CC BY
55Фізика живого, Т16, No 1, 200S. С.144-148.
© ГайдаЛ.М., Дробінська О. В., ТимошенкоМ.О., ОстапченкоЛ.І.
УДК 577.152.193:577.152.25:616.3-002.27
АКТИВНІСТЬ ГЛУТАТІОНЗАЛЕЖНИХ ФЕРМЕНТІВ ПАРІЄТАЛЬНИХ КЛІТИН ТА ГЕПАТОЦИТІВ ЗА УМОВ РОЗВИТКУ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО АТРОФІЧНОГО ГАСТРИТУ
Гайда Л.М., Дробінська О. В., Тимошенко М.О., Остапченко Л.І.
1 Київський національний університет ім. Тараса Шевченка, біологічний факультет, кафедра біохімії; e-mail: [email protected]
Надійшла до редакції 10.05.2008
Досліджено активність глутатіонпероксидази та глутатіонтрансферази в парієтальних клітинах та гепатоцитах щурів за умов розвитку експериментального атрофічного гастриту. Встановлено, що зміни активності глутатіонтрансферази мали різнонаправлений характер в досліджуваних клітинах. В гепатоцитах на певних етапах розвитку патології активність ферменту змінювалась по-різному: на ранніх та пізніх - знижувалась, на 3,4 тиждень зростала. В парієтальних клітинах спостерігається активація глутатіонтрансферази на другий тиждень розвитку патології, тоді як на кінцевому етапі активність досліджуваного ферменту знижується. Активність глутатіонпероксидази в парієтальних клітинах в усі терміни спостереження статистично достовірно знижувалась, а в гепатоцитах така тенденція спостерігалась на 3,4 тиждень розвитку атрофічного гастриту.
Встановлені порушення функціонування глутатіонтрансферази та глутатіонпероксидази в парієтальних клітинах та гепатоцитах можуть свідчити про можливість залучення глутатіонової системи до складних біохімічних механізмів розвитку атрофічного гастриту та до хронізації патологічного процесу.
Ключові слова глутатіонпероксидаза, глутатіонтрансфераза, атрофічний гастрит, парієтальні клітини.
ВСТУП
Актуальність проблеми хронічного атрофічного гастриту (ХАГ) зумовлена значним поширенням цієї хвороби у структурі захворювань шлунково-кишкового тракту та його безпосереднім зв’язком з раком шлунку, який в більшості випадків діагностують на пізніх стадіях розвитку пухлинного процесу [1,2].
Відомо, що атрофічний гастрит супроводжується дистрофічними змінами клітин поверхневого епітелію, суцільною запальною інфільтрацією слизової оболонки та зменшенням кількості спеціалізованих залоз одного або кількох відділів шлунку [3]. Наслідком цього захворювання є дисплазія, метаплазія і злоякісна трансформація клітин. Дані літератури і наші попередні результати свідчать, що порушення окисного гомеостазу, який характеризується підвищенням вмісту продуктів перекисного окислення ліпідів на фоні зниження функціональних можливостей антиоксидантної системи є одним із патогенетичних факторів виникнення і рецидиву атрофічного гастриту [1]. Продукти перекисного окислення ліпідів мають цитотоксичну та антимітотичну дію, ушкоджують мембрани епітеліальних клітин слизової оболонки
шлунку, викликають зміни в їх проникності та структурно-функціональній цілісності. При підвищенні концентрації активних форм кисню зростають окислювальні пошкодження ДНК, накопичуються зміни в геномі, пов’язані з протіканням окисно-відновних процесів, що призводить до збільшення кількості мутацій. Сполуки, що є промоторами пухлинного росту, стимулюють утворення активних форм кисню. Важливим чинником, від якого залежить концентрація вільних радикалів у клітинах організму є кооперативна робота ферментів антиоксидантної системи, однією із ланок якої є система глутатіону.
Глутатіонова антиоксидантна система ферментів, яка включає глутатіонпероксидазу (ГП),
глутатіонредуктазу та глутатіонтрансферазу (ГТ) перешкоджає накопиченню токсичних продуктів перекисного окислення ліпідів (ПОЛ), відіграє важливу роль в детоксикації, деградації та виведенні із організму чужорідних органічних субстанцій. Експериментальними та клінічними дослідженнями встановлено, що система глутатіону бере участь в механізмах регуляції проліферації та апоптозу [4], які залучені в патогенез хронічного атрофічного гастриту [1]. Метою нашої роботи було дослідити активність глутатіонпероксидази та глутатіонтранс-
ферази у парієтальних клітинах та гепатоцитах в динаміці розвитку експериментального атрофічного гастриту.
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
У роботі дотримувалися міжнародних рекомендацій про проведення медично-біологічних досліджень з використанням тварин згідно Європейської конвенції. В досліді використовували білих лабораторних нелінійних щурів-самців з початковою масою 150-200 г. і утримували на стандартному раціоні віварію. Групі тварин, протягом 6 тижнів вводили 2% саліцилат натрію інтрагастрально, а питну воду заміняли на 20 мМ дезоксихолат натрію [5]. Виділення парієтальних клітин [6] та гепатоцитів [7], а також визначення активностей ферментів проводили на 1-й, 2-й, 3-й, 4-й, 5-й і 6-й тиждень розвитку атрофічного гастриту. Активність глутатіонпероксидази визначали за накопиченням окисленого глутатіону (0880) у середовищі об’ємом 2 мл, що містило 150 мМ фосфатний буфер (рН 7,4); 6 мМ азид натрію, 3 мМ ЕДТА; 0,6 мМ відновлений глутатіон; 0,45 мМ Н2О2 та 30 мкг білку [8]. Визначення активності глутатіонтрансферази проводили в супернатанті і оцінювали за швидкістю утворення кон’ югату з 1-хлор-2,4-динітробензолом, який характеризується максимумом поглинання при 340 нм [9]. Активність ферменту перераховували на мг білку, вміст якого визначали за методом Бредфорд [10]. Результати статистично обробляли за ^критерієм Стьюдента.
Розвиток атрофічного гастриту підтверджували гістологічними дослідженнями. Відбирали зразки кардіальної, фундальної та пілоричної частин шлунку, які обробляли за стандартними методами. Зразки забарвлювали гематоксиліном та еозином.
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ
Хронічний атрофічний гастрит в експерименті отримували за умов введення саліцилату натрію (інгібітора простогландинциклогенази), при цьому у щурів через 3-4 тижні спостерігалося ураження слизової шлунку, яке посилювалось деоксихолатом натрію. Останній, розчиняючи захисний
поверхневий шар слизу, стимулював рефлюкс жовчі із дванадцятипалої кишки [5].
В результаті гістологічних досліджень на початкових етапах розвитку ХАГ (2-3 тижні) спостерігалося потовщення слизової оболонки на 1015%, що можна пояснити гіперпроліферацією стовбурових клітин у відповідь на дію пошкоджуючих агентів [5]. На 5-6 тиждень експериментальної моделі товщина слизової зменшувалася в порівнянні з контролем. На пізніх
етапах ХАГ спостерігалося часткове розгладження макроскопічних складок шлунку. Залози розташовувались невпорядковано, їх кількість зменшилась в порівнянні з контролем (Р>0,05). Починаючи з 3-го тижня спостерігалося проростання сполучної тканини в основу залоз, а також лімфоцитарна інфільтрація (4-й т), що є стійкою ознакою хронічного атрофічного гастриту [11].
Глутатіонзалежні ферменти, такі як глутатіонпероксидаза та глутатіонтрансфераза є ключовими в механізмах захисту клітин від екзогенних та ендогенних токсичних сполук та вільних радикалів, які виникають у відповідь на пошкодження слизової оболонки шлунку. Узгоджена робота глутатіонпероксидази та глутатіонтрансферази попереджає подальшому прогресуванню пероксидації, розповсюдження неферментативних реакцій, накопичення вторинних метаболітів [12].
Встановлено, що в динаміці розвитку атрофічного гастриту в усі терміни дослідження активність глутатіонпероксидази статистично достовірно знижується в парієтальних клітинах в середньому на 39% і на 6 тиждень розвитку патології становить на 59% нижче від контрольних показників (рис.1.). Зниження активності глутатіонпероксидази може стати важливим чинником ініціації процесів ліпопероксидації та накопичення її продуктів, які, в свою чергу, можуть призвести до патологічних наслідків [13].
Відновлення пероксиду водню та органічних гідроперекисів - це головна функція глутатіонпероксидази. Однак, треба зауважити, що метаболізуючи ЯООИ, глутатіонпероксидаза може попереджувати накопичення вторинних продуктів пероксидації, але вона не здатна знешкодити їх. На відміну від глутатіонпероксидази глутатіонтранс-фераза успішно метаболізує шляхом кон’югації з 08И вторинні метаболіти [13,14].
Глутатіонтрансферази - універсальні ферменти, які шляхом трансформації, нековалентного зв’язування і ковалентного приєднання запобігають пошкодженню ДНК, мітохондрій та інших життєво важливих центрів клітини від реактивних метаболітів і в результаті значно збільшують стійкість клітини і організму в цілому [15].
Згідно з даними, представленими на рис.2, на перший тиждень в парієтальних клітинах спостерігається тенденція до зниження глутатіонтрансферазної активності, що може бути обумовлена надлишком утворюваних, внаслідок розвитку запального процесу, токсичних метаболітів кисню. Відмічається виражене підвищення активності глутатіонтрансферази на 62% на другий тиждень розвитку атрофічного гастриту.
Гайда Л.М., Дробінська О. В., Тимошенко М. О., Остапченко Л.І.
Рис.1. Активність глутатіонпероксидази в парієтальних Рис.2. Активність глутатіонтрансферази в парієтальних
клітинах за умов розвитку експериментального атрофічного гастриту щурів.
Примітки: 1 - контроль; 2,3,4,5,6,7 - перший, другий, третій, четвертий, п’ятий та шостий тижні розвитку експериментального атрофічного гастриту, відповідно;* різниця вірогідна в порівнянні з контролем, р < 0,05.
клітинах за умов розвитку експериментального атрофічного гастриту щурів.
Примітки: * різниця вірогідна в порівнянні з контролем, р < 0,05.
Рис.3. Активність глутатіонтрансферази в гепатоцитах за умов розвитку експериментального атрофічного гастриту щурів.
Примітки: * різниця вірогідна в порівнянні з
контролем, р < 0,05.
Рис.4. Активність глутатіонпероксидази в гепатоцитах за умов розвитку експериментального атрофічного гастриту щурів.
Примітки: * різниця вірогідна в порівнянні з контролем, р < 0,05.
Підвищення активності ГТ може свідчити про активацію процесів знешкодження продуктів перекисного окислення ліпідів, ксенобіотиків в результаті реакцій нуклеофільного заміщення та приєднання, а також про участь ферменту в ендогенному метаболізмі, що забезпечує локальний захист клітин в результаті впливу саліцилату та деоксихолату натрію на слизову оболонку шлунка.
На 6-му тижні експериментальної моделі встановлено достовірне зниження глутатіонтранс-феразної активності на 35%, яке супроводжувалось частковим розгладженням макроскопічних складок шлунку, проростанням сполучної тканини в основу залоз, що є стійкою ознакою перетворення гострого запального процесу в хронічний. Відомо, що ГТ високоспецифічна до 08Н і зниження пулу відновленого глутатіону може призвести до падіння активності ферменту на пізніх етапах розвитку експериментального атрофічного гастриту. [14,15]
Нами встановлено, що за умови розвитку експериментального атрофічного гастриту активність глутатіонтрансферази в гепатоцитах значно варіювала в залежності від термінів досліджень.
На перший та другий тиждень розвитку атрофічного гастриту активність глутатіонтранс-ферази знижується на 31 та 20%, відповідно, що може бути обумовлене надлишком утворюваних, внаслідок розвитку запального процесу, токсичних метаболітів кисню (рис.3). При цьому на рівні контролю залишалися показники активності ГП (рис.4.). Ріст активності ГТ спостерігається на 3,4 тиждень і становить на 93% та 122% вище контрольних значень, відповідно. Водночас, глутатіонпероксидазна активність знижується на 22 та 30%. Відомо, що глутатіонтрансферази не впливають на пероксид водню, але проявляють очевидну глутатіонпероксидазну активність по
відношенню до ендогенних субстратів -гідроперекисів поліненасичених жирних кислот. Тому, активація глутатіонтрансферази може розглядатися як компенсаторна реакція в умовах пригнічення глутатіонпероксидази. В даному випадку можна прийти до висновку про реципрокну дію ГП та ГТ в розвитку метаболічних процесів [13].
Нами встановлено достовірне зниження глутатіонтрансферазної активності на 28% та 32 % в гепатоцитах щурів на 5,6-й тиждень розвитку атрофічного гастриту. Показники активності глутатіонпероксидази на пізніх етапах розвитку досліджуваної патології знаходилися в межах контрольних величин.
Порівнюючи показники активності ферменту в гепатоцитах та парієтальних клітинах можна зробити висновок, що активація ГТ відбувається в різні часові інтервали розвитку захворювання. Так, у парієтальних клітинах це відбувається вже на 2 тиждень, тоді як в гепатоцитах - на 3,4. Такі зміни можуть свідчити про ранню активацію антирадикальної глутатіонової системи в парієтальних клітинах, що відбувається у відповідь на інтрагастральне введення саліцилату та дезоксихолату натрію. Слід також відмітити, що в нормальних гепатоцитах щурів дезоксихолат присутній [5], тому це може відігравати специфічну фізіологічну роль в модуляції активності глутатіонтрансферази та глутатіонпероксидази печінки.
ВИСНОВКИ
Таким чином, аналіз представленого матеріалу дозволив виявити особливості функціонування глутатіонзалежних ферментів в парієтальних клітинах та гепатоцитах за умов розвитку експериментального атрофічного гастриту щурів. Пошкодження слизової оболонки шлунку за умов розвитку захворювання посилюють декомпенсацію механізмів антирадикального захисту: в
парієтальних клітинах пригнічується активність глутатіонпероксидази і глутатіонтрансферази, що може бути однією із причин порушення проліферації клітин і хронізації патологічного процесу.
Література
1. Букин Ю.В., Драудин-Криленко В.А. Молекулярно биологические механизмы гастроканцерогенеза и подходы к профилактике рака желудка // Успехи биол.химии. - 2000. - Т.40. - С. 329-356.
2. Фадєєнко Г.Д.,. Просоленко К.О,. Соломенцева Т.А Атрофічний гастрит: механізми виникнення, окремі
питання діагностики та оборотності розвитку // Сучасна гастроентерологія. - 2007. - Т. 34, № 2. -С. 7 - І3
3. Бабак О.Я. Атрофический гастрит: прогнозы и перспективы // Здоров'я України. - 200б. - № 21/1 (додатковий). - С. 2б - 27.
4. Coppola S, Ghibelli L. GSH extrusion and the mitochondrial pathway of apoptotic signaling // Biochemical Society Transactions.- 2000.- Vol. 28, (part 2). - P. 5б-б1.
5. Wang L., Chen S., Chen Z., Cai J., Si J. Morphological and pathologic changes of experimental chronic atrophic gastritis (CAG) and the regulating mechanism of protein expression in rats // J. Zhejiang Univ. Science.- 200б.-Vol. 7(8). - P. б34-б40.
6. Таиров М.М., Берсимбаев Р.И., Аргутинская С.В.,Салгани Р. И. Клеточная локализация аденилатциклаз, стимулируемых гистамином и простагландином Е2, в слизистой оболочке желудка крыс и их роль в регуляции желудочной секреции // Биохимия. - І983. - Т.48. - №б. - С. І035-І04І.
7. Петренко А.Ю., Сукач А.Н., Росляков А.Д.
Выделение гепатоцитов крыс неферментативным методом: детоксикационная и дыхательная
активности // Биохимия. - 1991. - Т. 5б, Вып. 9. -С. 1б47-1б50.
8. Habig W.H., Parst M.J., Jakobv W.B. Glutathione-S-transferases. The first enzymatic step in mercapturie acid formation // J. Biol. Chem. - І974. - Vol. 249, № 22. - P. 7І30 - 7І39
9. Власова С. Н., Шабунина Е.И., Перслегина И. А. Активность глутатион-зависимых ферментов эритроцитов при хронических заболеваниях печени у детей // Лаб. дело. - І990. - № 8. - С. І9 - 22.
10. Шоно Н.И., Баскаева Е.М. Метод определения белка по Бредфорд: область применения, преимущества, недостатки. // Лаб. дело. - І980 - № 4. - С. 4-7.
11. Коган Е.А. Патоморфология предрака // Рос. журн.гастроэнтерол., гепатол. и колопроктол. - 2002. - № 5. - С. 54 - 58.
12. Мазо В. К. Глутатион как компонент
антиоксидантной системи желудочно-кишечного
тракта // Рос. журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - І998. - № І. -С. 47 - 53.
13. Кулинский В.И., Колесниченко Л.С. Структура,
свойства, биологическая роль и регуляция
глутатионпероксидазы // Успехи современной
биологии. - І993. - Т. ІІ3, вып. І. - С. І07-І2І.
14. Колесниченко Л. С., Кулинский В. И.
Глутатионтрансферазы. - Успехи современной
биологии // І989. - Т. І07, №2. - С. І79-І94.
15. Кахновер Н. Б., Хмелевский Ю. В. Глутатион-S-трансферазы, ферменты детоксикации // Укр. Биохим. Журнал. - І983. - Т. 55, №1. - С. 25 - 32.
Гайда Л.М., Дробінська О. В., Тимошенко М. О., Остапченко Л.І.
АКТИВНОСТЬ ГЛУТАТИОНЗАВИСИМЫХ ФЕРМЕНТОВ ПАРИЕТАЛЬНЫХ КЛЕТОК И ГЕПАТОЦИТОВ В УСЛОВИЯХ РАЗВИТИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО АТРОФИЧЕСКОГО ГАСТРИТА
Гайда Л. Н., Дробинская Л.В., Тимошенко М.А., Остапченко Л.И.
Исследовано активность глутатионпероксидазы и глутатиотрансферазы в париетальных клетках и гепатоцитах в условиях развития экспериментального атрофического гастрита. Установлено, что изменение активности глутатионтрансферазы имели разнонаправленный характер в исследуемых клетках. В гепатоцитах на некоторых этапах развития патологии активность фермента изменялась по-разному: на ранних и поздних - снижалась, на 3,4 неделе повышалась. В париетальных клетках наблюдалась активация глутатионтрансферазы на второй неделе развития патологии, тогда как на конечном этапе активность исследуемого фермента снижалась. Активность глутатионпероксидазы в париетальных клетках во все сроки наблюдения статистически достоверно снижалась, а в гепатоцитах подобная тенденция наблюдалась на 3,4 неделе развития атрофического гастрита.
Установленые нарушения функционирования глутатионтрансферазы и глутатиопероксидазы в париетальных клетках и гепатоцитах могут свидетельствовать о вовлечении глутатионовой системы в сложные биохимические механизмы развития атрофического гастрита и к хронизации патологического процесса.
Ключевые слова: глутатионпероксидаза, глутатионтрансфераза, атрофический гастрит, париетальные клетки.
THE GLUTATHIONE-DEPENDENT ENZYME ACTIVITY IN RAT PARIETAL CELLS AND HEPATOCYTES UNDER EXPERIMENTAL ATROPHIC GASTRIRTIS
Gayda L.M., Drobinska O.V., Tymoshenko M.A., Ostapchenko L.I.
Activity of glutathioneperoxidase and glutathionetransferase were investigated in rat parietal cells and hepatocytes during chronic atrophic gastritis model. We discovered that glutathionetransferase activity varied in investigated cells. In hepatocytes enzyme activity changed diffenently according disease progression: on early stages it decreased with subsequent increase on 3rd and 4th week. In parietal cell activation of glutathionetransferase was observed on 2nd week of pathology, whereas during final period of disease activity of investigated enzyme fell. Activity of glutathioneperoxidase in parietal cells decreased (statistically sugnificent) during all period of investigations. In hepatocytes this tendention was observed only on 3rd-4th week of experimental model.
Observed changes of glutathioneperoxidase and glutathionetransferase function in parietal cells and hepatocytes could proof evidence that glutathione system is heavily involved in complex biochemical mechanisms of atrophic gastritis development and processes that lead to decease persistence.
Key words: glutathione peroxidase, glutathione transferase, сhronic atrophic gastritis, parietal cells.
