CC BY
132
EXPERIMENTAL ARTICLES
УДК 546.26.043
АГРЕГАТНОЕ СОСТОЯНИЕ С60-ФУЛЛЕРЕНА В РАЗЛИЧНЫХ СРЕДАХ
И. И. Гринюк1
С. В. Прилуцкая1 1Киевский национальный университет
Н. С. Слободяник1 имени Тараса Шевченко, Украина
А. Ю. Чунихин2 2Институт биохимии им. А. В. Палладина НАН Украины, Киев
О. П. Матышевская1
Е-mail: [email protected]
Получено 23.07.2013
Методом фотонной корреляционной спектроскопии осуществлена оценка распределения по интенсивности, объему и количеству наночастиц немодифицированного (pristine) С60-фуллерена в водной среде, лишенной химических дисперсантов, различающейся по солевому и протеиновому составу. Показано, что в водном коллоидном растворе содержатся частицы С60-фуллерена диаметром от 38 до 600 нм, при этом значительную часть составляют наночастицы диаметром порядка 43 нм. В солевом растворе (0,9% NaCl) наблюдается образование агломератов С60-фуллерена — процентное содержание более крупных наночастиц С60 возрастает по сравнению с таковым в водном растворе. Добавление альбумина в среду способствует диспергированию наночастиц С60 и предотвращает их как спонтанную, так и NaCl-зависимую агломерацию. При внесении С60-фуллерена в концентрации 10-5 М в среду RPMI 1640, содержащую 5%-ю эмбриональную телячью сыворотку, не наблюдается значительной агломерации наночастиц. Полученные данные свидетельствуют, что гомогенный стабильный водный коллоидный раствор немодифицированного С60-фуллерена может быть использован для изучения клеточного ответа в культуральной среде.
Ключевые слова: С60-фуллерен, фотонная корреляционная спектроскопия, агломерация, альбумин.
В последнее время произошел значительный прорыв в области исследования свойств наноматериалов и возможности их применения в биологии и медицине. Особый интерес вызывает представитель карбоновых наноструктур С60-фуллерен. Наноразмерность и особенности строения обусловливают уникальные физико-химические свойства молекулы С60. Благодаря наличию системы п-конъюгированных двойных связей на поверхности молекула С60 улавливает свободные радикалы и проявляет свойства антиоксиданта, а при условии фотовозбуждения способна продуцировать активные формы кислорода и может быть использована в качестве фотосенсибилизатора для антираковой фотодинамической терапии. С60-фуллерены обладают нейропротектор-ной активностью, антимикробным и антивирусным действием, что определяет их применение в медицине [1-3].
Ограничениями для такого применения являются высокая степень гидрофобности молекул С60, агломерация в водной среде,
образование наночастиц различного размера и, как следствие, нестабильность водных дисперсий наночастиц С60. Тот факт, что биологическая активность С60-фуллерена в значительной степени зависит от диаметра образуемых наночастиц, их концентрации, поверхностного заряда, формы, распределения по размеру, объясняет определенную противоречивость данных относительно биосовместимости и токсичности фуллерена С60 [4-6]. Считается доказанным отсутствие токсичности С60-фуллерена в диапазоне концентраций 10-7-10-5 [7, 8]. Для повышения гидрофильности С60 используют модификацию поверхности молекулы полярными заместителями, однако такая модификация изменяет свойства молекулы, влияет на ее антиоксидантную активность и способность проникать через клеточную мембрану. В связи с этим перспективным является изучение возможности использования немодифицированного (pristine) С60-фуллерена в биологических исследованиях, в частности для изучения клеточного ответа in vitro.
Относительная агломерация молекул С60 в водной дисперсии определяется двумя основными факторами — способом получения карбоновых наночастиц и составом суспензионной среды, которая часто содержит диспергирующие вещества: тетрагидрофуран, диметилсульфоксид, поливинилпиролидон для обеспечения стабильности водных дисперсий [1, 9, 10]. Между тем, культуральные среды для клеток млекопитающих характеризуются высоким содержанием электролитов (соли, аминокислоты, витамины), необходимых для клеточного роста, но способствующих агломерации наночастиц. Целью работы была оценка распределения наночастиц пристинно-го С60-фуллерена в лишенной химических дисперсантов водной среде, различающейся по солевому и протеиновому составу.
Материалы и методы
В работе использован метод получения С60-фуллерена, основывающийся на сжигании графитового стержня в дуге постоянного тока и атмосферы гелия при температуре 6 000 °С. Очистку С60-фуллерена осуществляли методом гель-хроматографии с использованием в качестве элюента толуола и высокоэффективной жидкостной хроматографии (Jasco PU-2086). Органический растворитель удаляли выпариванием в вакууме, после добавления дистилированной воды смесь фуллерена С60 подвергали длительной (8 ч) обработке в ультразвуковой бане для получения водного коллоидного раствора [11].
Размер наночастиц определяли методом фотонной корреляционной спектроскопии на лазерном корреляционном спектрометре ZetaSizer-3 (Malvern Instruments, Великобритания), оборудованном He-Ne лазером ЛГН-111 (р = 25 мВт, X = 633 нм). Диапазон измерения прибора составляет от 1 нм до 20 мкм. Работа спектрометра основана на анализе корреляционных характеристик флуктуации интенсивности динамически рассеянного света при прохождении лазерного луча через среду [12]. Измерение корреляционной функции флуктуаций интенсивности рассеянного света и интегральной интенсивности рассеяния позволяет рассчитать коэффициент трансляционной диффузии дисперсных частиц в жидкостях и по уравнению Стокса-Эйнштейна определить распределение наночастиц в жидкостях по эффективному гидродинамическому диаметру. Коэффициент трансляционной диффузии D частиц связан с интервалом корреляции тс соотношением:
Dq2 = 1/тс.
Волновой вектор флуктуации концентрации q описывается соотношением:
где п — показатель преломления среды (жидкости);
А0 — длина волны излучения;
в — угол рассеяния.
Используя формулу Стокса-Эйнштейна, которая связывает значение гидродинамического диаметра частиц с коэффициентом трансляционной диффузии и вязкостью жидкости, можно рассчитать диаметр сферических частиц:
где kB — постоянная Больцмана;
T — абсолютная температура, К;
П — динамическая вязкость среды, в которой суспендированы частицы;
D — коэффициент трансляционной диффузии.
Исследуемую суспензию в количестве 1 мл помещали в цилиндрическую оптическую кювету из кварца диаметром 10 мм, которую вводили в лунку лазерного корреляционного спектрометра с поддержанием постоянной температуры. Регистрацию и статистическую обработку лазерного излучения, рассеянного от водной (n = 1,33) суспензии наночастиц, проводили многократно в течение 180 с при температуре +22 °С под углом рассеяния 90°.
Полученные результаты измерений обрабатывали с помощью сервисной компьютерной программы PCS-Size mode v1.61. Лазерный корреляционный спектрометр оборудован коррелятором multi computing correlator type 7032 ce.
Агрегатное состояние наночастиц С60-фуллерена оценивали в водной среде без добавок, с добавлением NaCl (0,9%), сывороточного альбумина (5%), а также в среде RPMI 1640, содержащей 5%-ю эмбриональную телячью сыворотку (ЭТС).
Результаты и обсуждение
Немодифицированные (pristine) фулле-рены способны образовывать в воде стабильные «гидрофильные» коллоидные растворы, называемые также дисперсиями [3, 13, 14]. В данной работе использован один из способов их получения — перенесение из органической (толуол) в водную фазу и длительная
обработка ультразвуком до получения водного коллоидного раствора С60-фуллерена в концентрации 10-4М. Степень чистоты С60-фуллерена в полученном растворе составляла 99,5% [11].
Гидрофобность поверхности немодифици-рованного (pristine) фуллерена обусловливает тенденцию к самосборке и агрегации молекул С60 с формированием фуллереновых наночастиц различного размера. Однако поведение очищенных фуллереновых наночастиц, которые имеют отрицательный поверхностный заряд, определяется не только гидрофобными и ван-дер-ваальсовыми, но и электростатическими взаимодействиями, т. е. зависит от присутствия электролитов в среде растворения [15]. В связи с этим был проведен сравнительный анализ распределения С60-наноча-стиц в водном растворе и в осмолярном NaCl.
Анализ интенсивности рассеивания света при прохождении лазерного луча через коллоидный водный (10-5) раствор С60-фуллерена показывает, что диапазон размеров содержащихся в растворе сферических частиц С60 составляет 38-600 нм с пиком порядка 221 нм (рис. 1, А). В растворе 0,9% NaCl наблюдалось смещение вправо как диапазона размеров частиц (50-800 нм), так и значения пика на 293 нм.
Кривые, характеризующие относительный объем, занимаемый частицами определенного размера в воде и в растворе NaCl, также отличаются (рис. 1, Б). Значительный объем в водном растворе занимают частицы размером от 45 до 220 нм. В солевом растворе возрастает в три раза по сравнению с таковым в водном растворе процентное содержание крупных С60-частиц диаметром 403 нм.
Анализ относительного количества наночастиц определенного размера в образце указывает на гомогенность водного коллоидного раствора С60-фуллерена, значительную часть которого (30%) составляют наночастицы диаметром 43 нм (рис. 1, Б). В физиологическом растворе NaCl выявлены С60-наночастицы преимущественно диаметром 94 нм и в небольшом количестве — частицы диаметром 378 нм.
Как показано нами ранее, во время проведения повторяющихся в течение 15 мин измерений гидродинамический радиус С60-наноча-стиц в водном коллоидном растворе не изменяется [16]. Нами отмечено, что этот показатель не изменяется и через 6 мес, что указывает на стабильность полученной С60-суспен-зии в течение длительного периода хранения.
Таким образом, агрегатное состояние частиц С60-фуллерена в присутствии NaCl изменяется. Установлено, что электрофоре-
тическая подвижность, обусловленная отрицательным поверхностным зарядом фулле-реновых наночастиц, снижается при повышении концентрации как моновалентных, так и дивалентных электролитов [17-19]. Повышение концентрации натрия приводит к связыванию иона на поверхности наночастички, экранированию ее поверхностного заряда и снижению энергетического барьера агрегации, вследствие чего агрегация наночастиц ускоряется [20].
Согласно приведенным в [15] данным, критическая концентрация коагуляции наночастиц немодифицированного (pristine) С60-фуллерена для NaCl при рН 5,2 составляет 120 мМ. Полученные нами данные подтверждают тенденцию к агломерации наночастиц немодифицированного (pristine) С60 в растворах с физиологической концентрацией NaCl.
Intensity
Volume
Diametr(nm)
Number
Diameti(nm)
Рис. 1. Анализ агрегатного состояния частиц С60-фуллерена в водной среде и в 0,9%-м растворе методом фотонной корреляционной спектроскопии
Поскольку обязательным компонентом культуральных сред, приближенных по составу к биологическим, являются протеины, было исследовано распределение наночастиц С60 при внесении в среду не только ЫаС1, но и альбумина.
Характерный диапазон размеров частиц в 5%-м водном растворе альбумина составляет 2-26 нмс пиком порядка 5 нм (рис. 2, кривая 2). При смешивании С60-фуллерена и альбумина диаметр выявляемых в растворе наночастиц увеличивается (диапазон — от 4 до 40 нм, пик — 10 нм) (рис. 2, кривая 3), что свидетельствует о связывании С60-фуллерена с альбумином. Такое связывание предотвращает вызываемую ЫаС1 агломерацию молекул С60-фуллерена, поскольку в растворе, содержащем альбумин, ЫаС1 и С60, диапазон размера наночастиц (рис. 2, кривая 4) остается почти таким же (4,5-45 нм), как и в растворе С60 с альбумином, а значение среднего диаметра наночастиц в среде, содержащей альбумин, ЫаС1 и С60 (13 нм) является меньшим, чем наночастиц С60 в воде (43 нм) (рис. 2, кривая 1) и в 0,9%-м ЫаС1 (94 нм) (рис. 1, В). Таким образом, присутствие альбумина в среде способствует диспергированию наночастиц С60 и предотвращает как их спонтанную, так и зависимую от ЫаС1 агломерацию.
Для исследования длительной динамики клеточного ответа на воздействие наночастиц часто используют среду ИРМ! 1640 — сложную смесь, содержащую, в частности, соли, аминокислоты, различные протеины и липиды. Важной составляющей таких исследований является оценка концентрационной зависимости эффектов наночастиц. В связи с этим было изучено распределение фуллереновых наночастиц в среде ИРМ!
Number
Diametr (nm)
Рис. 2. Сравнительный анализ количественного распределения по размеру частиц в водной среде, содержащей С60 (1), альбумин (2),
С60 и альбумин (3),
С60, альбумин и КаС1 (4) методом фотонной корреляционной спектроскопии
1640 с 5% ЭТС при внесении С60 в двух концентрациях — 10-5 и 210-5.
Анализ кривых, отражающих относительный объем, занимаемый частицами определенного размера в общем объеме образца, показал увеличение объема, занимаемого частицами со средним диаметром 495 нм в среде КРМ1 1640 по сравнению с водной средой, что свидетельствует об усилении агломерации частиц в 10 5 М растворе С60-фуллерена. Однако существенной агломерации не происходит — как в КРМ1 1640, так и в водном растворе преобладают наночастицы со средним диаметром 50 нм (рис. 3, Б; рис. 1, В). В то же время двукратное увеличение концентрации С60-фуллерена в среде ИРМ! сопровождается заметным усилением агломерации. Так, объем, занимаемый частицами 40-200 нм, снижается, а занимаемый частицами со средним диаметром 431 нм — увеличивается. Кривая, характеризующая объемное распределение частиц, смещается вправо и имеет два пика — 92 и 413 нм (рис. 3, Б).
Таким образом, при внесении С60-фулле-рена в концентрации 10-5 М в среды, приближенные по составу к биологическим, не наблюдается значительной агломерации частиц. Это согласуется с гипотезой [9] относительно того, что включение компонентов протеиновой и липидной природы в состав среды является условием оптимального дис-
Уо1ише
Diametr (пт)
Number
Б • 1 • 1 II 1 II
r i / j\ j : : W+-2*i(nw
• м ■ 1* а) Diametr (пт) щи
Рис. 3. Агрегатное состояние частиц С60-фуллерена при внесении их в концентрации 1105 М и 210-5 М в среду ИРМ! 1640 с 5% ЭТС
пергирования карбоновых наночастиц в биологических системах. Критическим фактором, способствующим агломерации фуллерено-вых наночастиц, является повышение концентрации С60 в среде.
Размер наночастиц в значительной степени определяет их взаимодействие с клетками. Так, в работе [4] продемонстрировано эффективное поглощение наночастиц пристинного фуллерена С60 размером 100-130 нм кератино-цитами НаСаТ. Эпителиальные клетки Нер-2 селективно захватывали наночастицы размером 40-70 нм, выявляемые в ядре [21].
Важным условием взаимодействия карбоновых наночастиц с клеточной мембраной является их гидрофобность. Так, показано, что немодифицированные полистиреновые наночастички эффективно связываются с энтероцитами линии Сасо-2 и поглощаются в кишечнике крыс, в то время как модификация поверхности гидрофильным полоксаме-ром предотвращает такое поглощение [21].
ЛИТЕРАТУРА
1. Jensen A. W., Wilson S. R., Schuster D. I. Biological applications of fullerenes // Bioorg. Med. Chem. — 1996. — V. 4. — P. 767-779.
2. Bakry R., Vallant R. M., Najam-ul-Haq M. et al. Medicinal applications of fullerenes // Intern. J. Nanomed. — 2007. — V. 2, N 4. — Р. 639-649.
3. Пиотровский Л. Б., Еропкин М. Ю., Еропкина М. А. и др. Механизмы биологического действия фуллеренов — зависимость от агрегатного состояния // Психофарм. биол. нар-кол. — 2GG7. — Т. 7., Вып. 2. — С. 1548-1554.
4. Horie M., Nishio K., Kato H. et. al. In vitro evaluation of cellular responses induced by stable fullerene C60 medium dispersion // J. Bio-chem. — 2010. — V. 148. — P. 289-298.
5. Levi N., Hantgan R. R., Lively M. O. et. al. C60-Fullerenes: detection of intracellular photoluminescence and lack of cytotoxic effects // J. Nanobiotechnol. — 2006. — V. 4. P. 14-25.
6. Moussa F., Trivin F., Ceolin R. et. al. Early effects of C60 administration in Swiss mice: a premilionary account for in vivo C60 toxicity // Full. Sci. Technol. — 1996. — V. 4. — P. 21-29.
7. Andrievsky G. V., Klochkov V., Derevyanchenko L. Is C60 fullerene molecule toxic // Fuller. Nanotub. Carbon Nanostruct. — 2GG5. — V. 13. — P. 363-376.
8. Прилуцька С. В., Гринюк І. І., Голуб О. А. та ін. Оцінка параметрів цитотоксичності фулеренів С60 та С60-вмісних композитів in vitro // Доп. HАH України. — 2GG6 — № 1. — С. 163-167.
Таким образом, показано, что в водном коллоидном растворе содержатся частицы С60-фуллерена диаметром от 38 до 600 нм, при этом значительную часть составляют наночастицы диаметром порядка 43 нм. В солевом растворе (0,9% NaCl) наблюдается образование агломератов С60-фуллерена — процентное содержание более крупных наночастиц С60 возрастает по сравнению с таковым в водном растворе. Добавление альбумина в среду способствует диспергированию наночастиц С60 и предотвращает их как спонтанную, так и зависимую от NaCl агломерацию. При внесении С60-фуллерена в концентрации 10-5 М в среду RPMI 1640, содержащую 5% -ю эмбриональную телячью сыворотку, не наблюдается значительной агломерации наночастиц. Полученные данные свидетельствуют, что гомогенный стабильный водный коллоидный раствор немодифицированного (pristine) С60-фуллерена может быть использован для изучения клеточного ответа в культуральной среде.
9. Buford M. C., Hamilton Jr. R. F., Holian A. A comparison of dispersing media for various engineered carbon nanoparticles // Part. Fibre Toxicol. — 2007. — V. 4, N 6. — doi:10.1186/1743-8977-4-6.
10. Deguchi S., Yamazaki T., Mukai S. A. et. al. Stabilization of C60 nanoparticles by protein adsorption and its implications for toxicity studies // Chem. Res. Toxicol. — 2007. — V. 20. — P. 854 — 858.
11. Scharff P., Risch K,, Carta-Abelmann L. et al. Structure of C60 fullerene in water: spectroscopic data // Carbon. — 2004. — V. 42. — P. 1203-1206.
12. Scott E. McNeil. Characterization of nanoparticles intended for drug delivery. — Humana press. — 2011. — P. 283.
13. Sayes C. M., Fortner I. D., Guo W. et. al. The differential cytotoxicity of water-soluble ful-lerenes // Nano Lett. — 2004. — V. 4. — P. 1881-1887.
14. Labille J,, Brant J., Villieras F. et. al. Affinity of C60 fullerene with water // Fuller. Nanotub. Carbon Nanostruct. — 2006. — V. 14. — P. 307-314.
15. Chen K. L., Elimelech M. Aggregation and Deposition Kinetics of Fullerene (C60) Nanoparticles // Langmuir. — 2006. — V. 22. — P.10994-11001.
16. Grynyuk I., Grebinyk S., Prylutska S. et. al. Photoexcited fullerene C60 disturbs prooxi-dant-antioxidant balance in leukemic L1210 cells // Mat.-wiss. u. Werkstofftech. — 2013. — V. 44, N 2 — 3. — P. 139-143.
17. Deguchi S., Alargova R. G., Tsujii K. Stable dispersions of fullerenes, C60 and C70, in water. Preparation and Characterization // Langmuir. — 2001. — V. 17, N 19. — P. 6013-6017.
18. Mchedlov-Petrossyan N. O., Klochkov V. K., Andrievsky G. V. Colloidal dispersions of ful-lerene C60 in water: some properties and regularities of coagulation by electrolytes // J. Chem. Soc. Faraday Trans. — 1997. — V. 93, N 24. — P. 4343-4346.
19. Brant J. A., Labille J., Bottero J.-Y. et. al. Characterizing the impact of preparation
method on fullerene cluster structure and chemistry // Langmuir. — 2006. — V. 22, N 8. — P. 3878-3885.
20. Elimelech M., Gregory J., Jia X., Williams R. A. Particle deposition and aggregation: measurement, modelling and simulation; Butter-worth-Heinemann: Oxford, U.K., 1995.
21. Neumeyer A., Bukowski M., Veith M. et. al. Propidium iodide labeling of nanoparticles as a novel tool for the quantification of cellular binding and uptake // Nanomedicine. — 2011. — V. 7, N 4. — P. 410-419.
АГРЕГАТНИЙ СТАН С60-ФУЛЕРЕНУ В РІЗНИХ СЕРЕДОВИЩАХ
І. І. Гринюк1 С. В. Прилуцька1 М. С. Слободяник1 О. Ю. Чуніхін2 О. П. Матишевська1
1Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Україна 2Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна HАH України, Київ
E-mail: [email protected]
Методом фотонної кореляційної спектроскопії оцінено розподіл за розміром, об’ємом та кількістю наночастинок немодифікованого (pristine) С60-фулерену в позбавленому хімічних дисперсантів водному середовищі, що розрізняється за сольовим та протеїновим складом. Показано, що водний колоїдний розчин містить частинки С60-фулерену діаметром від 38 до 6GG нм, при цьому значним є вміст наночастинок діаметром 43 нм. У сольовому розчині (0,9% NaCl) спостерігається утворення агломератів С60-фулерену — відсотковий вміст більших наночастинок зростає порівняно з таким у водному середовищі. Додавання альбуміну в середовище сприяє диспергуванню наночастинок С60 та запобігає їх як спонтанній, так
і NaCl-залежній агломерації. У разі внесення С60-фулерену в концентрації 10-5 М в середовище RPMI 164G, що містить 5%-ну ембріональну телячу сироватку, не спостерігається агломерації наночастинок. Одержані дані свідчать, що гомогенний стабільний водний колоїдний розчин немодифікованого С60-фулерену може бути використано для дослідження клітинної відповіді в культуральному середовищі.
Ключові слова: С60-фулерен, фотонно-кореляційна спектроскопія, альбумін, агломерація.
THE AGGREGATE STATE OF C60-FULLERENE IN VARIOUS MEDIA
1.1. Grynyuk1
S. V. Prylutska1 N. S. Slobodyanik1 O. Yu. Chunikhin2 O. P. Matyshevska1
1Taras Shevchenko National University of Kyiv, Ukraine
2Palladin Institute of Biochemistry of National Academy Sciences of Ukraine, Kyiv
E-mail: [email protected]
The distribution of pristine C60-fullerene nanoparticles by volume and number in water solution without chemical dispersants with different salt and protein composition was evaluated using the correlation spectroscopy analysis. It was shown, that water colloid solution contains C60-fullerene particles with hydrodynamic diameter from 38 to 600 nm, and the main peak position is at 43nm. In saline solution (0,9% NaCl) the particle size distribution range enlarges that may result from the C60 aggregation. Albumin introducing into the medium promotes dispersed state of C60 nanoparticles and prevents their spontaneous as well as NaCl-dependent agglomeration. No obvious aggregation was detected when C60-fullerene in concentration 10-5 M was added to RPMI medium containing 5% fetal bovine serum. The data show that stable homogenous water colloid solution of pristine C60 fullerene could be used for studding cell responses in cultural medium.
Key words: C60-fullerene, photon correlation spectroscopy, albumin, agglomeration.
