CC BY
102
Известия Тульского государственного университета Естественные науки. 2013. Вып. 1. С. 241-250
Биология
УДК 581.17; 581.19; 581.52
АФК-индуцированные процессы в клетках хТгШсоБеса1е в условиях натрий-хлоридного засоления
А. Р. Гарифзянов, Н. Н. Жуков
Аннотация. Проведено исследование МаС1-индуцированной генерации АФК (О- и И2О2) и опосредованных ими процессов пе-рекисного окисления липидов в органах х Triticosecale. Показано, что повышение в среде выращивания концентрации хлорида натрия (120 мМ) приводит к избыточной генерации супероксидного анион-радикала (в побегах до 2,8 усл. ед./г) и пероксида водорода (до 63 мкмоль/г (в побегах) и 24 мкмоль/г (в корнях)). В результате ПОЛ происходит накопление в клетках диеновых конъюгатов жирных кислот (до 1,11 мкмоль/г и 0,54 мкмоль/г в побегах и корнях соответственно) и малонового диальдегида (в побегах — до 0,72 мкмоль/г, в корнях — до 0,65 мкмоль/г). Нарушение функций мембранных структур клетки, индуцированное натрий-хлоридным засолением, количественно характеризовалось увеличением значения индекса поврежденности тканевых структур до 45% (в побегах) и 49% (в корнях).
Ключевые слова: активные формы кислорода, супероксидный анион-радикал, пероксид водорода, малоновый диальдегид, диеновые конъюгаты.
Введение
Среди важнейших природных стрессоров засоление занимает одно из ведущих мест. По оценке ФАО засоленными являются приблизительно 22% мировых земель, находящихся в сельскохозяйственном использовании. Согласно прогнозу, через 25 лет по этой причине могут стать непригодными до 30% земель сельскохозяйственного назначения.
На протяжении долгого времени адаптацию сельскохозяйственных растений к засолению рассматривали через призму регуляторных механизмов поддержания ионного и осмотического гомеостаза. Однако, как известно, повышенная концентрация КаС1 приводит к окислительному стрессу, сопряженному с избыточной генерацией активных форм кислорода (АФК). Такие высокореакционные АФК, как супероксидный анион радикал (О-) и перок-
сид водорода (Н2О2) могут вызывать пероксидацию мембранных липидов, что отражается на свойствах биологических мембран [4]. В результате пе-рекисного окисления липидов (ПОЛ) снижается количество ненасыщенных жирных кислот, что приводит к повышению вязкости мембран, переходу липидов из жидкокристаллической фазы в гель [7], увеличению ионной проницаемости, снижению электрической проводимости мембран [8] и инактивации мембранных ферментов. При длительном воздействии стрессора, ПОЛ нарушает процессы фото- и окислительного фосфорилирования, синтез АТФ в митохондриях и хлоропластах, что в конечном итоге приводит клетку к энергетическому «голоду» и гибели [6].
В соответствии с вышеизложенным, целью настоящей работы являлось исследование КаС1-индуцированной генерации АФК и опосредованных ими процессов перекисного окисления липидов в органах х ТпИсовесаЫ.
Материал и методы исследования
Объектами исследования являлись побеги и корни тритикале озимого (сорт «Дон»), семена которого были предоставлены сотрудниками ГПУ Тульский НИИСХ Россельхозакадемии. Сорт «Дон» включен в Государственный реестр селекционных достижений, допущенных к использованию с 2005 г. в Центрально-Черноземном и Северо-Кавказском регионах РФ. Семена предварительно стерилизовали в 2,5%-ном растворе КМПО4, после чего проращивали на фильтровальной бумаге в присутствии 1/10 среды Кнопа с микроэлементами по Хогланду. Десятидневные проростки пересаживали в вегетационные сосуды и выращивали в аэрируемой водной культуре на полной питательной среде. Растения выращивали при 12-часовом световом периоде, температуре воздуха 23 ± 1/15 ± 1°С (день/ночь), относительной влажности воздуха — 55/75% (день/ночь) и освещенности 35 Вт/м2. При достижении проростками фазы кущения, их пересаживали на питательный раствор, содержащий 120 мМ КаС1. Побеги и корни после 12, 24, 48, 72 и 96 часов экспозиции на растворе КаС1 фиксировали и хранили при температуре —70°С.
Определение скорости образования радикальных форм кислорода проводили по цветной реакции с адреналином в процессе окисления его до адренохрома [9]. Для этого навеску (300 мг) гомогенизировали с 10 мл дистиллированной воды. Гомогенат центрифугировали 20 мин при 4000
об./мин. По 3 мл супернатанта переносили в чистые пробирки, добавляли в одну из них 100 мкл 5,6 мМ адреналина (до конечной концентрации 0,18 мМ), в другую — 100 мкл Н2О. Затем пробирки оставляли на 30 мин при температуре 22°С и освещении в 2 клк, после чего измеряли оптическую плотность раствора с адреналином против раствора с дистиллированной водой при длине волны 480 нм. Скорость генерации супероксидного анион-радикала рассчитывали по формуле: ДБД (где ДБ — разница величин оптической плотности между гомогенатом с адреналином и
гомогенатом с водой; Ь — время инкубации, мин) и выражали в условных единицах скорости (1 усл. ед. = 10-3 опт. ед./мин).
Определение содержания пероксида водорода проводили по методу, основанному на образовании комплекса пероксида титана [10]. Для этого навеску (1 г) замороженного материала гомогенизировали с 5 мл холодного 100%-ного ацетона. Полученный гомогенат центрифугировали 20 мин при 12000 g. 1 мл полученного супернатанта смешивали с 0,1 мл 20%-ного Т1СЦ и 0,2 мл концентрированного раствора КН4ОН. В результате этого образовывался титан-пероксидный комплекс. Раствор вновь центрифугировали 20 мин при 12000 g. После центрифугирования осадок трижды промывали холодным ацетоном, чтобы удалить пигменты, а затем растворяли в 3 мл 1М ЩЯО4. Абсорбцию окрашенного в желто-оранжевый цвет комплекса измеряли спектрофотометрически при 415 нм (СФ-26). Содержание Н2О2 в растительном материале рассчитывали по калибровочной кривой, построенной для стандартных растворов пероксида водорода (0,1-1 мМ).
Определение содержания диеновых конъюгатов (ДК) — первичных продуктов ПОЛ — определяли по методу, основанному на свойствах сопряженных двойных связей, входящих в состав гидроперекисей липидов, интенсивно поглощать в УФ-области с характерным максимумом (232 нм) [5]. Для получения хлороформных липидных экстрактов 200 мг растительного материала гомогенезировали в 3 мл дистиллированной воды. Полученный гомогенат центрифугировали 20 мин при 4000 об./мин. 2 мл супернатанта помещали в стеклянный стаканчик и добавляли 4 мл метанола и 2 мл хлороформа, интенсивно перемешивали и проводили экстракцию пробы в течение 3 мин на магнитной мешалке. Затем к пробе добавляли 2 мл хлороформа и 2 мл дистиллированной воды и оставляли в холодильнике на 1-2 ч. После экстракции и расслоения пробы отбирали нижний слой (хлороформный), содержащий липиды, шприцем с длиной иглой. Затем для определения ДК 2 мл экстракта в хлороформе выпаривали и растворяли сухой остаток липидов в 3 мл смеси метанола и гексана (5:1). Пробы фотометрировали на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 232 нм против смеси метанола и гексана. Содержание ДК выражали в мкмоль/г сырой массы, используя коэффициент молярной экстинкции 2,21*105/(М*см) [4].
Определение количества соединений, взаимодействующих с тиобарбиту-ровой кислотой в пересчете на малоновый диальдегид (МДА) [11]. 0,5 г свежего растительного материала гомогенизировали с 10 мл 0,1%-ной ТХУ. После этого полученный гомогенат центрифугировали при 15000 g в течение 5 мин. К 1 мл полученного супернатанта добавляли 4 мл 0,5%-ной тиобарбитуровой кислоты в 20%-ной ТХУ. Смесь нагревали 30 мин при 95°С в термостате и быстро охлаждали в ледяной бане для остановки реакции. Полученный раствор центрифугировали при 10000 g в течение 10 мин. Измеряли величину оптической плотности полученного супернатанта на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 532 нм. Специфичность
окрашивания подтверждали измерением оптической плотности при 600 нм (максимум поглощения для других карбонильных соединений). Для расчета содержания МДА использовали коэффициент молярной экстинкции 156/(мМ*см).
Индекс поврежденности клеточных мембран определяли кондуктомет-рическим методом по электропроводности водных экстрактов из растительных тканей. Навеску свежего растительного материала (0,5 г) тщательно промывали дистиллированной и бидистиллированной водой, затем помещали на 4 часа в 10 мл бидистиллята при комнатной температуре, и измеряли электропроводность полученного раствора. По окончании измерений пробирки помещали в кипящую водяную баню на 20 мин, затем взбалтывали в течение 30 мин, после чего измерения повторяли. Электропроводность выражали в 0м-1см-1*10-4, используя значения для вычисления индекса тканевого повреждения по известной формуле [3].
Статистическая обработка результатов. Каждый опыт проводили в трех биологических по три аналитические повторности. Статистическую обработку данных осуществляли с помощью пакета прикладных компьютерных программ MS Excel 2003 и SigmaStat 3.1. В таблицах и на рисунках представлены средние арифметические значения определяемых величин и их стандартные ошибки (Р > 0,95). К полученным данным применен стандартный однофакторный дисперсионный анализ с использованием для оценки достоверности при множественном сравнении фактического значения ^-критерия Ньюмена-Кейлся.
Результаты исследования и их обсуждение
Генерация АФК является одной из неспецифических реакций растений на стрессовое воздействие, в том числе и в условиях засоления. Проведенное исследование показало, что динамика образования и накопления АФК (супероксидного анион-радикала и пероксида водорода) при выращивании тритикале на среде, содержащей 120 мМ NaCl, менялась неодинаково в корнях и побегах. На рис. 1а видно, что скорость образования O- в тканях побега увеличивалась в 3 раза за первые 12 часов экспозиции растений на солесодержащей среде, достигая значения 2,3 усл. ед./г сырой массы. Наблюдаемое увеличение скорости образования супероксидного анион-радикала можно объяснить снижением водного потенциала прикорневого раствора, что уменьшает доступность воды для растений. Нами ранее было показано [1], что для решения этой проблемы в растении включаются механизмы регуляции водного обмена и, в первую очередь, это проявляется в снижении устьичной проводимости. Уменьшение устьичной проводимости на фоне высокой скорости электронного транспорта могла приводить к накоплению восстановительных эквивалентов и, следовательно, недостатку конечного акцептора электронов (НАДФ+) в ФЭТЦ и, как следствие, - переносу электро-
нов на кислород. Около 10-25% всего нециклического электронного потока может идти на образование супероксид-радикала [12].
б' 3 4’° 1 80 1
и У Э ^ -I 7П -
0 24 48 72 96 0 24 48 72 96
время, час д время, ч
-°- побеги - о - корни * -с- побеги • ° - корни
Рис. 1. Динамика скорости образования супероксидного анион-радикала (а) и накопления пероксида водорода (б) под действием 120 мМ МаС!
(* для корней представлены значения скорости, увеличенные в 10 раз)
В следующие 12 часов засоления уровень супероксидного анион-радикала практически не менялся, после чего вплоть до 48 часов значительно снижался, достигая уровня, зафиксированного в начале эксперимента (0,7 усл. ед./г сырой массы). Снижение скорости образования О- могло быть следствием увеличения активности СОД, катализирующей реакцию дисмутации анион-радикала.
Продолжающееся засоление приводило к повторному увеличению скорости образования анион-радикала к 72 часам экспозиции в 6 раз, сменившемуся уменьшением скорости к концу эксперимента. При этом уровень О- по-прежнему оставался повышенным (2,0 усл. ед./г сырой массы) относительно начала эксперимента (0,7 усл. ед./г сырой массы). Повторное увеличение продукции супероксидного анион-радикала могло быть следствием уменьшения активности СОД в результате истощения ее пула, а также опосредовано накоплением в клетках побега токсичных ионов Ма+ и С1-после 48 часов экспозиции, что было отмечено нами ранее [1].
В тканях корня скорость образования супероксидного анион-радикала практически не менялась относительно начала эксперимента на протяжении 96 часов экспозиции растений на солесодержащей среде и достигала значения
0,1 усл. ед./г сырой массы (рис.1а).
Характер динамики накопления в корнях и побегах Н2О2 (рис.1б) также был неоднозначен. В течение первых суток засоления уровень пероксида водорода возрастал в 3 раза, достигая значения 63 мкмоль/г сырой массы, после чего снижался (оставаясь повышенным относительно начала эксперимента) в 1,5 раза вплоть до окончания экспозиции растений (96 часов) на солесодержащей среде. Увеличение образования пероксида водорода в побегах до 24 часов засоления (рис.1б) могло быть связано со спонтанной дисмутацией О- и/или благодаря действию супероксиддисмутазы. Это предположение согласуется с высокой скоростью образования супероксидного анион-радикала в течение первых суток засоления (рис.1а).
Продукты перекисного окисления липидов у тритикале под действием
120 мМ КаС1
Время экспозиции, час Побеги Корни
ДК, мкмоль/г сырой массы МДА, мкмоль/г сырой массы ДК, мкмоль/г сырой массы МДА, мкмоль/г сырой массы
0 0,32 ± 0,09 0,23 ± 0,05 0,18 ± 0,04 0,33 ± 0,03
12 0,71 ± 0,07 0,71 ± 0,09 0,47 ± 0,06 0,65 ± 0,06
24 1,11 ± 0,12 0,72 ± 0,07 0,46 ± 0,04 0,53 ± 0,06
48 0,75 ± 0,09 0,46 ± 0,04 0,48 ± 0,07 0,44 ± 0,04
72 0,84 ± 0,06 0,33 ± 0,02 0,54 ± 0,08 0,51 ± 0,04
96 0,93 ± 0,07 0,15 ± 0,04 0,28 ± 0,02 0,20 ± 0,02
В корнях количество пероксида водорода (рис.1б) повышалось в 2,5 раза на протяжении первых 12 часов засоления, достигая значения 24 мкмоль/г сырой массы. После этого уровень Н2О2 стабилизировался вплоть до 72 часов. В течение следующих суток экспозиции (до 96 часов) содержание пероксида водорода снижалось до 15 мкмоль/г сырой массы, что было в 1,5 раза больше, чем в начале эксперимента. Поддержание относительно стабильного уровня Н2О2 в корнях и снижение его количества в побегах к концу эксперимента было связано с высокой активностью аскорбатпероксидазы и каталазы, что было показано нами ранее [2].
Супероксидный анион радикал (О2) и пероксид водорода (Н2О2), образующиеся в тканях растений при солевом стрессе, могут вызывать перокси-дацию мембранных липидов. Главные эффекты ПОЛ включают окисление ненасыщенных жирных кислот мембран и взаимодействие образующихся радикалов с белковыми молекулами мембран. Усиление ПОЛ является одной из неспецифических стрессовых реакций. Показателем ранней степени пе-роксидации мембранных липидов является образование диеновых конъюгатов (ДК) жирных кислот. Проведенное исследование показало (табл.), что в побегах количество ДК возрастало в течение первых суток засоления в 3,5 раза, достигая значения 1,11 мкмоль/г сырой массы, после чего снижалось в 1,5 раза до 48 часов. Повышение количества ДК в побегах в течение первых суток экспозиции растений на солесодержащем растворе свидетельствует о липидной пероксидации клеточных мембран под влиянием АФК (суперок-сидного анион-радикала и пероксида водорода), избыточно образующихся в условиях засоления в клетках (рис. 1).
В течение следующих двух суток (вплоть до 96 часов экспозиции) происходило повторное увеличение количества ДК в 1,3 раза. К концу экспе-
римента количество ДК было в 3 раза большим в побегах по сравнению с началом эксперимента.
В корнях количество ДК возрастало в 3 раза в течение трех суток экспозиции растений в условиях засоления, достигая максимального значения (0,54 мкмоль/г сырой массы) к 72 часам. После этого уровень ДК снижался в 2 раза, оставаясь повышенным относительно начала эксперимента.
Конечным продуктом перекисного окисления липидов клеточных мембран являются минорные метаболиты, в частности, малоновый диальдегид (МДА). Проведенное исследование показало, что количество МДА, представляющего собой продукт перекисного окисления фосфолипидов мембран, в органах тритикале озимого в условиях засоления значительно изменялось. Быстрое повышение количества МДА в побегах (в 3 раза) и корнях (в 2 раза) тритикале наблюдалось в первые 12 часов засоления, что было обусловлено высокой скоростью образования и накоплением АФК (О— и Н2О2) (рис. 1), а также соответствовало результатам анализа уровня ДК (табл.).
Продолжающееся засоление приводило к изменению характера динамики содержания МДА в побегах и корнях тритикале. В частности, в побегах до 24 часов количество МДА оставалось неизменным, после чего снижалось, и к 96 часам становилось ниже, чем в начале эксперимента в 1,5 раза. В то же время, содержание диальдегида в корнях после 12 часам засоления уменьшалось вплоть до 48 часов, после чего вновь возрастало к 72 часам. К концу эксперимента (96 часов) уровень МДА в корнях был также ниже начального в 1,3 раза и составлял 0,20 мкмоль/г сырой массы (табл.).
Интегральным показателем поврежденности клеточных мембран в условиях стресса можно считать индекс тканевого повреждения (ИТП), рассчитанный нами на основании выхода электролитов из клетки (рис.2).
Рис. 2. Динамика индекса тканевого повреждения под действием 120 мМ
ИТП в побегах особенно значительно возрастал на протяжении первых суток засоления (в 3 раза до 43%), что согласуется с вышеприведенными результатами (рис. 1, табл.). После этого индекс поврежденности тканей побега стабилизировался вплоть до конца эксперимента, оставаясь повышенным относительно его начала. Характер динамики ИТП в корнях несколько отличался от такового в побегах. В частности, на протяжении трех суток экспозиции растений на солесодержащей среде, наблюдалось постепенное увеличение данного параметра в 3 раза, достигшего к 72 часам величины 49%. После этого ИТП не менялся вплоть до окончания эксперимента.
Заключение
Таким образом, проведенное исследование показало, что повышение в среде выращивания концентрации хлорида натрия способствует развитию окислительного стресса, сопряженного с избыточной генерацией АФК (су-пероксидного анион-радикала и пероксида водорода), образование которых в различных процессах, протекающих в клетках, ведет к липидной пероксида-ции мембран. В результате ПОЛ происходит накопление в клетках диеновых (триеновых) конъюгатов жирных кислот, а конечными продуктами перокси-дации являются минорные метаболиты, в частности, малоновый диальдегид. Образование в результате ПОЛ гидрофильных продуктов окисления изменяет структуру липидного бислоя мембран в гидрофобных участках, создает условия для пассивного транспорта ионов и метаболитов и тем самым в известной степени (в зависимости от интенсивности окислительного процесса) нарушает координацию и специфичность мембранных процессов, что негативно сказывается на функционировании различных метаболических физиолого-биохимических путей, лежащих в основе жизнеобеспечения клеток. Кроме того, появление продуктов ПОЛ, как и увеличение содержания АФК в клетках, может быть одним из сигналов тревоги, участвующим в запуске адаптивных реакций.
Список литературы
1. Аккумуляция осмолитов в органах хТтШсовесаЬ в условиях солевого стресса / А.Р. Гарифзянов [и др.] // Современная наука: тенденции развития: матер. международной научно-практической конф. (г. Краснодар, 24 января 2012 г.). — Краснодар: Научно-издательский центр АПРИОРИ, 2012. С.195-198.
2. Особенности МаС1-индуцированного окислительного стресса и динамики активности антиоксидантных ферментов в органах тритикале озимого / А.Р. Гарифзянов [и др.] // Доклады РАСХН. 2012. №2. С.9-11.
3. Гришенкова Н.Н., Лукаткин А.С. Определение устойчивости растительных тканей к абиотическим стрессам с использование кондуктометрического метода // Поволжский экологический журнал. 2005. №1. С.3-11.
4. Введение гена desA Д12-ацил-липидной десатуразы цианобактерий повышает устойчивость растений картофеля к окислительному стрессу, вызванному гипотермией / И.Н. Демин [и др.] // Физиология растений. 2008. Т.55. С.710-720.
5. Кейтс М. Техника липидологии. М.: Мир, 1975. 324 с.
6. Кошкин Е.И. Физиология устойчивости сельскохозяйственных культур. М.: Дрофа, 2010. С.328-335.
7. Лось Д.А. Молекулярные механизмы холодоустойчивости растений // Вестник РАН. 2005. Т.75. С.338-345.
8. Особенности окислительного стресса растений табака, трансформированных геном desC Д9-ацил-липидной десатуразы из Synechococcus vulcanus , при гипотермии / В.Н. Попов [и др.] // Физиология растений. 2006. Т.53. С.525-529.
9. Пероксидаза клеточной поверхности — генератор супероксид-аниона в корневых клетках пшеницы при раневом стрессе / А.В. Часов [и др.] // Цитология. 2002. Т.44. С.691-696.
10. Heath R.L., Packer L. Photoperoxidation in isolated chloroplasts. I. Kinetics and stoichiometry of fatty acid peroxidation // Arch. Biochem. Biophys. 1968a. V.125(1). P.189-198.
11. Kumar G.N., Knowles N.R. Changes in Lipid Peroxidation and Lipolytic and Free-Radical Scavenging Enzyme during Aging and Sprouting of Potato (Solanum tuberosum L.) Seed-Tubers // Plant Physiol. 1993. V.102. P.115-124.
12. Mitteler R. Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance // Trends in Plant Science. 2002. V.7(9). P.405-410.
Гарифзянов Андрей Рузильевич (Garifzyanov86@yandex.ru), кандидат биологических наук, доцент, кафедра органической и биологической химии, Тульский государственный педагогический университет им. Л.Н. Толстого.
Жуков Николай Николаевич (z.nikolay87@mail.ru), аспирант, кафедра ботаники и технологии растениеводства, Тульский государственный педагогический университет им. Л.Н. Толстого.
ROS-induced processes in the cells of xTriticosecale in NaCl-salinity
A.R. Garifzyanov, N.N. Zhukov
Abstract. The study of NaCl-induced generation of ROS (O- and H2O2) and indirect of lipid peroxidation in the organs x Triticosecale. Shown that the increase in growth medium sodium chloride concentration (120 mM) leads to the generation of excess superoxide anion radical (in the shoots to 2.8 conv. units/g) and hydrogen peroxide (up to 63 ^mol/g (shoots) and 24 ^mol/g (roots)). As a result of lipid accumulation in the cells of conjugated diene fatty acids (up to 1.11 ^mol/g and 0.54 ^mol/g in the shoots and roots, respectively) and malondialdehyde (in shoots — up to 0.72 ^mol/g, in the roots — to 0.65
^mol/g). Disruption of the cell membrane structure induced by sodium chloride salinity, quantitatively characterized by an increase in the index of damage tissue structures to 45% (shoots) and 49% (roots).
Keywords: reactive oxygen species, superoxide anion radical, hydrogen peroxide, malondialdehyde, diene conjugates.
Garifzjanov Audrey (Garifzyanov86@yandex.ru), candidate of biological sciences, associated professor, department of organic and biological chemistry, Leo Tolstoy Tula State Pedagogical University.
Zhukov Nikolay (z.nikolay87@mail.ru), postgraduate student, department of botany and technology of crop production, Leo Tolstoy Tula State Pedagogical University.
Поступила 25.12.2012
