CC BY
141
Химия растительного сырья. 2002. № 1. C. 69-80.
УДК 547.913:543.544.45
АДАПТОГЕННЫЙ ЭФФЕКТ ЭКДИСТЕРОИДСОДЕРЖАЩЕЙ ФРАКЦИИ SERRATULA CORONATA L.
© Л.Д. Пчеленко*, Л.Г. Метелкина, С.О. Володина
Институт биологии Коми Научного центра УрО РАН,
ул. Коммунистическая, 28, Сыктывкар, 167610 (Россия) e-mail: volodin@ib.komisc.ru
Методами биологического тестирования проведена оценка адаптогенных свойств экдистероидсодержащей фракции серпухи венценосной (Serratula coronata L.) (основной экдистероид -20-гидроксиэкдизон). При пероральном введении у двух групп лабораторных мышей-самцов: белых беспородных и линейных СВА. Установлена высокая биологическая активность препарата, выражающаяся в усилении физической работоспособности на 63-107% и уменьшении времени ориентировочно-исследовательского рефлекса на 40%. По величине адаптогенного тонизирующего эффекта экдистероидная фракция из надземной части серпухи венценосной аналогична действию препарата «Экдистен», содержащего 20Е из корневищ левзеи сафлоровидной (Rhaponticum carthamoides (Willd.) Iljin).
Введение
С древнейших времен человечество неустанно занимается целенаправленным поиском природных адаптогенов, способных усиливать собственный биологический потенциал организма. Растительные адаптогены - биологически активные вещества (БАВ), которые в отличие от синтетических препаратов обладают относительно небольшим анаболическим действием и при этом в значительной степени восстанавливают и повышают работоспособность при умственном и физическом переутомлении. Поиск целебных растительных средств, обладающих адаптогенными свойствами, идет двумя параллельными потоками: силами народной медицины и силами науки. Несмотря на существующие разногласия в подходах усилия обоих направлений начинают сближаться, взаимно обогащая и дополняя друг друга. Тем не менее принципиальная разница в подходах существует. Сторонники традиционного целительского подхода утверждают, что целебные свойства растения проявляются только при суммарном, комплексном действии всех компонентов, т.е. в смеси составляющих веществ (в виде экстрактов, настоев, отваров), а любые попытки выделить отдельно действующее активное вещество приводят к нарушению тонкого баланса в комплексном характере лечебного действия растения. Научный подход требует строгой химической идентификации каждого вещества из смеси, выявления специфической физиологической активности этого вещества и всесторонней фармакологической экспертизы его эффекта. При этом любые выделяемые из растений БАВ, заявляемые как лекарственные средства, согласно существующему порядку регистрации лекарственных средств в Фармкомитете РФ, должны соответствовать международным нормам безопасности и эффективности. Для новых лекарственных растений требуется соблюдение определенных правил по доклиническому определению безопасности и экспериментальной оценки специфической эффективности выделенных из них веществ, определение количественных и качественных характеристик заявляемого биологического эффекта,
Автор, с которым следует вести переписку.
испытания вещества на острую и хроническую токсичность, установление минимально действующей и предельной дозы, выявление побочных эффектов, онкогенности, аллергогенности, т.е. проведение предварительного биологического тестирования вещества на стадии доклинических испытаний.
Проведенный в Институте биологии Коми НЦ УрО РАН массовый скрининг растений европейского Северо-Востока России показал, что фармакологически перспективным и промышленно значимым растительным сырьем для выделения адаптогенов из класса фитоэкдистероидов может служить серпуха венценосная (Serratula coronata L.), пока не рассматриваемая как лекарственное растение [1]. Было установлено, что в наземных органах серпухи венценосной содержание фитоэкдистероидов, в частности, 20-гидроксиэкдизона (20Е), на порядок выше, чем в известном лекарственном растении - левзее сафлоровидной. Левзея (или маралий корень) традиционно считается одним из самых сильных природных адаптогенов. Из подземных органов левзеи в Институте химии растительных веществ АН УзССР был выделена субстанция, содержащая 20Е, на основе которой разработан препарат «Экдистен», обладающий специфическими адаптогенными свойствами. Этот препарат был зарегистрирован в 1988 г. в качестве лекарственного тонизирующего средства [2]. Доклинические испытания препарата на экспериментальных животных показали, что экдистен у белых мышей повышал динамическую работоспособность (бег) на 62% и замедлял развитие утомления в тесте плавания, увеличивая на 25% время плавания. У крыс экдистен укорачивал на 25% время выработки условно-оборонительного рефлекса. Клинические испытания препарата подтвердили его высокий тонизирующий эффект и у людей
[3].
В Институте биологии Коми НЦ УрО РАН разработана технология получения экдистероидсодержащей субстанции (Es) из надземной части серпухи венценосной (Serratula coronata L)
[4]. Полученная субстанция представляет собой смесь экдистероидов, основным компонентом которой является 20-гидроксиэкдизон (75%), а также инокостерон (11%) и экдизон (5%). Целью настоящей работы является изучение адаптогенного действия субстанции Es в сравнении с действием известного тонизирующего препарата «Экдистен».
Экспериментальная часть
Испытания проведены в зимне-весенний период 2001 г. на половозрелых лабораторных мышах -самцах: белых беспородных (масса 25,3±3,8 г) и линейных СВА (масса 18,7±2,6 г). Всего исследовано 103 животных двух возрастов: взрослые (6 мес.) и молодые (2,5 мес.). Мыши содержались в индивидуальных клетках на стандартном рационе питания, в одинаковых условиях вивария (20оС). Все животные прошли предварительный отбор по массе тела, выносливости (удержание веса тела на шесте) и способности к плаванию. Исследуемая фракция Es в виде водного раствора (из расчета 0,2 мл на 20 г массы тела) вводилось мышам per os в дозах 1 мг/кг и 10 мг/кг в течение 5 и 10-ти дней. Контрольные животные содержались в таких же условиях в те же сроки и получали per os дистиллированную воду. Масса каждого животного измерялась ежедневно, соответственно ей корректировался вводимый объем раствора.
У всех животных проводились контрольные и опытные замеры параметров силы, выносливости и тепловыделения при функциональных динамической и статической физических нагрузках (оценка эрготропного эффекта), тестирование высшей нервной деятельности животных (оценка психотропного эффекта), а также анализ крови на резистентность эритроцитов к кислотному гемолизу. Повторно были исследованы физические параметры на выносливость у животных, проявивших высокую степень чувствительности к Es. Эти испытания проводили через семь дней после прекращения дачи препарата (эффект последействия). Для оценки стрессового воздействия исследованы также интактные животные, не получавшие ни плацебо, ни Es.
Физическую работоспособность (тесты на эрготропный эффект) оценивали методами хронометрии, эргометрии и прямой калориметрии при выполнении животными максимально возможной динамической и стандартной статической работы.
Динамическая нагрузка оценивалась по времени выносливости в стандартном тесте плавания до полного утомления (плавание «до отказа») при температуре воды 30°С [5]. Все животные проходили процедуру плавания дважды: до введения Es и после введения его конечной дозы. По величине индивидуального прироста времени плавания после приема Es оценивали чувствительность каждого животного к препарату. Критерием наступления полного утомления в тесте плавания служило полное погружение головы животного под воду в течение 5 сек. После повторного плавания до полного утомления осуществляли забор крови, для чего животное быстро извлекали сачком, усыпляли хлороформом и подвергали декапитации. Кровь собирали в пробирку с гепарином и измеряли время кислотного гемолиза.
Статическую нагрузку оценивали за день до плавания: а) по максимальному весу груза, который животное может поднять передними лапками и б) по времени виса (спинкой вниз) на шесте. Время виса и масса тела учитывались также и при формировании равноценных исходных групп животных в подготовительный период.
Тепловыделение (Q) измеряли путем прямой калориметрии в покое и после выполнения животным стандартной физической нагрузки, которая равнялась вису на шесте в течение одной минуты. Теплосъем производили с поверхности брюшной стенки животного с помощью дифференциального радиометра, соединенного с входом усилителя постоянного тока и самописцем. Запись термограмм производилась за стандартный временной интервал (одна минута) при чувствительности тепловых измерений 0,1оС/мм [6]. В дальнейшем по термограммам рассчитывалась скорость тепловыделения с поверхности тела животного по формуле р=шхСхДТ/мин, где C - теплоемкость тела, равная 0,83калхград-1г-1. Тепловые измерения проводились при комфортной температуре в помещении (23оС), что исключало компенсаторный термогенез [7].
Психическую работоспособность животных оценивали по скорости нахождения ими выхода из двойного Т-образного лабиринта [8]. У каждого животного измерялось время пробега лабиринта в двух направлениях: вперед (по часовой стрелке) и назад (против часовой стрелки). При этом время первичного пробега вперед считали показателем скорости ориентировочно-исследовательской реакции, а время последующего пробега того же пути назад оценивали как показатель кратковременной памяти. Все замеры проводились дважды: в первый и пятый день испытаний, что исключало возможность обучения животных.
Резистентность мембран эритроцитов определяли по методике кислотных эритрограмм [9] в нашей модификации. Суспензию эритроцитов готовили на физиологическом растворе, доводили ее до стандартной оптической плотности 0,700 и делили на две части. Одна служила контролем, во вторую до внесения гемолитика добавляли Es в объеме 0,05 мл и инкубировали 10 мин при 25°С (проба in vitro). Затем к 1,5 мл суспензии эритроцитов добавляли 1,5 мл 0,0002н раствора соляной кислоты. Измерения проводили с помощью фотоэлектроколориметра МКМФ-1 при длине волны 610 нм с интервалом 30 с. На основе полученных данных строились эритрограммы и анализировались основные параметры кислотного гемолиза: время гемолиза (Тгемол), время полураспада эритроцитов (Т50), время достижения максимума гемолиза (Тмакс), максимум гемолиза (%).
Статистической обработке подвергались результаты индивидуальных парных сравнений физиологических параметров до и после воздействия Es. Оценка значимости различий проводилась с использованием t-критерия Стьюдента.
Результаты работы
Проведенные исследования физиологической активности субстанции Еб, выделенной из серпухи венценосной, показали высокий уровень эрготропного и психотропного эффекта этой субстанции, сходный по степени повышения работоспособности с действием, указанным для препарата «Экдистен», выделенного из левзеи сафлоровидной [2].
1. Влияние субстанции Ев на параметры физической работоспособности
Анализ полученных результатов обнаружил тесную зависимость между дозой вводимого Еб и усилением физической работоспособности (эрготропный эффект) при статической и, в особенности, при динамической нагрузке у мышей обеих исследованных групп (рис. 1 и 2). Для сравнения эффективности действия Еб в исследованных группах животных исходный уровень тестируемых реакций, измеряемый до введения препарата, принимался равным единице. Прирост физиологического параметра определяли у каждого испытуемого животного попарным нормированием как отношение «опыт/контроль» с последующей статистической обработкой. Попарное нормирование результатов измерений физиологических ответов в биологических тестах позволяло значительно сгладить размах индивидуальных колебаний чувствительности животных к Еб.
Было найдено, что динамика развития дозового эффекта у линейных и беспородных мышей неодинакова. Как видно из рисунка 1, у белых мышей эрготропный эффект Еб, выражающийся в повышении выносливости к динамической нагрузке (плавание), хорошо проявляется начиная с суммарной дозы 10 мг/кг. В дальнейшем при увеличении дозы до 100 мг/кг выносливость продолжает монотонно нарастать, так что в целом зависимость «доза-эффект» имеет линейный характер. Выносливость к статической нагрузке (вис на шесте) также линейно нарастает по мере увеличения вводимой дозы Еб, но в значительно меньшей степени. У мышей СВА эрготропный эффект Еб проявляется очень сильно, но зависимость «доза - эффект» не имеет строго линейного характера (рис. 2). Разница в характере дозовой реакции, вероятно, может быть связана с видовыми отличиями лабораторных животных. Обнаружены большие различия в индивидуальной чувствительности к адаптогенному действию Еб у отдельных особей. Результаты испытаний эрготропного эффекта Еб у линейных и беспородных мышей в отдельных опытах, приведенные на рисунка 3, позволяют сравнить эффективность действия препарата внутри исследованных групп животных. В целом проведенные измерения показали, что линейные мыши СВА исходно менее выносливы к нагрузке плаванием, чем белые беспородные мыши. В контроле линейные мыши СВА плавали до полного утомления в среднем в течение 71 мин, а белые беспородные мыши были вдвое выносливее и плавали до полного утомления 138 мин.
Ё 2 &
Я 1
1%—— ▲
9— & —В—
) 1 2 3 4 5 6
-&
-&
доза 20Е
доза Ев
-плавание
-вес груза
-масса тела
- плавание
-вис —в—масса тела
Рис. 1. Доза-зависимый эффект 20Е у белых беспородных мышей. По оси Х - суммарная доза 20Е:
1 - до введения; 2 - 10 мг/кг; 3 - 50 мг/кг; 4 - 100 мг/кг; 5 - через семь дней после введения 100 мг/кг. По оси У - эффект «опыт/контроль»
Рис. 2. Доза-зависимый эффект Е8 у линейных мышей СВА. По оси Х - суммарная доза Е8: 1 - до введения; 2 -10 мг/кг; 3 - 50 мг/кг; 4 - 100 мг/кг; 5 - через семь дней после введения 100 мг/кг. По оси У - эффект «опыт/контроль»
3
о
Рис. 3. Влияние 20Е на продолжительность плавания у белых беспородных мышей (А) и линейных мышей СВА (Б). По оси X - номер животного в измерениях «опыт/контроль». По оси У - время плавания (мин)
После введения животным Еб наблюдался однозначно высокий прирост времени плавания в обеих группах мышей, а выносливость к экстремальной физической нагрузке возросла в опытных группах животных в 80% случаев. Другими словами, из 10-ти животных 8 обнаруживали чувствительность к Еб, а двое были нечувствительны к действию препарата. Однако линейные мыши СВА проявили большую чувствительность к эрготропному действию Еб, чем беспородные мыши. Наиболее информативным оказался динамический показатель работоспособности - время максимального плавания, которое после введения суммарной дозы 10 мг/кг у белых мышей повышался в среднем на 63%, а у мышей СВА до 107%. Статическая работоспособность под влиянием Еб повышалась в меньшей степени (на 42%) у обеих групп мышей и также имела дозовую зависимость. Практически, все взрослые белые мыши после 10дневного получения Еб однозначно реагировали повышением динамической выносливости, хотя индекс прироста времени плавания у разных животных колебался от 14 до 290%. У линейных мышей СВА в отдельных случаях выносливость к утомлению повышалась после приема Еб до 400% к уровню контроля. В целом чувствительность к эрготропному действию Еб у молодых и взрослых мышей
примерно одинакова, это выражалось в повышении выносливости и к максимальной динамической, и к статической нагрузке, а разница в ответах, по-видимому, имела не возрастной, а индивидуальный характер. Отчетливое повышение выносливости к физической нагрузке обнаруживалось у животных уже после введения пяти доз Es. Результаты парных измерений параметров физической и психической работоспособности, полученные до и после введения Es в дозе 10 мг/кг в течение пяти дней у молодых беспородных белых мышей, приведены в таблице 1.
Контрольная группа животных, получавшая в те же временные сроки дистиллированную воду per os, не обнаружила статистически значимых изменений исследуемых параметров. Наблюдались лишь незначительные изменения исследуемых параметров, отражающие, очевидно, вклад стрессового фактора, связанного с процедурой тестирования. Все параметры физической работоспособности в контрольной группе достоверно ниже, чем у животных, получавших Es (р<0,05).
В работе не обнаружено статистически значимого прироста массы тела ни у молодых, ни у взрослых животных обеих групп, хотя масса тела у молодых животных возрастала в большей степени. У мышей, получавших Es в дозе 10 мг/кг в течение пяти дней, масса тела возросла лишь на 0,6 г, что не отличалось от группы плацебо. При отсутствии выраженного анаболического действия наблюдался высокий и устойчивый эрготропный эффект Es, который развивался уже через пять дней приема препарата. Этот эрготропный эффект Es сохранялся в течение семи дней и после прекращения дачи препарата. Кажется вероятным, что развитие эрготропного действия Es и его анаболический эффект развиваются независимо друг от друга, по крайней мере при кратковременном применении препарата. У всех исследованных животных после приема пяти доз Es по 10 мг/кг уже визуально наблюдалось отчетливое повышение двигательной активности, а также укорочение времени решения исследовательской задачи (поиск выхода из лабиринта), что указывает на достижение положительного тонизирующего эффекта вследствие приема животными Es, стимулирующего энергетику у лабораторных мышей после поступления в организм вещества в суммарной концентрации 50 мг/кг.
Анализ полученных результатов показывает, что при минимальной суммарной дозе 10 мг/кг энергетика и выносливость к экстремальным нагрузкам достоверно усиливаются, а конечная доза 50 мг/кг может расцениваться, по-видимому, как уровень достижения устойчивого адаптогенного эффекта.
Подтверждением устойчивости наблюдаемого усиления работоспособности у животных служит тот факт, что тонизирующее действие Es сохранялось у мышей и спустя семь дней после прекращения дачи препарата - эффект последействия (рис. 4). Эффект последействия у мышей СВА выражен в большей степени, чем у белых беспородных мышей (р<0,05), что еще раз подтверждает большую чувствительность к Es у линейных животных по сравнению с беспородными мышами.
Таблица 1. Параметры физической и психической работоспособности у белых мышей до и после получения Еб в дозе 10 мг/кг в течение пяти дней
№ п/п Плавание (мин) Подъем груза (г) Пробег лабиринта вперед (мин) Пробег лабиринта назад (мин) Масса тела (г)
до Es после Es до Es после Es до Es после Es до Es после Es до Es после Es
1 46 98 49 63 78 25 100 16 17,2 18,1
2 122 165 51 69 73 98 80 23 25,3 25,8
3 32 155 55 73 54 80 61 14 24,8 26,9
4 160 175 65 67 23 36 33 18 21,8 22,8
5 110 185 65 55 35 40 24 25 23 22,4
6 150 360 45 57 22 15 35 15 20,9 21,2
7 120 125 65 65 33 47 42 40 24,5 24,6
8 121 142 59 75 72 32 38 25 24,1 25,3
9 105 177 65 75 34 43 24 18 22,5 23,5
10 93 140 65 63 32 14 40 11 23,5 23,2
11 82 130 45 69 44 32 28 22 18.3 19.7
Хср 103,7+37,3 168,4+65,4* 57,2+8,1 66,5+6,4* 45,5+19,6 51,1+26,4 41,1+13,2 20,6+7,5* 22,4+2,5 23,0+2,5
Примечания: возраст животных - 2,5 месяца; * - p < 0,05.
Развитие и сохранение эрготропного действия Еб не сопровождалось нарушением системы терморегуляции и не давало пирогенного осложнения. Более того, наблюдалась минимизация
тепловыделения при выполнении тестовой стандартной нагрузки, что, по-видимому, отражает
адаптивный приспособительный эффект под влиянием Еб (рис. 5). В таблице 2 приведены результаты прямых термометрических измерений тепловыделения у животных до и после приема Еб в состоянии покоя и при выполнении стандартной физической нагрузки. Измерения тепловыделения с поверхности тел у животных обеих групп показали сходные результаты: Еб не вызывал повышенного тепловыделения в состоянии покоя ни у беспородных, ни и у линейных мышей, при этом скорость тепловыделения в покое у мышей обеих групп составила 0,02 кал/минхг-1. Тепловыделение при выполнении тестовой физической нагрузки обнаружило устойчивую тенденцию к снижению. Как видно из результатов, представленных в таблице 2, при выполнении стандартной физической нагрузки скорость тепловыделения у белых мышей в контроле возрастала по сравнению с тепловыделением в покое на 30% и составляла 0,026 мкал/минхг-1. После получения пяти доз Еб (по 10 мг/кг ежедневно) скорость тепловыделения при тестовой физической нагрузке возрастала только на 20% и составила
0,024 кал/минхг-1 (р < 0,05). Так же, как и в случае с измерением выносливости в тесте плавания,
отмечена значительная индивидуальная и межвидовая изменчивость у исследованных животных. В целом исходное тепловыделение покоя и тепловыделение при физической нагрузке у мышей линии СВА несколько выше, чем у беспородных мышей, что коррелирует у них с большей реакцией на введение Е.
Последействие Ез (1 мг/ кг,10 доз) у мышей СВА
Последействие Еэ (10 мг/кг, 10 доз) у белых мышей
■&
-масса —■—плавание
■ масса тела
плавание
Рис. 4. Сохранение эрготропного эффекта Еє через семь дней после окончания введения препарата у линейных мышей СВА (А) и белых беспородных мышей (Б). По оси X - номер животного. По оси У -эффект «опыт/контроль»
А
Тепловыделение у белых мышей в контроле
0,03 -
I
-I 0,02 -
I 0,01 -
О
0
0 1 2 3 4 5 6
—*—покой —я—нагрузка
Б
Тепловыделение у белых мышей после введения Ев
(пять доз, 10 мг/кг)
покой —■— нагрузка
Рис. 5. Тепловыделение у белых беспородных мышей (возраст 2,5 мес) в покое и после выполнения стандартной физической нагрузки: А - контроль, Б - опыт. По оси X - номер животного; по оси У -теплоотдача с поверхности брюшной стенки
Таблица 2. Параметры тепловыделения у белых мышей до и после получения Еб в дозе 10 мг/кг в течение пяти дней
№ п.п. Тепловыделение до введения Еб Q1 (кал/минхг -1) Тепловыделение после введения Еб Q2 (кал/минхг -1)
в покое после нагрузки в покое после нагрузки
1 0,013 0,002 0,017 0,023
2 0,02 0,023 0,021 0,025
3 0,02 0,023 0,018 0,015
4 0,011 0,023 0,022 0,029
5 0,029 0,029 0,021 0,026
6 0,020 0,024 0,024 0,024
7 0,017 0,029 0,016 0,023
8 0,019 0,029 0,018 0,023
9 0,029 0,026 0,028 0,026
10 0,018 0,028 0,018 0,020
11 0,023 0,027 0,020 0,034
Х 0,020 ± 0,005 0,026 ± 0,003 * 0,020 ± 0,003 * 0,024 ± 0,005 *
Примечания: * - р < 0,05
Чтобы определить стрессовую составляющую процедуры эксперимента и оценить собственный эрготропный эффект Еб, были проведены контрольные измерения тепловыделения у интактных мышей. С учетом поправки на эндогенную стрессовую активацию биоэнергетических механизмов организма животных были внесены поправки в окончательную оценку величин эрготропного эффекта Еб, выделенного из серпухи венценосной.
Сопоставление результатов относительного прироста всех исследованных эргонометрических параметров, тепловыделения и массы тела у обеих групп мышей до и после воздействия на животных Еб в дозе 10 мг/кг показало, что наибольшим адаптивным изменениям подвергается выносливость (время плавания), а наименьшим - масса тела (рис. 6). Несмотря на некоторые различия в ответах, в целом характер адаптогенного усиления исследованных параметров одинаков и у беспородных, и у линейных мышей. Причем высокий тонизирующий эффект Еб развивается на фоне слабовыраженного анаболического действия препарата при его кратковременном употреблении в течение 5-10-ти дней.
Эрготропный эффект Ев у белых мышей 1
Ц эффект усиления Ев
□ исходный уровень параметров
Эрготропный эффект Ев у линейных мышей СВА 1
|эффект усиления Ев
□ исходный уровень параметров
3
3
Рис. 6. Влияние Еб (10 мг/кг, 10 доз) на параметры физической работоспособности у беспородных мышей (А) и линейных мышей (Б). Значение осей (прирост в % к исходному уровню): 1- масса тела; 2 - время виса; 3 - вес поднимаемого груза; 4 - время плавания; 5 - тепло покоя; 6 - тепло нагрузки в контроле; 7 -тепло нагрузки после Еб
2. Влияние субстанции Ев на параметры психической работоспособности мышей
Несмотря на имеющиеся возрастные и индивидуальные различия в чувствительности исследованных животных к адаптогенному действию Es, общий положительный тонизирующий характер действия испытуемого вещества на ЦНС у обеих групп мышей одинаков. Обнаружено хорошо выраженное положительное психотропное влияние препарата в исследованных конечных дозах 10, 50 и 100 мг/кг, оказывающих высокое тонизирующее влияния на скорость ориентировочноисследовательской реакции и кратковременную память у исследованных животных. Повышение тонуса центральной нервной системы развивалось одновременно с возрастанием параметров физической работоспособности, что особенно хорошо проявилось у белых беспородных мышей. Под влиянием Es (начиная с дозы 50 мг/кг) молодые животные легче запоминали правильный маршрут и быстрее находили выход из Т-образного лабиринта при пробеге назад, чем в контроле (табл. 1). Если до приема Es у молодых белых мышей время первичного пробега лабиринта вперед составляло в среднем 45 сек, а время пробега назад, принятое за показатель кратковременной памяти, практически не изменялось, то после получения Es в конечной дозе 50 мг/кг время обратного пробега уменьшалось в 2 раза и составило в среднем 21 сек. У взрослых белых мышей после приема 100 мг/кг Es наблюдали еще более сильный потенцирующий эффект Es, проявляющийся в ускорении и первичного пробега, и обратного пробега лабиринта. Eсли исходно время пробега лабиринта вперед взрослыми мышами составляло в среднем 73 сек, то после 100 мг/кг Es эта величина сократилась на 40% и составляла уже 42 сек, а время пробега в обратном направлении сократилось до 28 сек (р<0,05). На рисунке 7 даны сравнительные диаграммы времени нахождения выхода из лабиринта у животных, показывающие степень тонизирующего влияния Es при решении поисковой задачи в обеих группах мышей. Положительное психотропное действие Es было наиболее выражено у молодых белых мышей и слабо выражено у мышей СВА. Линейные мыши СВА исходно уступали белым беспородным мышам по быстроте решения поисковой задачи: время первичного пробега лабиринта у мышей СВА составляло 91 сек и не изменялось после приема Es. Однако пробег в обратном направлении (память) после получения суммарной дозы Es 100 мг/кг значимо уменьшился до 49,3 сек, что говорит о положительном влиянии Es на запоминание у мышей СВА, хотя и в значительно меньшей степени, чем у белых мышей.
3. Влияние субстанции Ев на резистентность эритроцитов к кислотному гемолизу
Обнаружено, что чувствительность к кислотному гемолизу эритроцитов линейных и беспородных мышей после достижения животными полного утомления в тесте плавания неодинакова. Параметры кислотного гемолиза эритроцитов мышей обеих групп представлены в таблице 3. Как видно из таблицы, для мышей линии СВА самый длительный по времени гемолиз наблюдается у интактных животных. У всех животных, получавших Es, обнаружено укорочение времени гемолиза после плавания, причем наибольшее - при конечной дозе Es 10 мг/кг. Укорочение времени гемолиза указывает на снижение резистентности эритроцитов после экстремальной физической нагрузки и, по-видимому, является результатом жесткой стресс-реакции, какой является плавание «до отказа». В контрольной группе мышей обеих групп, получавших per os воду, после тестовой нагрузки плаванием резистентность эритроцитов оказалась самой высокой, что, возможно, связано с меньшим по времени действием стрессового фактора. Для того чтобы определить, имеет ли место собственный эффект влияния Es на резистентность мембраны эритроцитов, были проведены дополнительные исследования на интактных животных. Получено, что Es, добавленный к крови in vitro, повышал резистентность мембраны эритроцитов у белых интактных мышей на 33,6% и почти не влиял на эритроциты мышей линии СВА. Исходя из этих результатов можно предположить, что для мембраны эритроцитов протекторный эффект Es в условиях сильного стрессового воздействия мог нивелироваться и поэтому не обнаруживался явно. Тем не менее тенденция к повышению резистентности мембраны эритроцитов у мышей линии СВА под влиянием Es, добавленного in vitro, найденная у животных после плавания, может говорить о большей чувствительности клеток крови линейных животных, что согласуется с результатами, полученными по другим физиологическим параметрам.
Психотропный эффект Еб у белых мышей 1
Психотропный эффект Еб у мышей СВА
1OO
□ пробег лабиринта без Еб
■ пробег лабиринта после пяти доз Еб
1
1OO
□ пробег лабиринта без Еб
■ пробег лабиринта после 10 доз Еб
Рис. 7. Время пробега по Т-образному лабиринту до и после действия Еб у линейных мышей (А) и беспородных мышей (Б). Значения осей (прирост в % к исходному уровню): 1 - полный пробег лабиринта (вперед-назад); 2 - пробег вперед; 3 - пробег назад
з
2
з
2
Таблица 3. Параметры кислотного гемолиза эритроцитов у мышей
Группы животных Условия опыта Параметры гемолиза
Тгемол5 мин Т50, мин Тмакс; мин | макс., %
интактные А 9,50±0,15* 2,43±0,13* 2,00±0,00 2В,40±3,бВ*
(n=7) В 9,29±0,24 2,57±0,17 2,00±0,00 22,37±3,00
Н2О А В,20±0,9б* 2,10±0,10 20,5±0,09 35,79±3,73*
Мыши (n=l0) В 7,10±1,бВ 1,90±0,10 1,90±0,10 3б,12±4,07
линии СВА Es А 2,б3±0,31* 2,00±0,00* 2,00±0,00 57,90±3,7В*
(n=4) 10 мг В 4,00±0,74 2,00±0,00 2,13±0,00 58,83±5,45
Es А 7,б7±1,10* 2,39±0,20 2,00±0,0В 3В,14±б,22*
(n=9) 100 мг В 7,94±0,97 2,33±0,22 1,В3±0,22 30,32±4,34
интактные А 5,95±1,12* 1,95±0,05* 1,95±0,05 5б,1В±4,б9*
(n=l0) В 7,95±1,05 2,05±0,14 1,90±0,07 45,52±4,б4
Н2О А 9,07±0,34* 2,3б±0,30 1,93±0,13 31,53±4,35*
Белые беспородные мыши (n=7) В 8,58±0,35 2,17±0,2В 1,75±0,11 32,53±б,35
Es А 4,33±2,2б* 1,35±0,б0* 1,01±0,50 1б,11±7,52*
(n=l0)10 мг В 4,00±2,02 1,24±0,59 0,92±0,45 1В,55±7,03
Es А 7,90±0,21* 2,25±0,17 2,00±0,00 27,43±52,В0
(n=l0)50 мг В 7,б0±0,27 2,20±0,13 1,85±0,08 2В,33±2,74
Es А 7,33±0,59* 2,42±0,33 1,В3±0,17 2б,42±2,12
(п=6)100 мг В б,17±0,ВВ 2,33±0,17 1,б7±0,17 2В,В0±б,53
Примечание: А - исходно; В - добавление Es in vitro; * - p < 0,05.
Обсуждение результатов
В наших исследованиях не обнаружен достоверный анаболический эффект субстанции Еб (прирост массы тела). Более того, у взрослых животных после перорального введения вещества, связанного с неизбежным стрессовым воздействием, масса тела после 10-ти инъекций несколько снижалась, что не препятствовало развитию эрготропного эффекта Еб. Напротив, у молодых животных наблюдался небольшой прирост массы тела одновременно с сильно выраженным эрготропным и психотропным адаптогенным действием субстанции Еб. По-видимому, слабое анаболическое действие субстанции Еб связано с низкими конечными дозами вещества, получаемого животными. Эти результаты согласуются с данными, полученными ранее в Институте биологии Коми НЦ Уро РАН в исследованиях А.Г. Кудяшевой с сотрудниками, показавшими незначительный прирост массы тела у белых беспородных мышей при кратковременном 10-дневном применении субстанции Еб. Выраженное анаболическое действие экдистероидсодержащей фракции было обнаружено только при долговременном 30-дневном применении субстанции Еб. В этих исследованиях было также показано отсутствие токсичности препарата даже при действии высоких доз (до 3000 мг/кг). В настоящее время считается, что
анаболический эффект левзеи сафлоровидной имеет сложный характер и не сводится только к действию 20E. В исследованиях ряда авторов указывается, что под действием 20E происходит стимуляция биосинтеза цитоплазматической и ядерной РНК, увеличение содержания белка и гликогена в печени, сердце и мышцах растущих животных [10-12]. В прямых измерениях радиоактивности и оценки скорости синтеза белка и РНК в гомогенатах из тканей печени, поджелудочной железы, семенников и надпочечников у мышей, получавших радиоактивную метку, обнаружено, что уже через 1-6 ч после одноразового введения 20E в дозе 10 мг/кг радиоактивность проб возрастает. Это, по мнению авторов, свидетельствует об усилении биосинтеза белка и РНК и лежит в основе анаболического эффекта экдистероидов у теплокровных животных [10]. Сведений о влиянии экдистероидов на синтез белка и РНК в интактной клетке пока нет.
Молекулярные механизмы комплексного адаптогенного действия фитоэкдистероидов в настоящее время интенсивно изучаются, однако многое еще неизвестно. Можно предположить, что при кратковременном действии экдистероидов, анаболический и адаптогенный эффекты разобщены. Действительно, обнаруженное в нашем исследовании повышение работоспособности у 80% исследованных животных (у некоторых особей в два раза!) без изменения массы тела указывает на первичность функциональных перестроек в организме по сравнению с более инерционными анаболическими процессами в клетках. Как известно, при максимальных физических нагрузках в организме развиваются два связанных между собой явления: 1) стрессовая реакция и усиление перекисного окисления липидов (ПОЛ) и 2) истощение запасов АТФ и гликогена из-за недостаточной мощности митохондриальной системы окислительного фосфорилирования. В результате чего накопление продуктов ПОЛ и лактата в мышцах может вести к повреждению митохондриальных мембран клеток. Это еще больше снижает эффективность окислительного фосфорилирования и ведет к повышению содержания лактата в крови, который и лимитирует продолжительность физической работы [13]. Можно предположить, что повышение выносливости к предельной физической нагрузке под действием 20E ведет к адаптивному ослаблению деструктивных процессов в мембранах митохондрий и замедлению процесса накопления лактата в мышечной клетке. Последнее, по-видимому, может достигаться с помощью антиоксидантов и протекторов ПОЛ. Представляется вероятным, что 20E работает в клетке как эффективный природный антиоксидант экстренного действия, который, благодаря специфичности своей стероидной молекулы и ее высокому сродству к клеточным рецепторам, способен ограничивать повреждение мембран интенсивно работающей мышечной клетки. Протекторное действие фитоэкдистероидов, ингибирующих ПОЛ (антиоксидантное действие), показано на мембранах эритроцитов [14], и, вероятно, его можно ожидать и в работающей мышечной клетке. Обнаруженное в наших исследованиях снижение тепловыделения на 10% при выполнении физической работы у животных, получавших препарат, может быть следствием адаптивной перестройки энергетики мышечных сокращений под влиянием 20E, ведущего к повышению коэффициента полезного действия (к.п.д.) мышцы и экономизации расхода энергетических субстратов при мышечном напряжении в экстремальных условиях.
Заключение
Полученные нами результаты близки к опубликованным сведениям об испытаниях препарата «Экдистен» из корневищ левзеи сафлоровидной [2], согласно которым у белых мышей, получавших препарат в дозе 5 мг/кг, время максимального плавания возрастало на 25%, а время бега до утомления на тредбане повышалось до 67%, время выработки рефлексов при дозе 10 мг/кг укорачивалось на 25%. В наших опытах показаны аналогичные высокие результаты: экдистероидная субстанция Es, выделенная нами из надземной части серпухи венценосной, в дозе 10 мг/кг после десяти введений per os повышает время плавания у белых беспородных мышей на 63%, а у линейных мышей СВА - на 107% без побочных эффектов. При этом время ориентировочного рефлекса и запоминания уменьшается на 40% и более.
Нами установлено, что при 10-дневном применении субстанции Es в дозах 1 и 10 мг/кг в течение пяти и десяти дней анаболический эффект (прирост массы тела) у половозрелых мышей-самцов не проявлялся. Можно предполагать, что анаболический и эрготропный эффекты под влиянием субстанции Es развиваются независимо друг от друга. Представляется вероятным, что адаптогенное действие субстанции Es приводит к перестройке энергетики мышечного сокращения в сторону повышения к. п. д. мышечной работы. Последнее предположение требует специальной экспериментальной проверки и составит предмет наших последующих исследований.
Таким образом, адаптогенное действие субстанции Es по характеру тонизирующего эффекта не уступает действию известного тонизирующегого препарата «Экдистен» из левзеи сафлоровидной, что свидетельствует о перспективности использования надземной части серпухи венценосной в качестве нового лекарственного сырья для получения экдистероидов.
Список литературы
1. Володин В.В. Экдистероиды в интактных растениях и клеточных культурах: Автореф. дис. ... докт. биол. наук. М., 1999. 49 с.
2. А.с. 1312774 СССР. Тонизирующее средство / Н.К. Абубакиров, М.Б. Султанов, В.Н. Сыров, А.Г. Кур-муков и др. // Б.И. 1988, № 17.
3. Куракина И.О., Булаев В.М. Экдистен - тонизирующее средство в таблетках по 0,005 г // Новые лекарственные препараты. М., 1990. Вып. 6. С. 16-18.
4. Патент 2153346 Россия. Способ получения экдистероидов / В.В. Володин, С.О. Володина // Б.И. 2000 №21.
5. Eлизарова О.Н. Определение пороговых доз промышленных ядов при парентеральном введении. М., 1962. 173 с.
6. Пчеленко Л.Д. Дозовая зависимость некоторых эффектов тироксина // Действие тироксина на физиологические функции. Сыктывкар, 1997. С. 6-17.
7. Башенина Н.В. Адаптивные особенности теплообмена мышевидных грызунов. М., 1977. 296 с.
8. Толмен Э. Когнитивные карты у крыс и у человека // Хрестоматия по истории психологии / Под ред. П.Я. Гальперина, А.Н. Ждана. М., 1980. С. 63-69.
9. Терсков И.А., Гительзон И.И. Метод кислотных эритрограмм // Биофизика. 1957. Т. 11. Вып. 2. С. 259-266.
10. Тодоров И.Н., Митрохин Ю.И., Eфремова О.И., Сидоренко Л.И. Действие экстрактов левзеи сафлоровидной на биосинтез РНК и белков в органах мыши // Химико-фармацевтический журнал. 2000. Т. 39. №9. С. 24-26.
11. Slama K., Lafont R. Insect hormones - ecdysteroids: their presence and actions in vertebrates // Eur. J. Entomol. 1995. V. 2. №1. P. 355-377.
12. Lafont R.D., Wilson I.D. The Ecdisone Handbook. Nottingam, 1992. 392 p.
13. Меерсон Ф.З. Патогенез и предупреждение стрессорных и ишемических повреждений сердца. М., 1984. 272 с.
14. Дармограй В.Н., Петров В.К., Ухов Ю.И. Растения-продуценты, пчело- и морепродукты как источники фармакологически активных экдистероидов // Поиск, разработка и внедрение новых лекарственных средств: Тез. докл. межд. науч. конф. Томск, 2000. С. 143-144.
Поступило в редакцию 13 августа 2001 г.
После переработки 27 марта 2002 г.
