CC BY
33
Известия Самарского научного центра Российской академии наук. 2009. Т. 11, № 1 УДК 574.5:591.05+592
АКТИВАЦИЯ АНТИОКСИДАИТНОЙ СИСТЕМЫ У БАЙКАЛЬСКОГО ЛИТОРАЛЬНОГО ВИДА EULIMNOGAMMARUS VERRUCOSUS
© 2009 М.А. Тимофеев
Иркутский государственный университет, г. Иркутск e-mail: [email protected] Поступила 17.03.2008
В представленной работе у байкальского эндемика Eulimnogammarus verrucosus (Gerstf.) оценивали характер активации антиоксидантных ферментов при окислительном стрессе. Для исследования были выбраны следующие ферменты: пероксидаза, каталаза и глутатион-S-трансфераза.. Как показали проведенные эксперименты, экспозиция E. verrucosus в растворах гуминсодержащего препарата приводит к достоверным изменениям в показателях активности антиоксидантных ферментов каталазы и пероксидазы, тогда как активность глутатион-S-трансферазы остается стабильной.
Ключевые слова: активации антиоксидантных ферментов, эндемик, Eulimnogammarus verrucosus, Байкал.
ВВЕДЕНИЕ
Наличие кислорода в окружающей среде, помимо общеизвестной положительной роли, несет и ряд деструктивных функций. Использование кислорода в процессах дыхания необходимо для существования аэробов. Однако из-за высокой окислительной способности кислорода на клеточном уровне активируется цепь реакций свободнорадикального окисления, сопровождающих процессы кислородного метаболизма [2, 10, 13]. Основным продуктом этих реакций являются активные формы кислорода (АФК) [3, 15, 17], на борьбу с которыми направлена деятельность антиоксидантной системы (АОС) организма [1, 4, 8, 28]. Образование АФК может носить как эндогенный (внутриклеточный), так и экзогенный (внеклеточный) характер. Чувствительность организмов к действию той или иной группы АФК может существенно отличаться [18, 22, 23]. Особенно это актуально для гидробионтов, поскольку вероятность образования, а также длительность существования экзогенных АФК, во многом связаны с температурными и гидрохимическими характеристиками среды [9, 12, 16, 21].
Предположено, что у видов, обитающих в различных условиях, могут наблюдаться и различия в механизмах активации защиты от АФК экзогенного происхождения. С целью проверки данного предположения был проведен ряд исследований на видах, относящихся
Михаил Александрович Тимофеев, научный сотрудник.
к одной таксономической группе, однако отличающихся по своим адаптивным способностям. В качестве исследуемой группы были выбраны пресноводные амфиподы (Amphi-poda, Crustacea).
Ранее нами были опубликованы материалы изучения механизмов активизации АОС при оксидативном стрессе, выполненные на представителях палеарктической фауны амфипод Gammarus lacustris Sars и G. tigrinus [26]. Целью данной работы являлось проведение аналогичного исследования на представителе эндемичной фауны амфипод из оз. Байкал.
ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использовали байкальский эндемичный вид Eulimnogammarus verrucosus (Gerstf.). Вид широко распространен по всему Байкалу и встречается повсеместно (под камнями) начиная с глубины в несколько сантиметров, вплоть до глубин в 10-15 м. Обладает высокой чувствительностью к изменениям температуры среды. В проведенных исследованиях гибель 50% и 100% особей данного вида при 25°С наблюдалась через 1,8 и 9 часов соответственно [26]. Термо-преферендум данного вида установлен в температурной зоне 5-6°С; минимальный порог переносимого содержания кислорода, полученный экспериментальным путем, 1 (±0,2) мгО2 • л-1 [6, 26].
Рачков отлавливали на урезе воды в районе пос. Большие Коты (Южный Байкал). Перед экспериментами амфипод выдерживали 2-3 дня в аэрируемых аквариумах с бай-
кальской водой при температуре 6°-8°С. раторного гуминсодержащего препарата Окислительное воздействие индуцировали «Schwarzer See» (IGB, Germany), любезно экспонированием амфипод в растворах лабо- предоставленного
а к л е б
л а т а к
1:
2 ч 6 ч 24 ч 3 сут 6 сут
□ 30 мг/л
□ 60 мг/л
0.5 ч
Рис. 1. Активность пероксидазы у E. verrucosus, экспонированного в растворе гуминсодержащего препарата разных концентраций
а к л е б
л а т а к
тВг
*
130 мг/л □ 60 мг/л
-i-
гЬ
I.
6 ч 24 ч 3 сут 6 сут
0.5 ч
2 ч
Рис. 2. Активность каталазы у E. verrucosus, экспонированного в растворе гуминсодер-жащего препарата разных концентраций
а к л е б
а л а т к
гй ft ¡4- fr 3=t= н- h
L
2 ч 6 ч 24 ч
□ 30 мг/л
□ 60 мг/л
0 5 ч
Рис. 3. Активность глутатион S-трансферазы у E. verrucosus, экспонированного в растворе
гуминсодержащего препарата разных концентраций
проф. C.E.W. Steinberg (IGB). Известно, что препараты гуминовых веществ в растворах являются продуцентами широкого спектра активных форм кислорода [9, 19, 20, 24].
Была проведена серия экспериментов, в которых рачков экспонировали в растворах препарата с концентрациями 30 и 60 мг/л, приготовленных на байкальской воде. Длительность экспозиции составляла от 30 минут
Известия Самарского научного центра Российской академии наук. 2009. Т. 11, № 1
до 6 сут. Для всех экспериментов отбирали здоровых и активных рачков.
Для исследования были выбраны следующие ферменты: пероксидаза, каталаза и глу-татион^-трансфераза. Приготовление образцов для измерения активности ферментов проводили согласно методике [27]. Замороженных рачков гомогенизировали при 4°С с добавлением натрий-фосфатного буфера 0,1 М рН 6,5 и центрифугировали. В отобранном супернатанте определяли активность ферментов с использованием спектрофотометра UVIKON XS. Активность выражали в нкат/мг белка (катал - единица активности фермента, необходимая для преобразования 1 моля субстрата за 1 сек). Активность перок-сидазы измеряли в соответствии с методикой [11], используя в качестве субстрата гваякол при длине волны 436 нм, рН 5; активность каталазы - по методике [7] c добавлением гидроперекиси при длине волны 240 нм, рН 7; активность глутатион^-трансферазы - в соответствии с методикой [14], используя в качестве субстрата 1-хлор-2,4-динитробензол при длине волны 340 нм, рН 6,5. Содержание белка в пробе определяли по методу Бредфорда при длине волны 595 нм. Все полученные данные обработаны статистически с использованием пакета программ «Statistica 5.0».
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
На рис. 1 показаны материалы измерения уровней активности пероксидазы у E. verru-cosus, экспонированных в растворах гумин-содержащего препарата с концентрациями 30 и 60 мг/л. Из полученных данных видно, что экспозиция амфипод ведет к снижению показателей активности фермента. В растворах с меньшей концентрацией препарата наблюдается достоверное снижение активности пероксидазы начиная с 2 часов экспозиции. В растворах с большей концентрацией ингиби-рование пероксидазы отмечено уже к 30 мин. экспозиции, при этом показатель активности снижен в 3 раза относительно контроля. Затем к периоду 24-часовой экспозиции уровень активности фермента в растворах обеих концентраций незначительно повышается, приближаясь к контрольному. Далее активность пероксидазы вновь снижается и держится на пониженном уровне вплоть до окончания эксперимента.
На рис. 2 представлены материалы измерения активности каталазы у рачков, экспо-
нированных в растворах гуминсодержащего препарата с концентрациями 30 и 60 мг/л. Как видно из представленных диаграмм, показатели активности каталазы в ходе экспозиции в основном остаются близкими к контрольному уровню. В экспериментах с растворами большей концентрации отмечали повышение уровня активности каталазы при 2-часовом периоде экспонирования.
На рис. 3 показаны материалы измерения активности глутатион^-трансферазы у E. verrucosus. Из представленных данных видно, что в растворах с меньшей концентрацией отмечали неравномерную активность фермента в ходе всего эксперимента. Однако изменений активности статистически достоверных от контрольного уровня, не отмечено.
Таким образом, как показали проведенные эксперименты, экспозиция E. verrucosus в растворах гуминсодержащего препарата «Schwarzer See» приводит к достоверным изменениям в показателях активности анти-оксидантных ферментов каталазы и перокси-дазы, тогда как активность глутатион-S-трансферазы остается стабильной. Картина изменения характеристик активности основных антиоксидантных ферментов у байкальского E. verrucosus показывает обратную картину, чем у палеарктических видов С. ishnus, G. tigrinus и G. lacustris. Так, в условиях ранее проведенных аналогичных экспериментов у палеарктических видов отмечали многократный всплеск активности перок-сидазы [26]. При этом наблюдали повышение активности глутатион^-трансферазы и снижение активности каталазы. У байкальского вида происходит ингибирование пероксида-зы, активность каталазы повышается, а глу-татион^-трансферазы остается стабильной. По-видимому, следует говорить о том, что у изученных эндемичных байкальских амфипод наблюдается механизм активации антиокси-дантной системы, отличный от такового у палеарктических видов.
Исследование проведено при поддержке грантов РФФИ ( 05-04-97239 Байкал и 06-04-48099-а).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Андреева В.А. Фермент пероксидаза (участие в защитном механизме растений). М., 1988.
2. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы в биологических системах // Сорос. образоват. журн. 2000. 6(12).
3. Кулинский В.И. Активные формы кислорода и оксида-тивная модификация макромолекул: польза, вред и защита // Сорос. образоват. журн. 1999. № 1.
4. Рогожин В.В. Пероксидаза как компонент антиокси-дантной системы живых организмов. СПб., 2004.
5. Тимофеев М., Шатилина Ж., Колесниченко А., Побе-жимова Т., Грабельных О. Оксидативное влияние растворов гуминовых веществ на европейских и байкальских амфипод; эволюционный взгляд на причины резистентных различий // Сиб. экол. журн. 2003. №5.
6. Тимофеев М.А., Кириченко К.А. Экспериментальная оценка роли абиотических факторов в ограничении распространения эндемиков за пределы оз. Байкал, на примере амфипод // Сибирский экологический журнал. 2004. №1.
7. Aebi H. Catalase in vitro // Methods Enzymol. 1984. V. 105.
8. Blokhina O., Virolainen E., Fagerstedt K. Antioxidants oxidative damage and oxygen deprivation stress: a review // Antioxidants. Ann. Bot. 2003. V. 91, 2.
9. Cooper J. Aquatic humic substances: Influence on fate and treatment of pollutants / / Adv. Chem. Series. 1989. 219.
10. Davies K.J. Oxidative stress: the paradox of aerobic life / / Biochem Soc. Symp. 1995. 61.
11. Drotar A., Phelps P. Evidence for glutathione peroxidase activities in cultured plant cells / / Plant Sci. 1985. V. 42.
12. Finkel T., Holbrook N. Oxidants, oxidative stress and the biology of ageing // Nature. 2000. 408.
13. Fridovich I. Oxygen toxicity: a radical explanation // J. Exp. Biol. 1998. V. 201, 8.
14. Habig W., Pabst M., Jakoby W. Glutathione S-Transferases. The first enzymatic step in mercapturic acid formation // J. Biol. Chem. 1974. V. 249.
15. Hensley R., Floyd R., Reactive oxygen species and protein oxidation in aging: A look back, a look ahead / / Arch. Biochem. Bioph. 2002. V. 397.
16. Livingstone D.R. Oxidative stress in aquatic organisms in relation to pollution and aquaculture / / Rev. de Medecine Veterinaire. 2003. V. 154, 6.
17. Mensack S., Murtaugh R. Oxygen toxicity // Comp. Cont. Educat. Pract. Vet. 1999. V. 21, 4.
18. Missirlis F., Phillips J., Jackie H. Cooperative action of antioxidant defense systems in Drosophila // Current Biology. 2001. V. 11.
19. Pflugmacher S., Spangenberg M., Steinberg C. Dissolved organic matter (DOM) and effects on the aquatic macro-phyte Ceratophyllum demersum in relation to photosynthesis, pigmentpattern and activity of detoxication enzymes // J. Appl. Botany. 1999. V. 73.
20. Pflugmacher S., Tidwell F., Steinberg C. Dissolved humic substances can directly affect freshwater organisms // Acta Hydrochim. Hydrobiol. 2001. V. 29.
21. Pinto E., Sigaud-Kutner T., Leitao M. et al. Heavy metal-induced oxidative stress in algae // J. Phycol.
2003. V. 39, 6.
22. Riley R. Free-Radicals in Biology - Oxidative Stress and the Effects of Ionizing-Radiation // Intern. J. of Radiation Biol. 1994. V. 65.
23. Siraki G., Pourahmad J., Chan T., Khan S., O'Brien P. Endogenous and endobiotic induced reactive oxygen species formation by isolated hepatocytes // Free Radical Biology and Medicine. 2002. V. 32.
24. Steinberg C. Ecology of humic substances in freshwaters. Springer, 2003.
25. Timofeyev M.A. On the role of adaptive abilities in distribution of endemic amphipods from Lake Baikal // Verhandlungen Intern. Vereinigung Limnol. 2002. V. 28.
26. Timofeyev M., Shatilina Z., Kolesnichenko A. et al. Natural organic matter (NOM) promotes oxidative stress in freshwater amphipods Gammarus lacustris Sars and G. tigrinus (Sexton) // Sc. of The Total Environment. 2006. , 2.
27. Wiegand C., Pflugmacher S., Oberemm A. et al. Uptake and effects of microcystin-LR on detoxication enzymes of early life stages of the zebra fish (Danio rerio) / / Environ. Toxicol. 1999. V. 14.
28. Winston G. Oxidants and antioxidants in aquatic animals // Comp. Biochem. Physiol. 1991. V. 100.
ANTIOXIDANT SYSTEM ACTIVATION IN LITTORAL BAIKALIAN AMPHIPOD EULIMNOGAMMARUS VERRUCOSUS
© 2009 M.A. Timofeyev
Irkutsk State University, Irkutsk
Mechanisms of antioxidant system activation in Baikalian endemic Eulimnogammarus verrucosus (Gerstf.) under oxidative stress was evaluated. For this study key antioxidant enzymes were used: peroxidase, catalase and glutathione S-transferase. Oxidative stress was induced by amphipods exposition in pro-oxidant humic substances solutions. It was showed that exposition of E. verrucosus in pro-oxidant humic substances solutions lead to significant changes in activities of peroxidase and catalase, however glutathione S-transferase was not changed.
Key words: activation of antioxidants ferments, endemic, Eulimnogammarus verrucosus, Baikal.
