CC BY
58
ПЕРЕДОВАЯ СТАТЬЯ
УДК: 577.1:577.7; 612.67; 612.825
АКАДЕМИК Н.М. ЭМАНУЭЛЬ О ПРИРОДЕ СТАРЕНИЯ И ВОЗМОЖНОСТИ ПРОДЛЕНИЯ ЖИЗНИ
К 90-летию со дня рождения (1.10.1915—8.12.1984)
Л.К. Обухова, Д.М. Измайлов, A.C. Соловьева
«Даже если путь, ведущий нас к этому, окажется трудным, его все же можно отыскать. А он и должен быть трудным, поскольку его находят немногие. »
Б. Спиноза
Выдающийся ученый и организатор исследований в области химической физики, один из создателей и признанный лидер физико-химической биологии, основатель отдела кинетики химических и биологических процессов Института химической физики им. H.H. Семенова (1965 г.), на базе которого в 1995 г. был организован Институт биохимической физики РАН им Н.М. Эмануэля, Герой социалистического труда, лауреат Ленинской и Государственной премий, премии им. А.Н. Баха, автор многих открытий и фундаментальных монографий и
более 300 научных статей, академик Николай Маркович Эмануэль был одним из первых, кто сначала предположил, а затем экспериментальными работами доказал, что многие биохимические процессы идут при участии свободных радикалов, и исследовал их роль в развитии патологических состояний и процесса естественного старения. Н.М. Эмануэль снискал международное признание как пионер приложения принципов химической кинетики к описанию биологических процессов и изучению медицинских проблем.
Научное творчество Н.М. Эмануэля развивалось в тот период, когда усиливались тенденции к объединению химии с физикой и математикой, а затем с биологией и медициной. Работая в пограничных научных областях, он задолго до официального рождения системного подхода разрабатывал свою собственную систему, ориентированную на понимание целостности объекта. Системность доминировала в его методологии и стиле мышления; он был одним из первых, кто оригинально, систематически и содержательно разрабатывал способы управления скоростью свободнорадикальных реакций посредством воздействия на ранних стадиях [26]. Научный потенциал работ того периода оказался далеко не исчерпанным проблемами химической кинетики. Плодотворные идеи этого направления стали теоретическим фундаментом значительного цикла биологических работ в 60—80-е годы. Николай Маркович неоднократно подчеркивал, что «кинетика как наука о законах и механизмах развития различных процессов в природе находит в области биологии почти неограниченные перспективы для теоретических исследований и практического приложения. Всякий патологический процесс в живом организме закономерно развивается во времени; столь же закономерным является и обратное развитие, и торможение патологических состояний под влиянием тех или иных эффективных воздействий».
Последовательно просматривая основные научные труды Николая Марковича, приходишь к заключению, что, несмотря на большое разнообразие объектов и методов исследования, он всегда отдавал предпочтение поиску путей управления процессом, будь то химическая реакция или метаболическое превращение. В работе 1982 г. «Антиоксиданты в пролонгировании жизни» Н.М. Эмануэль в следующих положениях обосновал свою точку зрения [27].
«Старение живых организмов представляет собой комплексный, многофакторный биологический процесс. Биохимические и биофизические процессы, происходящие в живом организме в норме и патологии, осуществляются в весьма сложных, открытых, гетерофазных химических системах при воздействии многочисленных химических и физических факторов. С физико-химической точки зрения решение проблемы продления жизни должно сводиться к более полному предотвращению и к эффективному торможению разнообразных нежелатель-
ных сдвигов, которые возникают в живом организме, а также к профилактике и ликвидации патологических состояний. Весь опыт, приобретенный химической кинетикой по управлению химическими реакциями, следует разумно использовать для целей торможения и подавления процессов старения живых организмов... Имеется огромное число аналогичных по своим механизмам элементарных процессов — молекулярных, ионных, свободнорадикальных, которые осуществляются при старении живых организмов. В принципе есть столь же большие основания для оптимизма в решении проблемы увеличения продолжительности жизни, какие мы имеем в области химии, когда речь идет об изыскании эффективных путей торможения, а зачастую практически полного подавления нежелательных химических превращений».
Под руководством Н.М. Эмануэля были получены экспериментальные данные об участии свободных радикалов в процессе старения. Это позволило предположить, что вещества, препятствующие протеканию реакций по свободнора-дикальному механизму, т.е. различные ингибиторы и антиоксиданты, будут оказывать профилактическое или терапевтическое действие и увеличивать время жизни организма.
Процесс старения приводит к накоплению структурных и функциональных нарушений на всех уровнях организации живого. Можно указать, по крайней мере, на два принципиально разных источника «повреждений и ошибок» в клетке. Частота ошибок, например, при копировании матрицы ДНК или при синтезе белка определяется несовершенством способа передачи информации от одной молекулы к другой и связана, в основном, с особенностями молекулярной организации. Другим источником «случайных» ошибок являются реакции свободнора-дикального окисления макромолекул. Свободные радикалы, содержащие кислород, О2 , 'ОН, КО2, чрезвычайно реакционноспособны, они постоянно генерируются в клетке, и если бы не существовало механизмов инактивации, то они могли бы вызвать быстрое разрушение биологических структур.
При старении снижается эффективность защитных систем организма, контролирующих скорость перекисного окисления липидов и белков: уменьшается содержание природных анти-оксидантов, увеличивается количество «неактивных» молекул ферментов, разрушающих пе-
рекиси, накапливаются высокомолекулярные «шлаки» продуктов окисления и т. д. Однако убыль природных антиоксидантов может быть восполнена диетой или применением синтетических веществ, которые в функциональном отношении близки природным.
Первые результаты по продлению жизни животных антиоксидантами не только вызвали большой интерес среди геронтологов, но с ним связывались и определенные надежды на возможность создания средств замедления старения человека. Опыт применения синтетических антиоксидантов показывает, что некоторые возрастные изменения клеток обратимы или, по крайней мере, могут быть замедлены. Природным и синтетическим антиоксидантам присуще большое разнообразие биологических свойств, в настоящее время они широко используются не только с целью теоретического изучения процесса старения, но и непосредственно в медицине.
Антиоксиданты — геропротекторы
Эффективность средств замедления старения, используемых, как правило, в виде пищевых ингредиентов, экспериментально оценивается числом выживших особей в контрольной и подопытной группах животных. Вещества — «геропротекторы» способны увеличивать среднюю продолжительность жизни лабораторных мышей и крыс не более, чем на 30—35% [4,13,14].
Некоторые результаты опытов, выполненных в 70—80-е годы под руководством академика Н.М. Эмануэля в Институте химической физики и его учениками в Институте биохимической физики РАН в период с 1984 по 2003 г., приведены в табл. 1.
Синтетические антиоксиданты оказались эффективными геропротекторами, т.е. веществами, продлевающими жизнь лабораторных животных. Малотоксичный водорастворимый хлоргидрат 2 - этил- 6 - метил - 3 -оксипири дина (структурный аналог витамина B6) использовался в качестве добавки к рациону лабораторных мышей SHK с 2-месячного возраста. Средняя продолжительность жизни животных увеличилась до 17,8 мес по сравнению с 13,7 мес в контроле. В опытах с 8-месячными мышами на протяжении последующих 6 мес жизни выживаемость в подопытных и контрольных группах достоверно не различалась. Начиная с возраста
15 мес, время наступления смерти в подопытных группах животных заметно уведичива-лось, и максимальная продолжительность достигала 28 мес по сравнению с 18 мес в контроле, средняя ее продолжительность увеличивалась на 23%.
Под руководством Н.М. Эмануэля в отделе кинетики химических и биологических процессов Института химической физики АН СССР систематически исследовались в качестве ге-ропротекторов синтетические антиоксиданты разных классов, для этих целей использовались 4 линии лабораторных мышей (SHK, C3HA, AKR, CBA), несколько линий мухи-дрозофилы, были определены оптимальные концентрации геропротекторов. Наиболее эффективным и удобным в эксперименте оказался препарат из класса 3-оксипиридинов — эмоксипин, он послужил основным инструментом в работе по выяснению феноменологии торможения процессов естественного старения и его свободнорадикаль-ных механизмов.
Результат воздействия на процесс старения зависит от многих факторов: дозы препарата, линии и пола животных, а также от возраста животного. С целью классификации различных воздействий, которые приводят к изменению продолжительности жизни, были систематизированы результаты опытов на основе изменения вида кривых выживания [31].
Группу животных одного вида можно условно представить состоящей из двух субпопуляций: коротко- и долгоживущих. Особи, принадлежащие к первой субпопуляции, вымирают до достижения возраста, характеризующего медиану распределения. Продолжительность жизни членов второй субпопуляции больше средней в группе в целом. Можно схематично представить различные изменения формы кривой выживания, наблюдаемые в опыте. В первом случае воздействие, вызывающие замедление старения, увеличивает продолжительность жизни всех членов популяции на равную величину, благодаря чему кривая выживания подопытных животных оказывается параллельно смещенной вправо относительно контрольной кривой. При этом увеличиваются значения средней и максимальной продолжительности жизни, скорость приближения смерти не изменяется.
Для другого случая характерно наличие в группе некоторого числа короткоживущих особей, для которых воздействие неэффективно,
тогда начальные участки кривых выживания в контрольной и подопытной группах совпадают. Скорость приближения смерти членов долгожи-вущей субпопуляции, чувствительных к воздействию, уменьшается, и это приводит к возрастанию величин средней и максимальной продолжительности жизни. В том случае, если скорость старения замедляется только в короткоживущей субпопуляции, не происходит увеличения максимальной продолжительности жизни, но удлиняется «плечо» кривой выживания подопытной группы, то есть возраст, при котором отмечается 10% уровень смертности, в опыте превышает соответствующую контрольную величину, но затем подопытная группа вымирает скорее, чем контрольная. Результаты работы с химическими геропротекторами могут служить иллюстрацией всех трех рассмотренных типов замедления старения (см. табл. 1).
В свободнорадикальной гипотезе заключено предположение, что замедление старения анти-оксидантами происходит за счет снижения скорости накопления возрастных повреждений на молекулярном уровне. Подразумевается, что повреждения, индуцированные свободными радикалами, могут возникать практически во всех клеточных структурах. Аргументы в пользу этой точки зрения подробно рассматриваются во многих работах, согласие с эти тезисом требует, казалось бы, признания универсальности действия антиоксидантов, однако такое прямолинейное рассуждение противоречит фактам.
Не все проверенные на опыте антиоксиданты оказались геропротекторами, а последние активны только по отношению к определенным
объектам. Антиоксидант 3-ОП в 1,5—1,8 раза увеличивал среднюю продолжительность жизни мышей БНК и С3НА; мыши БНК принадлежат к неинбредной популяции, для которой характерна высокая заболеваемость спонтанным раком молочной железы. Использование этого же соединения на мышах линии АЕК, поражаемых спонтанным лейкозом, не привело к успеху. У мышей инбредной долгоживущей линии С3НА, начиная с возраста 18 мес, т.е. через 16 мес после начала эксперимента, под влиянием 3-ОП изменяется вид распределения частоты смертей и уменьшается среднее время наступления смерти с 4,7 (контроль) до 3,6% в месяц. Средняя продолжительность жизни этих мышей повышается на 23,3%, максимальное время существования также возрастает и достигает 41,2 мес (см. табл. 1).
Конкретным причинам невоспроизводимости результатов в литературе по геронтологии уделяется мало внимания, констатируется лишь факт наличия или отсутствия активности у данного соединения. Как правило, не приводится и обоснование методов выбора дозы препарата, в лучшем случае предварительно изучаются его токсичные свойства. Что касается выбора дозы синтетических антиоксидантов, то следует учитывать их взаимодействие с природными анти-оксидантами, которое может привести как к торможению процессов свободнорадикального окисления, так и к их активации, и вызвать обеднение тканей естественными антиоксидан-тами [6].
Исследовано влияние пищевых добавок, содержащих (3-каротин и коэнзим Q10, на процес-
Влияние антиоксидантов на продолжительность жизни лабораторных мышей [9,14,21]
Группа, доза препарата Линия животных, возраст в начале опыгта, мес Количество животных Средняя ПЖ, мес (M ± m) Разница относительно контроля Максимальная ПЖ**
Контроль SHK, 2 120 13,0 ± 0,7 25
3-ОП, 150 113 17,3 ± 0,9* +33,0 28
Контроль SHK, 8-8,5 156 15,0 ± 0,6 19
3-ОП, 200 -//- 156 18,8 ± 0,5* +25,3 29
Контроль C3HA, 2 170 21,9 ± 0,8 32
3-ОП, 150 -//- 90 27,0 ± 0,8* +23,3 41
Контроль AKR,2 50 16,2 ± 0,6 23
3-ОП, 150 -//- 50 15,8 ± 1,3 0 24
Контроль СБА, 4 50 26,8 ± 0,6 31
в-Каротин, 0.3 -//- 20 27,9 ± 0,6 +4,0 31
Контроль СБА, 4 50 26,8 ± 0,6 31
Коэнзим Q10, 0,4 -//- 20 24,5 ± 1,0 -9,1 31
Примечание. Дозы препаратов — мг/кг массы тела. *р < 0,01; 3-ОП: 2-этил-6-метил-3-оксипиридинНС1. **Возраст при 90% смертности — максимальная продолжительность жизни (ПЖ).
сы естественного и радиационно-ускоренного (посредством облучения головы дозами 10 и 12 Гр) старения мышей. Применение пищевых добавок приводило в первом случае к недостоверно (p = 0,2) малому увеличению средней продолжительности жизни на 4%, во втором — к ее заметному уменьшению (на 9%, p = 0,02) в интактной группе животных. Применение природных антиоксидантов в опытах с облученными мышами давало благоприятный результат, который был выражен полной компенсацией радиационного сокращения жизни. Не будет преувеличением ожидать положительного влияния этих пищевых добавок на здоровье и продолжительность жизни лиц, относящихся к группам риска.
Начиная с 50-х годов прошлого века и до настоящего времени в литературе широко обсуждается (и уже приобрело черты аксиоматич-ности) предположение о ключевой роли сво-боднорадикальных повреждений в механизмах старения живых организмов. Действительно, многократно установлено, что эффективность защитных систем снижается с возрастом, создавая возможность интенсификации свободнора-дикального повреждения макромолекул. Так, для нескольких линий лабораторных мышей показано монотонное возрастное снижение анти-оксидантной активности липидов, для долгожи-вущих линий оно не превышало 20—25% от исходного уровня, для короткоживущих было более 50% [6,7]. С другой стороны, видовая средняя продолжительность жизни, по данным R. Cutler [30], образует положительную линейную связь с содержанием антиоксидантов в плазме крови. Здесь уместно отметить, что продолжительность жизни коротко- и долгоживу-щих особей одного вида (членов когорты) такой закономерности не подчиняется.
Геропротекторами являются также вещества из других классов биогенных соединений, например, короткие пептиды [4], гормоны [24] и др. Бесспорно, природные антиоксиданты чрезвычайно важны для нормальной жизнедеятельности, но давно и хорошо известно, что их передозировка опасна [5].
Наступившая «эра пищевых добавок» требует большего внимания к практике профилактического применения антиоксидантов. Чтобы приблизиться к корректному объяснению полученных нами результатов укажем на следующие известные факты. Во-первых, индивидуальная
вариабельность содержания витаминов А, Е, С, каротина в плазме крови людей (возможно, и животных) очень велика, вплоть до 6-кратной, возрастные изменения выражены слабо. Не этим ли объясняется отсутствие корреляции между продолжительностью жизни индивидуума и содержанием антиоксидантов в плазме крови? Во-вторых, у старых животных при высоком содержании каротина в крови отмечен его недостаток в органах. В этом отношении показательны результаты Н. Ма881е [35], когда обогащение пищевого рациона мышей каротином достоверно не влияло на продолжительность жизни молодых мышей (+5%) и уменьшало на 12% продолжительность жизни старых животных. При этом содержание р-каротина в крови увеличивалось на 60%, но не изменялось в органах.
Использованные в этих опытах дозы пищевых добавок содержали концентрацию антиок-сидантов в пределах физиологической нормы, их можно определить, как поддерживающие, т. е. дополнительное введение не могло спровоцировать картину окислительного стресса.
Как известно, Р-каротин не синтезируется в организме человека и животных, комплекс ка-ротиноидов, поступающих с пищей, гораздо богаче биологическими свойствами, не связан только с А-витаминной активностью. С этих позиций, пищевые добавки, содержащие комплексы природных антиоксидантов, в которые входит не одно соединение, а несколько аналогов (например, не только а-токоферол, а все 4 природных токоферола в их естественном соотношении), будут способны более тонко регулировать эффективность систем антирадикальной защиты и, возможно, иметь больше оснований именоваться геропротекторами, чем стандартные витаминные препараты. Совокупностью изложенных фактов можно достаточно корректно, на наш взгляд, объяснить отсутствие достоверного влияния р-каротина на продолжительности жизни интактных мышей.
Что касается результатов опытов с коэнзи-мом Q10 (табл. 1), то их можно считать скорее ожидаемыми, чем неожиданными. Сделанное выше замечание о преимуществе природных комплексов справедливы и для этого случая, известно по крайней мере десять аналогов уби-хинонов, различающихся длиной боковой цепи ^ = 0 — 10) и осуществляющих взаимодействие в линейной и циклической форме. В отли-
чие от каротина, коэнзим Q10 является эндогенным антиоксидантом, он образуется в печени у животных и человека.
Возрастное снижение энергообеспечения тканей сопровождается заметным изменением мито-хондриальной ДНК, существует предположение, что это явление только часть универсального, генетически программированного процесса старения. В тканях пожилых людей обнаруживаются лишь следы полномерной мтДНК. Потери мтДНК влекут другие неблагоприятные для клетки события: спад активности цитохром С-оксидазы и других компонентов дыхательной цепи и в итоге снижение биоэнергетики митохондрий. Предотвратить или замедлить программу старения митохондрий в модельных экспериментах добавлением коэнзима Q10 пока не удалось. Как показано в работе Г.П. Жижиной [10], убихинон Q1o по способности ингибиро-вать эндогенное окисление ДНК уступает мела-тонину и р-каротину в 2—4 раза. И хотя доза Q1o не выходила за физиологические границы, но её постоянное употребление, возможно, создавало условия для участия Q1o в неферментативных реакциях с биосубстратами, продукты которых пополняют в организме депо биогенных шлаков и способствуют ускорению старения [8].
Нельзя не упомянуть и о еще одной, крайне интересной гипотезе, отражающей «положительное» участие свободных радикалов кислорода в метаболизме. Она не столь распространена по сравнению с гипотезой о свободнорадикаль-ном повреждении, но уже имеет немалое экспериментальное обоснование и, следовательно, право на жизнь.
Речь идет о том, что «из протекающих в организме химических процессов наиболее подходящими источниками энергии могут быть реакции активных форм кислорода». При рекомбинации двух О2- освобождается 1,0 Эв, при гидролизе АТФ — менее 0,5 Эв, т. е. в организме кроме АТФ имеется альтернативный и более значительный источник энергии, которая, перераспределяясь и накапливаясь в макромолекулах, может выступать в роли инициатора метаболических процессов. Кроме того, выяснилось, что свободные радикалы, содержащие кислород, служат мессенджерами генной активности [38].
Что касается увеличения продолжительности жизни облученных дозой 10 и 12 Гр животных, которые получали с пищей те же самые добавки
антиоксидантов, то этот положительный результат мы целиком относим к их благотворному действию на облученный организм, у которого пострадали естественные тонкие регуляторные механизмы.
Эффективность геропротекторов и жизнеспособность популяций БговорЬПа melanogaster
Этой проблеме был посвящен большой цикл работ, выполненных в период с 1989 по 2004 г. в Институте химической физики и в Институте биохимической физики РАН им. Н.М. Эмануэля. В ряду последовательных поколений дрозофилы динамика основного показателя жизнеспособности, каким является средняя продолжительность жизни популяции (когорты), имеет отчетливо выраженный нерегулярный характер. Иными словами, величина средней продолжительности жизни в популяциях родителей и их близких и далеких потомков не остается постоянной; она может увеличиваться или уменьшаться 2—3-кратно, производя апериодические колебания. Данный вывод основан на наблюдении 128 последовательных поколений дикой линии СаМоп-Б, культивируемой в стандартных условиях, принятых во всех специализированных лабораториях мира. Колебательные изменения жизнеспособности являются высокодостоверными, дано их полное математическое описание и произведен корреляционный анализ взаимосвязи параметров геомагнитного поля земли и продолжительности жизни популяций дрозофилы [11,33,34,35].
С использованием критериев строгой статистики было доказано качественное сходство механизмов старения в ряду близких и отдаленных потомков. Большие различия величин средней продолжительности жизни являются следствием разной скорости старения поколений, имеющих общих прародителей и принадлежащих одной генетической линии. Помимо только эвристического осознания новизны и важности этих фактов для моделирования колебательных процессов в живой материи и в сложных биофизических системах, особое значение они приобретают для экспериментальной биологии старения, которая вкупе с медициной стремится разработать средства сохранения здоровья и продления жизни людей. В связи с этим создается иное освещение хорошо известных фактов слабой воспроизводи-
мости экспериментов с целью увеличения продолжительности жизни при помощи геропротек-торов, а также ограниченная 30—35% эффективность последних. Все эти явления могут быть непосредственно связаны с неслучайными колебательными изменениями продолжительности жизни от поколения к поколению. Оказалось, что экстремальные величины средней ее продолжительности контрольной линии определяют тот допустимый интервал ее значений, внутри которого в принципе только и могут находиться значения средней продолжительности жизни экспериментальных групп после воздействия ге-ропротектором. Эти положения были опытно доказаны.
В качестве геропротектора использовали спиновую радикальную ловушку 4-hidroxy-tempo (4HT; Sigma, США), классический ингибитор свободнорадикальных процессов. Кристаллический порошок вносили в питательную среду в периоде личиночной фазы развития дрозофилы в количестве 0,2 вес %; наблюдали за выживанием контрольных и подопытных групп взрослых мух в 28 последовательных поколениях. После воздействия 4HT величина средней продолжительности жизни в экспериментальной группе может как превышать ее в контрольной группе, так и быть ниже последней. Наблюдали и отсутствие различий. Обработка результатов проведена в терминах теории колебаний, количественно мера различий в выборках оценивалась по критерию Колмогорова-Смирнова. Оказалось, что продолжительность жизни контрольной популяции, которая неслучайным образом меняется от поколения к поколению, с вероятностью 76% определяет эффект воздействия геропротектора. Иными словами, вероятность увеличивать продолжительность жизни (т. е. замедлять старение) зависит от жизнеспособности объекта. Для популяции, жизнеспособность которой мала, эффективность при прочих равных условиях будет выше и наоборот. Практический вывод указывает, что трудно надеяться на изобретение универсальных средств продления жизни, предпочтительнее среди их разнообразия (если оно будет достигнуто) выбирать подходящее. Популярные медицинские препараты, рекламируемые как средства замедления старения, мела-тонин и синтетический пептид Ala-Glu-Asp-Gly (аналог активного начала эпиталамина) не являются исключением, их эффективность подчиняется той же закономерности [1,25,33,34].
Первичная мишень и этапы процесса старения
Гипотеза о накоплении повреждений и ошибок, в том числе по вине свободных радикалов, не противоречит представлению о наличии внутреннего источника процесса старения, т. е. его запрограммированности. Главный путь реализации старения организма видится многими авторами в разрушении генома. Хромосомная ДНК клеток является хранителем программы старения и одновременно выступает в роли основной мишени, или инициального субстрата, с повреждения структуры или функциональной недостаточности которого, собственно, и начинается процесс старения на молекулярном и клеточном уровне [2,17,28].
Идентичность формы кривых выживания человека, лабораторных мышей и крыс и насекомых указывает на сходные черты старения популяций разных видов. Несмотря на большие различия в величинах видовой продолжительности жизни, позволительно говорить о едином фундаментальном механизме старения. Следует, тем не менее, заметить: так как явные физиологические признаки старения обнаруживаются только на конечных стадиях индивидуального развития, то причастность ДНК к начальным этапам старения требует доказательств.
Представлялось целесообразным воспользоваться особенностями развития насекомых, продолжительность жизни которых складывается из четко разделенных стадий морфогенеза. Бго8орЫ1а melanogaster на протяжении многих десятилетий остается главным объектом не только генетики, но и биологии развития и геронтологии. В качестве модификаторов скорости старения использовались мутаген нитрозоди-метилмочевина и геропротектор 3-ОП (эмокси-пин). Применяемые дозы этих соединений не были токсичными и не оказывали влияния на скорость развития личинок. Для более детального выяснения картины замедления старения была выполнена серия опытов, в которых варьировалось время воздействия препаратом 3-ОП. В трех вариантах экспериментов с самками дрозофилы постепенно сокращали длительность воздействия за счет исключения преимагиналь-ной стадии. Перемещение воздействия на более поздние этапы морфогенеза приводило к уменьшению эффекта продления жизни: средняя про-
должительность жизни самок дрозофилы, взятых в опыт в возрасте один день, увеличивалась на 12%, воздействие на дрозофил в возрасте 20 и 40 дней не приводило к замедлению старения. В опытах с самцами дрозофилы период воздействия постепенно увеличивали: первоначально оно затрагивало только преимагиналь-ную стадию морфогенеза, затем было увеличено за счет первых 10 дней имагинальной стадии и, наконец, охватывало все время жизни от момента откладки яиц до гибели всех имаго. Увеличение средней продолжительности жизни во всех трех случаях было близким и составляло 18,0, 22,0 и 20,4%.
Обработка личинок третьего возраста нитро-зодиметилмочевиной (0,001%) в течение 10 ч приводила впоследствии к значительному ускорению старения самцов: их средняя и максимальная продолжительность жизни сокращалась на 37 и 33%. В тех же условиях продолжительность жизни самок не изменялась.
Основной результат этих опытов кажется на первый взгляд парадоксальным: наибольшее замедление старения достигалось при воздействии в личиночной стадии или на молодых имаго, когда фенотипические признаки старения отсутствуют. Чем старше имаго, тем меньше эффективность препарата; воздействие, начатое в возрасте 20 дней и старше оказалось безрезультатным. Было сделано предположение, что в тех тканях личинок, из которых формируются органы взрослых мух (нервная ткань, имагиналь-ные диски), накапливаются повреждения, приводящие затем к старению. Регулируя скорость накопления этих повреждений с помощью мутагенов или геропротекторов, можно повлиять на скорость старения взрослых особей. Это означает, что процесс старения складывается, по крайней мере, из двух качественно различных этапов — этапа накопления повреждений и этапа их реализации. Наступление этапа реализации, возможно, требует не только определенного порогового уровня повреждений, но и времени, по истечении которого появляются фенотипические признаки старения. Так как эти этапы разделены во времени, то можно предполагать, что первичной мишенью могут быть только макромолекулы, способные к длительному хранению информации о повреждающем воздействии, т. е. роль первичной мишени в процессе старения выполняют молекулы хро-
мосомной ДНК. С достижением этого момента дальнейшее увеличение числа повреждений уже не оказывает заметного влияния на скорость старения. Информация о повреждении или защита других макромолекулярных компонент клетки не может быть непосредственно передана от личинок дрозофилы к взрослым особям, так как все основные макромолекулярные компоненты клеток многократно обновляются при метаморфозе. Более высокую степень старения самцов дрозофилы в опытах с нитрозодиметил-мочевиной можно объяснить тем, что у них, в отличие от самок, количество генетического материала примерно на 15% меньше [19,37].
Таким образом, ДНК нервных клеток личинки дрозофилы может рассматриваться в качестве первичного субстрата (мишени) при старении. На основе результатов этих работ [1] представляется возможным выделить этапы процесса старения: 1 — потенциальную фазу, длительность которой приблизительно оценивается величиной плеча кривой выживания, и 2 — фазу реализации (терминальную), т.е. гибели организмов. В этих экспериментах чувствительным к воздействию оказался личиночный период развития [1,2].
К сходному заключению приводит и непосредственное наблюдение за вторичной структурой ДНК клеток млекопитающих. В начале терминальной фазы в постмитотических клетках головного мозга мышей, нейронах, появляются и накапливаются дефекты вторичной структуры ДНК, опознаваемые нуклеазой Б1, локализованные в основном в АТ-богатых районах. Известно, что АТ-богатые участки ДНК находятся во многих функционально значимых областях генома эукариот, поэтому появление там нерепа-рируемых дефектов может отрицательно сказаться на функции генетических систем клетки. По-видимому, увеличение с возрастом числа Б1-чувствительных участков генома происходит не стохастически, а посредством генетически управляемого процесса [18,19,20]. Переход от потенциальной фазы старения к терминальной происходит очень быстро вследствие реализации накопленных изменений, число которых превосходит критический уровень. Была разработана математическая модель такого процесса. Все изложенное не противоречит идее о том, что смертность индивидуумов и вымирание видов животных в эволюции могут быть обусловлены
одним и тем же фундаментальным механизмом, действующим с различной скоростью в соматических и половых клетках, обеспечивающих материальную преемственность поколений [1].
Этот цикл работ идейно очень близок ранним работам Н.М. Эмануэля по управлению скоростью свободнорадикальных химических реакций посредством воздействия на их ранние стадии [26].
Критический период в позднем онтогенезе.
Предиктор продолжительности жизни
В биологии старения, несмотря на все поразительные успехи последних десятилетий, пока не создан метод количественной оценки скорости старения индивида, располагая которым можно было бы предсказать продолжительность жизни особи. С другой стороны, нет никаких основательных препятствий для эмпирического решения задачи прогнозирования продолжительности жизни. Однако цель работы следует привести в строгое соответствие с методическими приемами.
Количественный результат геронтологиче-ских опытов часто сводится к регистрации возрастных различий или возрастных изменений, и хотя в литературе оба термина нередко используются как равнозначные, каждый имеет свое собственное смысловое содержание. Горизонтальные методы (cross-section) изучения, а именно с их помощью поставляется основной массив эмпирических фактов, позволяют определить средние возрастные различия между группами животных или лиц. Анализ средних величин не может сказать ничего о том, с какой скоростью стареет особь и каковы индивидуальные черты этого процесса. Только длительное (longitudinal) наблюдение одних и тех же подопытных животных позволяет проследить истинные возрастные изменения, совокупность которых складывается в адекватную динамическую картину старения.
Цитируемая работа содержит сведения об индивидуальных возрастных изменениях массы тела, ректальной температуры, показателя функциональной моторной асимметрии (поведения), продолжительности жизни и величин постоянного потенциала полушарий мозга 37 мышей самок СВА за период с марта 1993 по октябрь 1995 гг. Авторы сознательно избежали использования биохимических показателей, несмотря
на то, что им часто придают смысл «маркеров старения», по двум причинам: первое, применяемые процедуры должны быть строго неинва-зивными, т. е. не причинять животным вреда; второе, коэффициент вариации биохимических параметров, участвующих в адаптации, может изменяться в широких пределах 20—60%, тогда как в морфологических тестах ошибка измерения не превышает 4—6%. Показатель функциональной моторной асимметрии оценивали числом спонтанных поворотов направо из 10 попыток в Т-образном лабиринте [23].
Величина постоянного потенциала, измеряемая в левом и правом полушариях головного мозга, является, согласно современным представлениям, интегральной биофизической характеристикой, отражающей совокупность обменных процессов в коре больших полушарий. Значения этой величины складываются из мембранных потенциалов нейронов и глиаль-ных клеток. Чем больше межполушарная разница потенциалов, тем отчетливее выражена функциональная и биохимическая асимметрия мозга [23].
Одной из задач было наблюдение за возрастной динамикой поведения мышей в Т-лабиринте и поиск закономерной связи межполушарной разницы потенциалов с функциональной моторной асимметрией. Не вызывает сомнений наличие у мышей латеральной специализации больших полушарий, которая является важнейшим принципом работы мозга позвоночных. Ранее этот факт оспаривался по причине отсутствия точных данных, подтверждающих наличие функциональной моторной асимметрии у большинства видов животных. Онтогенетическая динамика этого явления пока мало изучена.
Повышенное внимание исследователей к старению мозга в последнее десятилетие позволило выяснить многие морфологические и биохимические отличия нейронов старых и молодых животных. За редким исключением, авторы этих работ пользовались групповым сравнением и инвазив-ными (ранящими) экспериментальными методиками, посредством которых принципиально невозможно описать старение как процесс, развивающийся во времени. Во избежание подобной методической ошибки были избраны два параметра, допускавшие прижизненное измерение без вреда здоровью животных: 1) величина постоянных потенциалов левого и правого полушарий
ил, мВ 5 4 3 2 1 0
а
Г \
1 V 1 т т
4
Г Л
► \
\
V
и I
-2 -3 -4 -5
ип, мВ 5 4 3 2 1 0 -1 -2 -3 -4 -5
0
1
б
.* 1 1 -
1 ■ Г 1 1- -I |
1 1 г 1 41 1
Ч N 1 4
1
1
\
\Т
10
Возраст, мес
20
30
Рис. 1. Зависимость от возраста среднего значения величины постоянного потенциала в левом (а) и правом (б) полушариях головного мозга мышей. На графиках показана ошибка среднего.
(и); 2) показатель функциональной моторной асимметрии, характеризующий поведение мышей в Т-лабиринте (П). Это позволило избежать группового сравнения и открыло возможность кинетического (лонгитудинального) изучения.
На рис. 1 изображена возрастная динамика среднего значения величины и (мВ) в левом (а) и правом (б) полушариях мозга мыши; следует отметить две яркие особенности этого процесса: 1) четко выраженную нелинейность и 2) сим-батный ход изменений в обоих полушариях. Узкая область максимальных значений и приходится на возраст 8—10 мес, далее следует длительный период с 10 до 18 мес снижения величины потенциала с +4 до —1 мВ, старческий период с 18 до 22 мес отмечен небольшим подъемом, за которым происходит резкий спад потенциала вплоть до величины —30 мВ в глубокой старости.
Не менее сложна возрастная картина изменения массы тела и поведения мышей, отраженная на рис. 2, где приведена динамика средних и индивидуальных величин. И здесь можно выделить основные общие черты: во-первых, нелинейность, во-вторых, область максимальных
0
10 20 Возраст, мес
значений массы тела и величины П значительна, с 10 до 18 мес, и совпадает с периодом снижения величин постоянных потенциалов полушарий. Четко выраженная латерализация поведения (П составляет 8—10) проявляется только в среднем возрасте, среди более молодых и более старых животных преобладают особи-амбидек-стры. Взаимосвязь показателя моторной асимметрии с межполушарной разностью потенциалов изучалась у мышей моложе и старше 14 мес.
36 34 - 32 § 30 1 28 I 26
о 24 22
10 8 6 4 2 0
45 40 35 30 25 20 15
10 8 6
10 20
Возраст, мес
в
т V \
/ \
10 20 Возраст, мес
30
г
10 20
Возраст, мес
30
Рис. 2. Возрастная динамика средних (а и б) и индивидуальных (в и г) величин массы тела и показателя функциональной моторной асимметрии (П) у мышей.
4
2
0
В обеих возрастных группах имеется линейная зависимость между этими параметрами с коэффициентами корреляции —0,63 и +0,88 соответственно. Значения коэффициентов корреляции для разных возрастов представлены на рис. 3. В возрасте 3—7 мес коэффициент отрицательный и равен —0,42; затем он постепенно увеличивается и становится близким к нулю (10—18 мес) и в возрасте 21—22 мес приобретает значение +0,53. Основная особенность этой зависимости состоит в перемене знака линейной регрессии. Этот переход происходит не внезапным скачком, но постепенно, благодаря чему в среднем возрасте значение коэффициента корреляции близко к нулю. Именно этот период соответствует участку наиболее выраженной латерализации. Возможно, что изменение знака регрессии свидетельствует о качественных функциональных изменениях, происходящих в тканях ЦНС накануне появления фенотипиче-ских признаков старения. Изменение знака линейной регрессии указывает также на переключение доминантности полушарий.
Как показывают изложенные выше результаты, моторный контроль у мышей не связан жестко с деятельностью одного полушария, доминирование по этому признаку относительное и не исключает инверсию. Возрастная динамика поведения является отражением изменяющихся в онтогенезе межполушарных отношений. При повреждении одного полушария, например, посредством облучения, компенсаторно увеличивается нагрузка на другое. Наблюдения показали, что в этом случае чувствительнее доминантное (левое) полушарие [15].
Качественный характер возрастных изменений в мозге указывает на то, что старение является не только процессом постепенного накопления повреждений. Оно скорее напоминает фазовый переход, который происходит в среднем возрасте, когда внешние признаки старости еще отсутствуют. Следовательно, для понимания механизмов старения особое внимание исследователей должен привлекать именно этот возрастной период.
Возрастная картина изменений физиологических параметров, представленная на рис. 1—3, характеризуется ярко выраженной нелинейностью. Обращают на себя внимание не столько сами экстремумы, сколько более значительное, на наш взгляд, их хронологическое совпаде-
K 0,6
9-11 11-15 17-19 21-22 26-28 Возрастные группы, мес
Рис. 3. Коэффициент корреляции К между межпо-лушарной разностью потенциалов и П (поведением) для разных возрастных групп. Значения К указаны на графике.
ние, которое указывает на существование периода экстремальных изменений в возрасте 10-18 мес.
Полученные данные показывают, что наряду с линейными, на основе которых обычно рассчитывается биологический возраст, обнаруживаются и нелинейные возрастные изменения, т. е. процесс старения в целом протекает неравномерно [16,23]. Тот факт, что наблюдаемые экстремумы привязаны к одному возрастному периоду 10-18 мес, позволяет рассматривать это явление как неслучайное, как некий критический период, который занимает значительное время в позднем онтогенезе у мыши.
Для дальнейшего анализа были использованы следующие величины: возраст, при котором достигается максимальная масса тела, — Tm и возраст наибольшей латерализации поведения — Тп. Корреляционный анализ обнаружил, что между величинами Tm и Тп существует взаимная корреляция (г = 0,6; p < 0,001), которая, возможно, не отражает прямых причинно-следственных отношений, но указывает на то, что обе эти величины могут быть подвержены влиянию иных общих факторов.
Разность (Tm — Тп) линейно связана с продолжительностью жизни особи (рис. 4), т. е. эта величина имеет прогностическое значение как ее предиктор. При совпадении возрастов, т. е. когда Tm — Тп = 0, вычисляемая продолжительность жизни практически совпадает со средней продолжительностью жизни группы ~25 мес. Эта эмпирическая зависимость, полу-
Тт-Тп, мес
Рис. 4. Взаимосвязь индивидуальной продолжительности жизни мышей с разностью величин Тш и Тп, где Тш — возраст достижения максимальной массы тела, Тп — возраст достижения наибольшей латерализации поведения. На графике показано уравнение линейной регрессии и аппроксимирующая прямая.
ченная впервые, позволяет в ходе опыта оценить ожидаемое изменение продолжительности жизни каждой особи после какого-либо воздействия (геропротекторы, облучение, низкокалорийная диета и др.). Из наблюдений за животными разных видов известно, что долгоживу-щие млекопитающие имеют больший период полового созревания, позже достигают максимальной массы тела и оптимального соотношения масса мозга/масса тела [3,12,29].
Критический период, т. е. наиболее чувствительный к воздействиям этап жизни, у дрозофилы совпадает с личиночной стадией развития, у мыши приходится на середину взрослой жизни. Логично предположить, что именно в этом периоде реализуются предпосылки, совокупность которых определяет долгожительство.
ЛИТЕРАТУРЫ
1. Акифьев А.П., Обухова Л.К., Измайлов Д.М. Вестник Российской академии наук. 1992; 3: 82-92.
2. Акифьев А.П., Потапенко А.И. Успехи геронтол. 1997; 1: 41-47.
3. Алтухов Ю.П. Генетика 1998; 34(7): 908-919.
4. Анисимов В.Н. Молекулярные и физиологические механизмы старения. СПб.: Наука; 2003. 438 с.
5. Березовский В.Н. Химия витаминов. М.: Пищепром-издат; 1973. 632 с.
6. Бурлакова Е.Б., Молочкина Е.М. Биофизика. 1973; 18(2): 293-298.
7. Бурлакова Е.Б., Храпова Н.Г. Успехи химии. 1983; 54(9): 1540-1579.
8. Голубев А.Г. Биохимия. 1996; 61: 2018-2039.
9. Дюмаев K.M., Воронина Т.А., Смирнов Л.Д. Антиок-сиданты в патологии и терапии ЦНС. М.: Изд-во ин-та биомед. химии; 1995. 271 с.
10. Жижина Г.П., Блюхтерова Н.В. Биохимия 1997; 62(1): 106-111.
11. Измайлов Д.М., Обухова Л.К. Конрадов А.А. Химическая физика. 1995; 14(11): 95-101.
12. Лэмб М. Биология старения. М.: Мир; 1980. 240 с.
13. Обухова Л.К. Успехи химии. 1975; 44(3): 19141925.
14. Обухова Л.К. Использование синтетических антиок-сидантов (геропротекторов) для изучения механизмов старения. Препринт. Черноголовка. Изд-во ИХФ АН СССР; 1988. 32 с.
15. Обухова Л.К., Клименко Л.Л., Соловьева А.С. Изв. АН. Сер. Биол. 1997; 3: 315-319.
16. Обухова Л.К., Конрадов А.А., Колтунова А.С. Доклады АН. 1995; 341(4): 549-552.
17. Оловников А.М. Успехи геронтол. 1999; 3: 54-64.
18. Потапенко А.И. Цитология 1997; 36(7): 749-750.
19. Потапенко А.И., Акифьев А.П., Иванов В.И. Радиобиология. 1982; 22: 318-322.
20. Потапенко А.И., Обухова Л.К. Изв. РАН. Сер. биол. 1992; 6: 940-943.
21. Соловьева А.С., Обухова Л.К., Жижина Г.П., Блюхтерова Н.В. Геронтол. и гериатрия. 2001; 1: 46-48.
22. Соловьева А.С., Обухова Л.К. Успехи геронтол. 2001; 7: 105-109.
23. Соловьева А.С., Обухова Л.К. Успехи геронтол. 2003; 11: 43-46.
24. Хавинсон В.Х., Анисимов В.Н. Пептидные биорегуляторы и старение. СПб.: Наука; 2003. 223 с.
25. Хавинсон В.Х., Измайлов Д.М., Обухова Л.К. и др. Доклады АН. 2000; 374(5): 710-712.
26. Эмануэль Н.М. ДАН СССР. 1954; 95(3): 603-606.
27. Эмануэль Н.М. Биология старения. Л.: Наука; 1982. 569-585.
28.Akifyev A.P., Potapenko A.I., Korotkov E.V. Rejuvenation. 1982; 10(4): 18-24.
29. Comfort A. The Biology of Senescence. Edinburg, London: Churchill Livins. 1979. 414.
30. Cutler R. Arch. Gerontol. Geriatr. 1984; 3(4): 321348.
31. Emanuel N.M., Obukhova L.K. Exp. Gerontol. 1978; 13: 25-29.
32. Izmaylov D.M., Obukhova L.K., Okladnova O.V et al. Experimental Gerontology. 1993; 28(2): 169-180.
33. Izmaylov D.M., Obukhova L.K. Mech. Ageing. Dev. 1996; 91: 155-164.
34. Izmaylov D.M., Obukhova L.K. Mech. Ageing. Dev. 1999; 106: 233-240.
35. Izmaylov D.M., Obukhova L.K. Mech. Ageing. Dev. 2003; 123: 589-597.
36. Massie H.R., Ferreira J.R., De Wolfe L.K. Gerontology. 1986; 32(4): 189-195.
37. Obukhova L.K., Nakaidze N.Sh, Serebrjany A.M. et al. Exp. Gerontol. 1979; 14(2): 335-342.
38. Voeikov V.L. The key role of active oxygen initiation, formation and execution of vitalfunctions. Biophotonics and Coherent Systems. M.: Moscow University Press, 2000. 460 с.
Поступила 25.04.2005
