CC BY
45
Journal of Stress Physiology & Biochemistry, Vol. 8 No. 4 2012, pp. 322-329 ISSN 1997-0838 Original Text Copyright © 2012 by Axenov-Gribanov, Lubyaga
ORIGINAL ARTICLE
The evaluation of the antioxidant enzyme's activity and activity of anaerobic glycolysis' enzymes under gradual temperature increase in Baikal amphipod species Eulimnogammarus marituji, E. maackii
and Gmelinoides fasciatus
Axenov - Gribanov D. V.1,2, Lubyaga J. A. 1
1 Irkutsk State University. 664003 Irkutsk, K. Marx str., 1, Russia
2 Baikal research centre*. 664003 Irkutsk, Lenin str., 3-120 Russia
*Tel.: +7 (3952) 600 893 *E-Mail: brc.contact@gmail.com
Received September 26, 2012
The aim of present study was the evaluation of the antioxidant enzyme's activity and activity of anaerobic glycolysis enzymes under gradual temperature increase in Baikal amphipods species Eulimnogammarus marituji (Baz., 1945), E. maackii (Gerstf, 1858) and Gmelinoides fasciatus (Stebb., 1899). In all species under gradual temperature increase exposition elevation of peroxidase' activity was observed. Activities of catalase', glutathione S - transferase' and lactate dehydrogenase' activity in E. marituji and E. maacki were differed from G. fasciatus. It was proposed that changes in the antioxidant enzyme's activity and activity of anaerobic glycolysis enzymes in Baikal amphipods may contribute to increasing of glycolytic processes functional efficiency and keeping of energetic homeostasis in endemic organisms.
Key words: Amphipods / catalase / glutathione S - transferase /lactate dehydrogenase /peroxidase
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 8 No. 4 2012
323
The evaluation of the antioxidant enzyme’s activity...
ORIGINAL ARTICLE
Влияние повышенной температуры окружающей среды на активность ферментов антиоксидантной системы и анаэробного гликолиза у эндемичных байкальских видов амфипод Eulimnogammarus marituji, E. maackii и Gmelinoides fasciatus
Аксенов - Грибанов Д. В.1,2, Лубяга Ю. А.1
1 ФГБОУ ВПО «Иркутский государственный университет». 664003 г. Иркутск, ул. К. Маркса, 1, Россия
2 АНО «Байкальский исследовательский центр»*. 664003 г. Иркутск, ул. Ленина, 3-120, Россия
Тел.: +7 (3952) 600 893 *E-Mail: brc.contact@gmail.com
Поступила в редакцию 26 сентября 2012 г.
Целью настоящей работы являлась оценка влияния повышенной температуры окружающей среды на активность ферментов антиоксидантной системы и анаэробного гликолиза у эндемичных байкальских видов амфипод Eulimnogammаrus marituji (Baz., 1945), E. maackii (Gerstf., 1858) и Gmelinoides fasciatus (Stebb., 1899). При экспозиции в условиях повышения температуры, у всех видов амфипод отмечали рост активности пероксидазы. Характер изменений активности каталазы, глутатион S-трансферазы и лактатдегидрогеназы у представителей E. marituji и E. maackii отличались от таковых у G. fasciatus, что свидетельствует о различиях в механизмах стресс-адаптации у этих видов. На основании полученных материалов предположено, что изменения активности антиоксидантных ферментов и ферментов анаэробного гликолиза могут способствовать повышению эффективности функционирования гликолитических процессов и поддержанию энергетического гомеостаза у эндемичных байкальских амфипод.
Ключевые слова: Амфиподы / глутатион S-трансфераза / каталаза /
лактатдегидрогеназа/ пероксидаза
Среди защитных систем гидробионтов к повышенным температурам среды важную роль играют неспецифические механизмы стресс -адаптации, включающие в себя различные компоненты антиоксидантной системы и энергетического метаболизма.
Для исследования особенностей механизмов стресс - адаптации наиболее подходящими являются организмы, которые длительное время эволюционировали в стабильных условиях. Одним из природных очагов видообразования является древнейшее (более 25 млн. лет)
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 8 No. 4 2012
Axenov-Gribanov, Lubyaga
324
пресноводное озеро Байкал. Фауна Байкала насчитывает 2600 видов, 80% из которых являются эндемиками (Тимошкин и др., 2009).
Целью настоящей работы являлась оценка влияния повышенной температуры окружающей среды на активность ферментов антиоксидантной системы и анаэробного гликолиза у эндемичных байкальских видов амфипод.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектами настоящего исследования были выбраны представители 3х эндемичных видов амфипод оз. Байкал: Eulimnogammarus maackii (Gerstf., 1858^, E. marituji (Baz., 1945), Gmelinoides fasciatus (Stebb., 1899). Представленные виды амфипод отличаются по терморезистентным способностям (Тимофеев и др., 2006; Тимофеев, 2010). Организмы были собраны в литоральной зоне озера (0 - 2 м), в районе пос. Большие Коты (Южный Байкал). Амфипод содержали раздельно по видам в аэрируемых термостатах при температуре 6-7°С в течение 3 - 4 суток до проведения экспериментов. До эксперимента животных кормили коммерческим кормом Tetramin (Германия). Высокая двигательная активность, питание и отсутствие гибели организмов в акклимационный период позволяют заключить, что содержание в лабораторных условиях не являлось для них стрессовым. Во всех экспериментах использовали здоровых и активных особей.
В исследовании проводили экспозицию амфипод в условиях постепенного повышения температуры с 7°С (средняя температура среды обитания, температура акклимации) до температуры, при которой отмечали гибель 100% особей (30°С). Изменение температуры
проводили в цифровом крио термостате WiseCircu Wcr6 (Германия) со скоростью 1°С^ч-1. Фиксацию материала в жидком азоте проводили каждые 5°С (5 часов). Контрольные образцы фиксировали при температуре акклимации (7°С) в начале и в конце эксперимента.
Оценку активности ферментов АОС (пероксидазы, каталазы и глутатион S-трансферазы) проводили, согласно
модифицированным спектрофотометрическим методикам Drotar (1985), Aebi (1984) и Habig (1974) соответственно (Тимофеев, 2010). Определение активности лактатдегидрогеназы проводили энзиматическим
спектрофотометрическим методом с применением стандарт-набора «ЛДГ-витал» (Vital-Diagnostics Spb), согласно рекомендациям производителя.
Измерения проводили на спектрофотометре Cary 50 (Varian, США) при Л=340 нм для пероксидазы и лактатдегидрогеназы, при Л=240 нм для каталазы и при Л=436 нм для глутатион S -трансферазы.
Все эксперименты проведены в 9 биологических параллелях. Биохимический анализ каждой пробы проведен в 3-х
аналитических измерениях. Оценку
достоверности проводили, используя двувыборочный u-критерий Манна-Уитни.
Статистический анализ проводили с
использованием программы Statistica 8.0. На диаграммах указаны доверительные интервалы. * - обозначены случаи достоверного отличия значений от контрольного при доверительной вероятности - 0,95.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Материалы по оценке изменения активности
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 8 No. 4 2012
325
The evaluation of the antioxidant enzyme’s activity...
ферментов АОС у амфипод, экспонированных в снижению активности каталазы на 15-31 %.
условиях повышения температуры среды, Экспозиция амфипод вида E. maackii в условиях
представлены на рис. 1-3. На рис.1. повышения температуры среды с 15°С до 25°С
представлены результаты оценки изменения приводила к постепенному увеличению
активности пероксидазы. Как следует из активности каталазы на 52 % относительно
представленных материалов, экспозиция всех контрольных значений. Повышение
видов амфипод в условиях повышения температуры до 30°С вызывало снижение
температуры среды приводила в увеличению активности каталазы до контрольных значений.
активности фермента. У амфипод E. maackii Экспозиция байкальских амфипод E. marituji в
отмечали троекратное увеличение активности условиях повышения температуры среды
пероксидазы при повышении температуры приводила как к незначительному, но
среды до 30°С. Повышение температуры статистически значимому увеличению
экспозиции до 25°С приводило к росту активности каталазы при 15°С, так и к снижению
активности пероксидазы на 56-73 % у вида E. активности при температуре экспозиции 30°С.
marituji и на 41-62 % у вида G. fasciatus. При этом, изменения активности каталазы у E.
Результаты оценки изменений активности marituji не превышали 15 % относительно
глутатион S-трансферазы даны на рис. 2. Как контрольных значений.
следует из представленных материалов, Материалы оценки изменений активности
экспозиция G. fasciatus в условиях повышения фермента анаэробного гликолиза -
температуры среды приводила к лактатдегидрогеназы - у амфипод,
кратковременному статистически значимому экспонированных в условиях повышения
увеличению активности глутатион S-трансферазы температуры среды, даны на рис. 4. Как следует
на 20 % при температуре экспозиции 15°С. из представленных материалов, экспозиция
Последующее повышение температуры среды амфипод видов E. maackii и Е. marituji в условиях
не вызывало статистически значимых изменений повышения температуры среды приводила к
в активности фермента у G. fasciatus. В отличие повышению активности лактатдегидрогеназы.
от G. fasciatus, у амфипод E. maackii и E. marituji, Увеличение активности фермента у Е. marituji
отмечали постепенное снижение активности отмечали на 75 - 145% в ходе всего
глутатион S-трансферазы на 13-25% и на 12-45% эксперимента, тогда как у Е. maackii увеличение
соответственно при температурах экспозиции активности лактатдегидрогеназы отмечали на 60
выше 20°С. % при повышении температуры экспозиции до
На рис. 3. представлены результаты по 30°С. У G. fasciatus, в отличие от других
оценке изменения активности каталазы. Как исследуемых видов, отмечали снижение
следует из представленных материалов, активности лактатдегидрогеназы на 15 - 42 %
экспозиция G. fasciatus в условиях повышения при повышении температуры среды с 15°С до
температуры среды с 15°С до 30°С приводила к 30°С.
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 8 No. 4 2012
Axenov-Gribanov, Lubyaga
326
Рисунок 1 Изменение активности пероксидазы у байкальских эндемичных амфипод, экспонированных в условиях повышения температуры среды (в процентах)
QE. таасШ □£. тапщi UG.fasciatus *
7°С 15°С 20°С 25 °С 30°С
Рисунок 2. Изменение активности глутатион S-трансферазы у байкальских эндемичных амфипод, экспонированных в условиях повышения температуры среды (в процентах)
Рисунок 3. Изменение активности каталазы у байкальских эндемичных амфипод, экспонированных в условиях повышения температуры среды (в процентах)
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 8 No. 4 2012
327
The evaluation of the antioxidant enzyme’s activity...
Рисунок 4. Изменение активности лактатдегидрогеназы у байкальских эндемичных амфипод, экспонированных в условиях повышения температуры среды (в процентах)
ОБСУЖДЕНИЕ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, в ходе проведенного исследования с представителями эндемичной байкальской фауны, выявлены как сходства, так и различия в направленности изменений активности ферментов АОС и анаэробного гликолиза при увеличении температуры среды. При экспозиции в условиях повышенных температур у всех видов амфипод отмечали рост активности пероксидазы. У видов E. maacki и E. marituji было отмечено снижение активности глутатион S-трансферазы, напротив, у G. fasciatus наблюдали кратковременное повышение активности фермента. При оценке активности каталазы было установлено, что у G. fasciatus отмечается снижение активности фермента в ходе всей экспозиции, тогда как у других видов амфипод отмечали повышение активности. Установлено, что активность
лактатдегидрогеназы у экспонированных E. maacki и E.marituji повышается, а у G. fasciatus -снижается.
Изменения активности ферментов АОС указывают на нарушение системы контроля за эндогенно образованными активными формами
кислорода (АФК). Так, повышение активности пероксидазы и каталазы у всех исследуемых видов в условиях повышения температуры среды указывает на активацию антиоксидантной системы (АОС) и элиминацию активных форм кислорода (АФК) и свободно-радикального окисления (Хочачка, Сомеро, 1977, 1988). Важно отметить, что увеличение активности каталазы происходит раньше и при меньших
температурах экспозиции, чем увеличение активности пероксидазы. Это вероятно
указывает на то, что в механизмах
антиоксидантной защиты байкальских
организмов каталаза играет большую роль, чем пероксидаза. Для восполнения энергетических потребностей в условиях образующегося энергодефицита, амфиподы, по-видимому, переключают энергетический метаболизм с аэробного на анаэробный. Наблюдаемое снижение активности каталазы у G. fasciatus может осуществляться с целью сохранения энергетического гомеостаза. В пользу этого также свидетельствует и снижение активности лактатдегидрогеназы.
Глутатион S-трансфераза играет важную роль
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 8 No. 4 2012
Axenov-Gribanov, Lubyaga
328
в механизмах выведения токсичных диапазоном термотолерантности, чем другие
метаболитов из организма и элиминации исследованные байкальские виды амфипод, в
вторичных продуктов перекисного окисления том числе, вероятно, за счет активации
липидов (триеновые основания, альдегиды, механизмов выведения токсичных метаболитов,
кетоны) (Хочачка, Сомеро, 1977). У амфипод поддержания энергетического гомеостаза и
видов E. maackii и E.marituji было отмечено увеличения доли анаэробного гликолиза. Другие
снижение активности глутатион S-трансферазы, исследованные виды E. maackii и E. marituji,
что может быть связано с инактивацией обладают узким диапазоном
фермента вследствие высокой физиологической термотолерантности, вследствие чего активация
температуры и замедлением метаболизма. У G. неспецифических механизмов стресс-адаптации
fasciatus - кратковременное повышение происходит раньше и имеет иную
активности глутатион S-трансферазы с направленность, чем у G. fasciatus. Изменения
последующей флуктуацией около контрольных активности антиоксидантных ферментов и
значений, возможно, указывает как на ферментов анаэробного гликолиза в условиях
накопление вторичных продуктов ПОЛ, так и на роста температуры среды могут способствовать
усиление их выведения, что обеспечивает повышению эффективности функционирования
внутриклеточную защиту от эндогенного гликолитических процессов и поддержанию
повреждения мембран (Тимофеев, 2010; энергетического гомеостаза у байкальских
Хочачка, 1988). видов.
Представленные межвидовые различия БЛАГОДАРНОСТИ
активности ферментов АОС и анаэробного Работа выполнена при частичной финансовой
гликолиза тесно связаны с экологическими поддержке грантов РФФИ (12-04-31767 мол_а,
характеристиками исследованных видов, и, в 12-04-90039 Бел_а, 12-04-98062-р_сибирь_а, 11-
частности, с их различными 04-00174-а, 11-04-91321-СИГ_а, гранта ИГУ для
терморезистентными характеристиками. поддержки аспирантов и молодых ученых,
Известно, что G. fasciatus характеризуется более грантов Президента РФ МК-5466.2012.4, МД-
высокими показателями терморезистентности, 2063.2012.4, МК-4772.2011.4, ФЦП «Научные и
чем другие исследованные байкальские виды научно-педагогические кадры инновационной
(Березина, Петрящев, 2012; Тимофеев, 2010). России», и DAAD-М. Ломоносов 2012-2013
Таким образом, разнонаправленные (10.51.2011).
изменения активности ферментов АОС и Авторы выражают глубокую признательность
анаэробного гликолиза у исследованных видов своему научному руководителю д.б.н М.А.
амфипод, различающихся по своим Тимофееву за общее руководство, а также
терморезистентным способностям, коллегам к.б.н. Ж.М. Шатилиной, к.б.н. Д.С.
свидетельствуют о различиях в механизмах Бедулиной, к.б.н. В.В. Павличенко и к.б.н.
стресс-адаптации у организмов в условиях Протопоповой М. В. за помощь в проведении
изменяющейся температуры среды обитания. G. данного исследования.
fasciatus характеризуется более широким
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 8 No. 4 2012
329
The evaluation of the antioxidant enzyme’s activity...
ЛИТЕРАТУРА
Aebi, H. (1984) Catalase in vitro. Methods Enzymol. 105, 121-126.
Drotar, A., Phelps, P., and Fall, R. (1985) Evidence for glutathione peroxidase activities in cultured plant cells. Plant Sci. 42, 35-40.
Gerstfeldt G. (1858) Uber einige zum Theil neuen Arten von Platoden, Anneliden, Myriapoden und Crustaceen Sibiriens. Mem. des Savants etrangers de I'Academi St. Peterbourg, 8, 261 -296.
Habig, W.H., Pabst, M.J., and Jakoby, W.B. (1974) Glutathione S-transferases. The first e nzymatic step in mercapturic acid formation. J. Biol. Chem. 249, 7130-7139.
Stebbing T. R. R. (1899) Amphipoda from the Copenhagen Museum and other sources. Part. 2. Transaction of the Linnean society of London. 7(8), 395-432.
Базикалова А. Я. (1945) Амфиподы оз. Байкал. Труды Байкальской Лимнологической станции АН СССР, 11, 440 с.
Березина Н. А., Петряшев В. В. (2012) Инвазии высших ракообразных (Crustacea:
Malocostraca) в водах Финского залива (Балтийское море). Российский Журнал Биологических Инвазий, 1, 2-18.
Тимофеев М. А. (2010) Экологические и физиологические аспекты адаптации к абиотическим факторам среды эндемичных байкальских и палеарктических амфипод: Дис. ... Д-р. биол. Наук. ТГУ, Томск, 384с.
Тимофеев М. А., Кириченко К. А., Бедулина Д. С. (2006) Сравнительная оценка особенностей анаэробного метаболизма у байкальских амфипод Eulimnogammarus verrucosus (Gerstf.), E. cyaneus (Dyb.) и палеарктического Gammarus lacustris Sars, Сибирский экологический журнал, 6, 733739.
Тимошкин О. А., Провиз В. И., Ситникова Т. Я. (2009) Аннотированный список фауны озера Байкал и его водосборного бассейна. В 2 т. Новосибирск: Наука, 1083 с.
Хочачка П. Сомеро Дж. (1977) Стратегия биохимической адаптации. М.: Мир, 398с.
Хочачка П. Сомеро Дж. (1988) Биохимическая адаптация. М.: Мир, 568с.
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 8 No. 4 2012
