в токсическую. Снижение АПИ менее 0,4 г/л является признаком перехода реактивной стадии перитонита в токсическую.

Диагностическая чувствительность этого показателя составляет - 75%, диагностическая специфичность - 76,9%, процент правильного прогноза - 76% (табл. 8).

Выводы

1. При перитоните происходят фазные изменения активности и/или содержания компонентов системы протеолиза в сыворотке крови и перитонеальной жидкости.

2. В сыворотке крови наиболее значимым изменениям подвергается общая про-теолигическая активность, которая в стадию полиорганной недостаточности увеличивается в 13,4 раза по сравнению с токсической стадией.

3. В перитонеальной жидкости наиболее лабильным является а1-протеиназ-

ный ингибитор, который резко снижается в токсической стадии - в 3,2 раза по сравнению с реактивной стадией, а затем вновь растет.

4. Источником протеиназ и их эндогенных ингибиторов является не только печень, но и клетки крови: моноциты, лимфоциты, сегментоядерные нейтрофи-лы. В соответствии с обнаруженными корреляционными взаимоотношениями в разные стадии перитонита участвуют различные клетки.

5. Повышение общей протеолитичес-кой активности в сыворотке крови более 100 нмоль/лЧс является критерием перехода токсической стадии перитонита в стадию полиорганной недостаточности (диагностическая специфичность - 92,3 %, диагностическая чувствительность - 66,7 %, процент правильного прогноза - 81,8 %).

5.Снижение содержания а1-антипро-теиназного ингибитора в перитонеальной жидкости менее 0,4 г/л является критерием перехода реактивной стадии перитонита в токсическую (диагностическая специфичность - 76,9 %, диагностическая чувствительность - 75 %, процент правильного прогноза - 76 %).

ЛИТЕРАТУРА

1. Веремеенко, К.Н. Протеолиз в норме и при патологии / К.Н. Веремеенко, О.П. Го -лобородько, А.И. Кизим. - Киев: Здоров'я, 1988. - 199 с.

2. Косинец, А.Н Протеиназы и их ингибиторы в гнойной хирургии и онкологии / А.Н. Косинец, Л.Н. Кирпиченок. - Витебск, 2003. - 410 с.

3. Хватов, В.Б. Ускоренный метод определения основных ин-гибиторов протеиназ в плазме крови человека: метод. рекомендации / В.Б. Хватов, Т.А. Белова; МЗ РСФСР.- Москва, 1981. - 16 с.

4. Erlanger, D.F. The preparation and properties of two new chromogenic substates of trypsin / N. Kokowsky, W. Cohen // Arch. Biochem. Biophys. - 1961. - Vol. 95, N 2. -P. 271-278.

Поступила 22.05.2006 г.