CC BY
84
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013
АКТИВНОСТЬ НЕКОТОРЫХ ФЕРМЕНТОВ В НЕЙРОНАХ ФРОНТАЛЬНОЙ КОРЫ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС В РАННИЙ ПОСТИШЕМИЧЕСКИЙ ПЕРИОД
РУКАН Т.А.*, МАКСИМОВИЧ Н.Е.*, ЗИМАТКИН С.М.**
УО ««Гродненский государственный медицинский университет», кафедра патологической физиологии им. Д.А. Маслакова,* кафедра гистологии, цитологии и эмбриологии**
Резюме. Исследования выполнены на 21 лабораторной крысе. Установлено, что ранний постише-мический период характеризуется нарушением энергетического обмена. Отмечается снижение активности сукцинатдегидрогеназы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и повышение активности лактатдегидрогена-зы, также отмечен рост активности кислой фосфатазы в нейронах 2-го, 3-го и 5-го слоев фронтальной коры головного мозга крыс. Полученные результаты указывают на целесообразность коррекции активности сукцинатдегидрогеназы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, лактатдегидрогеназы и кислой фосфатазы в период восстановления кровотока при ишемии головного мозга с целью нормализации энергетических и пластических процессов, а также функциональной активности нейронов в нервной ткани.
Ключевые слова: ферменты, нейроны, мозг, постишемический период, крысы.
Abstract.Twenty one laboratory rats have been used in the research. It has been determined that the early postischemic period is characterized by disturbances of energy metabolism. The reduction in the activity of succinate dehydrogenase, glucose-6-phosphate dehydrogenase and the increase in the activity of lactate dehydrogenase, acid phosphatase in neurons of the 2nd, 3rd and 5th layers of the frontal cortex of rats’ brain have been noticed. The obtained results indicate the expediency to correct the activity of succinate dehydrogenase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, lactate dehydrogenase and acid phosphatase in the period of blood flow restoration in cerebral ischemia with the purpose of normalizing energy and plastic processes as well as functional neurons activity in the nervous tissue.
Key words: enzymes, neurons, brain, postischemic period, rats.
Острые нарушения мозгового кровообращения в настоящее время являются одной из ведущих причин летальности и инвалидизации больных неврологического профиля. Среди различных видов острых нарушений мозгового кровообращения ведущее место занимает ишемический инсульт. Частота его возник-
Адрес для корреспонденции: 230009, г. Гродно, ул.Горького, 80, УО «Гродненский государственный медицинский университет», кафедра патологической физиологии им. Д.А. Маслакова. E-mail: TBurger@mail.ru - Рукан Татьяна Александровна.
новения составляет 80% среди всех причин возникновения инсультов [1, 2]. Несмотря на многообразие причин, вызывающих ишемические повреждения мозга, одним из этапов патогенеза является энергодефицит, к которому клетки головного мозга чувствительны в наибольшей степени. Энергия необходима нейронам для синтетических процессов, реализации рецепторной функции, работы ионных каналов, выполнения специфических для нейронов мозга функций. Ограничение поступления кислорода - конечного акцептора электронов - в клетку при ишемии тормозит активность
окислительно-восстановительных процессов в дыхательной цепи, приводя к снижению синтеза АТФ [3, 4]. Важными ферментами-маркерами, используемыми для оценки энергетического обмена, являются сукцинатдегидрогеназа (СДГ), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (Гл-6-ФДГ), лак-татдегидрогеназа (ЛДГ). СДГ - один из важнейших ферментов цикла Кребса - фла-вопротеин, прочно связанный с внутренней мембраной митохондрий, катализирующий дегидрирование сукцината с образованием фумарата. Уменьшение его активности свидетельствует о нарушении энергетической функции митохондрий в нейронах. Гл-6-ФДГ является важным ферментом начальных этапов пентозофосфатного пути (ПФП), обеспечивающим восстановление кофермента КАБРЫ, необходимого для синтеза рибоз, пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов, липидов. Согласно данным литературы, степень угнетения глюкозо-6-фосфатдегидрогеназной активности у пациентов с ишемией головного мозга соответствует тяжести гипоксии и является одним из критериев оценки эффективности проводимого лечения [5].
ЛДГ - фермент анаэробного гликолиза, участвует в начальных этапах энергообразования, катализирует реакцию взаимопревращения пирувата в лактат. Повышение активности ЛДГ свидетельствует об активации анаэробного гликолиза, что наблюдается при нарушении аэробного гликолиза.
Кислая фосфатаза (КФ) - маркерный фермент лизосом. Повышение его активности отражает усиление процессов ауто-фагии в цитоплазме как следствие усиления процессов деструкции внутриклеточных структур в результате нарушения их энергоснабжения [6].
В связи с важностью поддержания энергетического обмена при ишемии головного мозга является актуальным изучение состояния активности вышеперечисленных ферментов в реперфузионный период, т.е. при восстановлении кровотока.
Целью исследования было оценить активность ферментов энергетического об-
мена и кислой фосфатазы в нейронах фронтальной коры мозга крыс в ранний пости-шемический период.
Методы
Эксперименты проведены на лабораторных крысах-самцах (n=21) массой 200250 г. Выбор экспериментальных животных обусловлен сходством ангиоархитектоники головного мозга крыс и человека. Животные содержались на стандартном рационе для лабораторных крыс и имели свободный доступ к воде. Все эксперименты одобрены этическим комитетом ГрГМУ.
Животные разделены на 3 группы -по 7 крыс в каждой группе. Контрольную группу (группа 1) составили ложноопери-рованные животные, которым воспроизводилась наркотизация, кожный разрез и выделение артерий без последующей перевязки сосудов. Ишемию головного мозга моделировали с помощью двухсторонней перевязки общих сонных артерий продолжительностью 30 минут под внутривенным тиопенталовым наркозом (б0 мг/кг). Животных забивали после 30-минутной ишемии головного мозга (ИГМ) - группа 2 и спустя 30 минут после восстановления кровотока - ишемия-реперфузия головного мозга (И-Р ГМ) - группа 3.
После декапитации животных быстро извлекали головной мозг, кусочки фронтальной коры фиксировали в жидком азоте. Срезы толщиной 20 мкм готовили на криостате Leica CM 1850, окрашивали на выявление активности ферментов лак-татдегидрогеназы (ЛДГ; L-лактат: НАДН оксидоредуктаза; КФ 1.1.1.27), сукци-натдегидрогеназы (СДГ; сукцинат: ак-
цептор - оксидоредуктаза; КФ 1.3.99.1), глюкозо-б-фосфатдегидрогеназы (Гл-б-ФДГ ; D-глюкозо-б-фосфат: НАДФ-
оксидоредуктаза; КФ 1.1.1.49) и кислой фосфатазы (КФ; фосфогидролаза моноэфиров ортофосфорной кислоты; КФ 3.1.3.2) [7]. Фотографирование препаратов осуществляли с помощью микроскопа Axioscope 2 plus и цифровой видеокамеры Leica DFC 320. Активность дегидрогеназ и КФ оце-
нивали в цитоплазме нейронов 2-го, 3-го и 5-го слоев фронтальной коры с помощью компьютерного анализатора изображений, измеряя оптическую плотность, с использованием программы Image Warp (США).
Результаты выражали в виде медианы (Ме) и рассеяния (25, 75 процентилей). Для сравнения величин использовался непараметрический критерий Манна-Уитни. Различия считались достоверными при р<0,05. Статистическую обработку данных осуществляли с применением пакета STATISTICA 6.0.
Результаты
В цитоплазме нейронов 2-го, 3-го и 5-го слоев активность СДГ при ИГМ уменьшилась на 52%, 51% и 59% соответственно, по сравнению с активностью фермента в контрольной группе (р<0,05), а при И-Р ГМ - на 41%, 34% и 54% соответственно, по сравнению со значениями показателей в нейронах животных контрольной группы (р<0,05) (табл.), что свидетельствовало о более выраженном угнетении аэробного гликолиза в нейронах изученных слоев коры головного мозга. Наиболее существенные изменения активности СДГ отмечались в нейронах 5-го слоя коры головного мозга.
Ишемия головного мозга привела к снижению активности Гл-6-ФДГ во всех исследованных слоях фронтальной коры. Отмечено снижение активности фермента Гл-6-ФДГ при ИГМ (группа 2) в нейронах 2-го, 3-го и 5-го слоев на 36%, 37% и 35% соответственно, по сравнению с активностью фермента в группе контроль (р<0,05). При восстановлении кровотока (группа 3) активность фермента в нейронах 2-го, 3-го и 5-го слоев возросла на 10%, 13% и 15% соответственно, по сравнению со значениями показателя у крыс с ишемией головного мозга (р<0,05), однако осталась меньше на 30%, 29% и 26% соответственно, по сравнению с его активностью в контрольной группе (р<0,05) (рис. 1).
В отличие от изменений активности СДГ, восстановление кровотока привело к незначительному увеличению активности Гл-6-ФДГ, по сравнению со значением показателя у крыс с ишемией мозга, без достижения уровня активности этого фермента в контрольной группе.
Ишемия головного мозга привела к активации ЛДГ во всех исследуемых слоях фронтальной коры. При исследовании активности фермента ЛДГ в нейронах 2-го, 3-го и 5-го слоях отмечено ее повышение в 1,5 раза, 1,8 раза и в 1,6 раза соответственно при ИГМ, по сравнению с активностью
Таблица
Гистохимическое исследование ферментов в нейронах 5-го слоя фронтальной коры головного мозга крыс при его ишемии-реперфузии
Группы животных Активность исследуемых ферментов ( ед. опт. пл.)
СДГ Гл-6-ФДГ ЛДГ КФ
Контроль 0,208 (0,184; 0,213) 0,209 (0,201; 0,212) 0,079 (0,074; 0,122) 0,231 (0,208; 0,236)
ИГМ 0,086 1* (0,077; 0,094) 0,135 1* (0,132; 0,144) 0,127 t* (0,115; 0,144) 0,609 t* (0,525; 0,680)
И-Р ГМ 0,096 1* (0,073; 0,137) 0,155 !*, !л (0,149; 0,158) 0,178 t^ (0,133; 0,215) 0,589 t* (0,521; 0,662)
Примечание: * - статистически значимые различия с контрольной группой (р<0,05); л - статистически значимые различия с группой ИГМ (р<0,05); СДГ - сукцинатдегидрогеназа; ЛДГ - лактатдегидрогеназа; ГЛ-6-ФДГ - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа; КФ - кислая фосфатаза. ИГМ - ишемия головного мозга; И-Р ГМ - ишемия-реперфузия головного мозга.
Рис. 1. Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в нейронах 5-го слоя фронтальной коры мозга крыс при его ишемии-реперфузии: 1 - контроль, высокая активность фермента в нейронах; 2 - ишемия мозга, снижение активности фермента в нейронах;
3 - ишемия-реперфузия мозга, незначительное увеличение активности фермента в нейронах. Окраска по Гесс, Скарпелли и Пирсу. Ув. 400. Микрофотография.
фермента в контрольной группе (р<0,05) и почти в 2 раза, в 2,3 раза и в 2 раза соответственно при И-Р ГМ по сравнению с активностью ЛДГ в контрольной группе (р<0,05). Причем восстановление кровотока привело к усугублению возникающих при ишемии мозга изменений активности этого фермента. Отмечался рост активности ЛДГ при ишемии-реперфузии головного мозга в нейронах 3-го и 5-го слоев возросла в 1,3 и в 1,2 раза соответственно, по сравнению с ее активность в нейронах крыс с ИГМ (р<0,05).
При исследовании маркерного фермента лизосом - кислой фосфатазы отмечалось увеличение его активности во всех исследуемых слоях коры мозга, но более усиленно - в нейронах 5-го слоя коры как при ишемии, так и при ишемии-реперфузии головного мозга. При ИГМ активность КФ в нейронах 2-го, 3-го и 5-го слоев возросла в 2 раза, 2,1 раза и 2,6 раза, а при И-Р ГМ - в 1,9 раза, 2,1 раза и 2,5 раза, соответственно, по сравнению с ее активностью в контрольной группе (р<0,05) (рис. 2).
Обсуждение
В результате проведенных исследований выявлены изменения в активности ферментов энергетического обмена и лизо-сомального фермента - кислой фосфатазы в нейронах всех исследуемых слоев фрон-
тальной коры мозга. У крыс с ишемией головного мозга отмечалось снижение активности СДГ, которая при восстановлении кровотока не изменилась, свидетельствуя о сохранении энергодефицита у крыс в ранний постишемический период. Несмотря на реоксигенацию в ранний реперфузионный период, корригирования аэробных энергетических процессов не произошло. Это подтверждается дальнейшей активацией ЛДГ, фермента, отражающего активность анаэробных процессов при ишемии-реперфузии мозга. В то же время активность фермента пентозофосфатного пути - Гл-6-ФДГ в ранний реперфузионный период незначительно возросла, в отличие от активности СДГ, не достигнув при этом уровня активности фермента в контрольной группе. Корригирование активности Гл-6-ФДГ свидетельствовало о незначительном улучшении работы ПФП и возможном устранении дефицита восстановленного NAD.
Рост активности фермента лизосом -кислой фосфатазы в ишемический и ранний реперфузионный периоды, может указывать на дестабилизацию мембран органелл вследствие имеющего места энергодефицита.
Заключение
Ранний постишемический период характеризуется нарушением энергетиче-
Рис. 2. Активность кислой фосфатазы в нейронах 5-го слоя фронтальной коры мозга крыс при его ишемии-реперфузии: 1 - контроль, низкая активность фермента в нейронах;
2 - ишемия мозга, увеличение активности фермента в нейронах;
3 - ишемия-реперфузия мозга, активность фермента в нейронах остается на высоком уровне.
Окраска по Гомори. Ув. 400. Микрофотография.
ского обмена. Как и при ишемии в ранний период восстановления кровотока отмечалось снижение активности СДГ и Гл-6-ФДГ и повышение активности ЛДГ, маркера анаэробных процессов. Также отмечен рост активности кислой фосфатазы - фермента, характеризующего интенсивность катаболических процессов и возможного фактора митохондриальных нарушений. Полученные результаты указывают на целесообразность коррекции активности СДГ, Гл-6-ФДГ, ЛДГ и КФ в период восстановления кровотока при ишемии головного мозга с целью нормализации энергетических и пластических процессов, а также функциональной активности нейронов в нервной ткани.
Литература
1. Виберс, Д.О. Инсульт. Клиническое руководство / Д.О. Виберс, В.Л. Фейгин, Р.Д. Браун. -
Санкт-Петербург, 2005. - 607 с.
2. Durukan A., Acute ischemic stroke: Overview of major experimental rodent models, pathophysiology, and therapy of focal cerebral ischemia / A. Durukan, T. Tatlisumak // Pharmacol Biochem Behav. - 2007. - Vol. 87. - P. 179-197.
3. Нечипуренко, Н.И. Основные патофизиологические механизмы ишемии головного мозга / Н.И. Нечипуренко, И.Д. Пашковская, Ю.И. Мусиенко // Медицинские новости. - 2008. - № 1. - С. 7-13.
4. Афанасьев, В.В. Патофизиология и нейропро-тективная терапия ишемического повреждения головного мозга / В.В. Афанасьев, С.А. Румянцева, Е.В. Силина // Журнал «Медицинский Совет». - 2008. - № 9-10. - С. 35-39.
5. Румянцева, С.А. Антиоксидантная терапия ци-тофлавином инфарктов головного мозга / С.А. Румянцева, О.Р. Кузнецов // Материалы IV сессии МНОАР. - Голицыно, 2003. - С. 43-44.
6. Боголепов, Н.Н. Ультраструктура мозга при гипоксии / Н.Н. Боголепов - М.: Медицина. -1979. - 168 с.
7. Пирс, Э. Гистохимия: теоретическая и прикладная / Э. Пирс. - М.: Ин. лит. - 1962. - 962 с.
Поступила 24.04.2013 г. Принята в печать 07.06.2013 г.
Сведения об авторах:
Рукан Т.А. - аспирант кафедры патологической физиологии им. Д.А. Маслакова УО «ГрГМУ», Максимович Н.Е. - д.м.н., профессор, зав. кафедрой патологической физиологии им. Д.А. Маслакова УО «ГрГМУ»,
Зиматкин С.М. - д.б.н., профессор, зав. кафедрой гистологии, цитологии и эмбриологии УО «ГрГМУ».
