CC BY
113
ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК РЕСПУБЛИКИ ТАДЖИКИСТАН _________________________________2008, том 51, №9_____________________________
БИОХИМИЯ РАСТЕНИЙ
УДК 581.19:634.11(479.25)
Член-корреспондент АН Республики Таджикистан А.Абдуллаев, Б.Б.Джумаев, Н.Б.Джумаев, З.К.Мухидинов АКТИВНОСТЬ ПЕКТИНМЕТИЛЭСТЕРАЗЫ В ВЫЖИМКАХ ИЗ ЯБЛОК И АПЕЛЬСИНОВ
Известно, что пектин является одним из распространенных полисахаридов в растительном мире [1]. Особенно много его во фруктах, ягодах, стеблях и корнеплодах [2,3]. Основная его функция заключается в удержании тканей в состоянии тургора, повышении устойчивости растений к засухе и устойчивости плодов и овощей при хранении [4]. В расщеплении пектиновых веществ участвует несколько ферментов, действующих последовательно: протопектин гидролизируется ферментом протопектиназой, по-видимому, расщепляющим связи между метоксилированной полигалактуроновой кислотой и связанными с ней араба-ном и галактаном. В результате образуется свободная метоксилированная полигалактуроно-вая кислота- растворимый пектин. Последний гидролизуется под действием ферментов по-лигалактуроназы и пектинметилэстеразы [5]. Пектинметилэстераза катализирует отщепление метоксильных групп (-СН3) и карбоксильных групп (-СООН) от пектиновой молекулы. Активность пектинметилэстеразы достаточно хорошо исследована в зависимости от созревания плодов. Выделены и изучены физико-химические свойства пектинметилэстеразы и ее изоформы в свежих фруктах, влияние различных значений рН среды и температуры на активность очищенных форм фермента [6-9]. Однако активность фермента и вязкость ферментного экстракта в зависимости от рН среды, температуры в высушенных препаратах не достаточно изучены, что и явилось целью данной работы
Методика
Объектами исследования служили выжимки из яблок сорта Ренет Симиренко, урожая осени 2006 г., выращенных в Файзабадском районе Республики Таджикистан, и из апельсинов, привезенных из Турции. Для изучения активности пектинметилэстеразы брали по 50 г сухих исследуемых объектов и при помощи мельницы марки М-1 измельчали в течение 2-3 мин до получения гомогенной массы. Затем из измельченной массы брали 10 г и растворяли в 0.1 М Трисс-буфере рН 6.5. Полученный экстракт в течение двух часов хранили в холодильнике. После этого экстракт отжимали через двухслойную капроновую ткань. Полученную жидкость центрифугировали в течение 20 мин при 7000 g на центрифуге К-24. Надо-садочную жидкость использовали для определения активности фермента.
Пектинметилэстеразную активность определяли потенциометрическим методом, который основан на титрометрическом определении количества освобождающихся карбок-
сильных групп в результате гидролиза сложноэфирных связей в пектиновой молекуле. Для определения активности использовали 10 мл 1% раствора пектина (приготовленного на G.G5 М NaCl), к нему добавляли В мл М NaCl и ферментную вытяжку - от 0.1 до 2 мл. Титрование проводили 0.02 н №ОН и значение рН поддерживали на постоянном уровне [10]. За единицу активности пектинметилэстеразы принимали такое количество фермента, которое высвобождает 1 мкмоль СООН-групп за 1 мин из 1 мл ферментной вытяжки при стандартных условиях.
Р е з у л ь т а т ы и о б с у ж д е н и е
В таблице представлены данные по влиянию температуры на вязкость и активность пектинметилэстеразы в экстракте из выжимок яблок, кожуры и мякоти апельсина. Относительная вязкость экстрактов из выжимок яблок, корок и мякоти апельсина определялась путем инкубирования в течение 40 мин при различных температурах. Результаты исследований показали, что исследуемые объекты отличаются между собой по относительной вязкости (табл.). При этом самая минимальная относительная вязкость обнаружена при температуре инкубации экстракта при +15оС, а максимальная при +100оС. Изучение активности пектин-метилэстеразы показало, что минимальная активность у всех исследованных объектов обнаружена при температуре +15оС, а максимальная активность фермента наблюдалась в мякоти апельсина при температуре +37оС, в выжимках из яблока при +б0оС, а в выжимках из кожуры апельсина при +37 и +б0оС. После достижения максимальной активности фермента при указанных температурах дальнейшее повышение температуры приводило к постепенному снижению активности. В случае с экстрактом из выжимок корки апельсина обнаружено, что с увеличением температуры от +50оС до +б0оС относительная вязкость уменьшалась, а при температуре +100оС этот показатель увеличился почти в 1.5 раза. Изучение зависимости активности пектинметилэстеразы от температуры показало, что фермент может проявлять свою активность даже при температуре +60оС. . .+80°С. Это свидетельствует о том, что пек-тинметилэстераза является термостабильным ферментом. Изучение влияния температуры на относительную вязкость экстракта из выжимок кожуры апельсина также показало, что с повышением температуры этот показатель увеличивается. В условиях эксперимента активность пектинметилэстеразы значительно изменялась при температурах +15°С, +25°С и +37°С. В целом, исследуемые объекты имели разную активность: максимальная активность обнаружена в экстрактах из мякоти апельсина, минимальная активность в выжимках из яблок, а промежуточная активность этого фермента наблюдалась в кожуре апельсина.
7G2
Таблица
Влияние температуры на относительную вязкость (ОВ) ферментного экстракта и активность
пектинметилэстеразы (мкмоль/г сухой массы)
Температура, °С 15 25 37 6G SG 1GG
ОВ-ферментного экстракта из выжимок яблок 1.13± G.G2 1.29± G.G3 1.29± G.G3 2.1В± G.G2 3.0В± G.G3 4.40± G.G3
из мякоти апельсина 1.22± G.G3 1.19± G.G1 1.17± G.G2 1.00± G.G3 1.25± G.G2 1.55± G.G4
из кожуры апельсина 1.37± G.G3 1.47± G.G2 1.5В± G.G4 2.44± G.G5 3.01± G.G3 3.73± G.G4
Активность фермента в выжимках из яблок 5.8± G.3 б.7± G.2 9.1± G.3 10.4± G.6 5.В± G.7 -
в мякоти апельсина 57.1± 2.3 бВ.б± З.б 74.3± 4.3 45.7± 2.3 30.1± 2.7 -
в кожуре апельсина 7.3± G.7 11.3± 1.3 13.3± 1.7 13.3± G.9 10.б± 1.2 -
Примечание: время инкубации - 40 мин.
Анализ результатов показал, что относительная вязкость экстрактов у исследованных объектов при температурах +б0°С ... +100°С увеличивалась. По-видимому, при таких условиях эксперимента растворимость органических соединений, входящих в состав клетки, уве-
личивается, белки денатурируются, что, соответственно, сопровождается увеличением относительной вязкости экстрактов исследуемых объектов.
На рис.1 показана зависимость активности пектинметилэстеразы из выжимок яблок от рН среды. С увеличением рН среды, в промежутке рН 3 -4, активность фермента изменялась
незначительно, а начиная с рН 5, активность фермента резко увеличивалась. Однако падения активности фермента с повышением значения рН среды не обнаружено. По-видимому, ионы натрия, содержащиеся в среде для выделения данного фермента, и раствор едкого натрия, который исполь-
„ . „ зовался для реакции нейтрали-
Рис.1. Зависимость активности пектинметилэстеразы
(A, мкмоль/г сухой массы) из выжимок яблок от рН среды. зации, повлияли на его активность. Так, в работе некоторых авторов показано, что ионы натрия являются активаторами
данного фермента [11]. Таким образом, полученные данные свидетельствует, что активность
На рис. 2 показана зависимость активности пектинметилэстеразы мякоти апельсина от рН-среды. Зависимость активности пектинметилэ-стеразы мякоти апельсина от рН-среды такая же, как и зависимость активности данного фермента из выжимок яблок от рН реакционной смеси.
Анализ хода кривой показывает, что в промежутке рН 3-4 активность фермента изменялась не очень заметно. Продолжение увеличения рН реакционной смеси до 9.0 после рН 4 приводило к резкому увеличению ферментативной активности. Здесь, как и в отношении пектинметилэстеразы из выжимок яблок, не обнаружено падения активности фермента.
Таким образом, исследование активности пектинметилэстеразы в выжимках из яблок, мякоти и корки апельсина показало, что данный фермент может проявляь активность при довольно высоких температурах. Анализ зависимости его активности от рН-среды показал, что она одинакова в выжимках из яблок и в корке апельсина.
Acknowledgment: This work was supported by the USDA ISTC Grant Project T-1420.
Институт физиологии растений и генетики Поступило 26.04.2008 г.
АН Республики Таджикистан,
*
Институт химии им. В.И.Никитина АН Республики Таджикистан
фермента начинает проявляться при рН 5 реакционной смеси.
A
.5
.0
pH
Рис.2. Зависимость активности пектинметилэстеразы (А, мкмоль/г сухой массы) из выжимок мякоти апельсина от рН среды.
ЛИТЕРАТУРА
1. Сапожникова Е.В. Пектиновые вещества плодов. М.: Наука, 1965, 195 с.
2. Арасимович В.В., Пономарева И.П. Обмен углеводов при созревании и хранении плодов яблони. Кишинев,1976, 215 с.
3. Ширко Т.С., Ярошевич И.В. Биохимия и качество плодов. Минск.: Наука и техника,1991, 294 с.
4. Taiz L., Zeiger E. - Plant Physiology (4 th ed.) Sinauer Ass, Inc., Publishers. Sunderland, Massachusetts, 2006, 764 p.
5. Ярош Н.П., Арасимович В.В., Ермаков А.И., Перуанский Ю.В. - Методы биохимического исследования растений. Под.ред.Ермакова А.И.- Л.: Агропромиздат, 1987, с.36-84.
6. Savary B.J., Hotchkiss A.T., Cameron R.G. - J. Agric.Food. Chem., 2002, v.50, p.3553-3558.
7. Cameron R.G., Savary B.J., Hotchkiss A.T., Fishman M.L. - J. Agric.Food. Chem., 2002, v. 53, p.2255-2260.
8. Savary B.J. - Prep. Biocem. & Biotechnol., 2001, 31(3), p.241-258.
9. Savary B.J., Hotchkiss A.T., Fishman M.L., Cameron R.G., Shatters R.G. - F.Vorangen et al. (eds.). Advances in Pectin and Pectinase Reseach, Kluwer Academic Pulishers. Printed in the Netherlands, 2003, p.345-361.
10. Кахана Б.М. Биохимические методы анализа плодов. - Кишинев, 1984, c.36-42.
11. Verjce L.H. M. - European J. Biochem., 1969, v. 9, №3, p.439-444.
А.Абдуллоев, Б.Б.Чумъаев, Н.Б.Чумъаев, З.^.Мухиддинов ФАЪОЛИЯТИ ФЕРМЕНТИ ПЕКТИНМЕТИЛЭСТЕРАЗАИ ПАРТОВ^ОИ
МЕВА^ОИ СЕБ ВА АФЛЕСУН
Дар мак;ола натичах,ои алокдмандии фаъолияти ферменти пектинметилэстеразаи партови мевах,ои себ ва афлесун аз харорот ва рН-мух,ит оварда шудааст. Натичах,ои ба даст оварда шуда нишон доданд, ки пектинметилэстеразаи аз партовх,ои меваи себ ва афлесун чудо кардашуда дар харорати баланд +37 ... +60°С фаъол мебошад.
Фаъолияти ин фермент вобаста аз рН-мух,ит бошад, дар харду маводи партови мевах,о якхела тагйир меёбад.
A.Abdullaev, B.B.Jumaev, N.B.Jumaev, Z.K.Muhidinov PECTIN METHYL ESTERASE ACTIVITY IN APPLE AND ORANGE PULPS
The results of pectin methylesterase activity from apple, orange pulp and orange peel depending of pH and temperature are discussed. It’s shown that the methyl esterase activity from apple and orange pulps higher in range of temperatures from +37...+60° C. The analysis of dependence of its activity from pH has shown that in both case the enzyme activity increase with increase of pH.
