Адаптация растений-регенерантов Eremogone saxatilis (L. ) Ikonn. К почвенным условиям Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

ВЕСТНИК УДМУРТСКОГО УНИВЕРСИТЕТА БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ

УДК 58.084+58.085: 58.006 (471.51)

О.Н. Дедюхина, А.С. Константинова, О.Г. Баранова

АДАПТАЦИЯ РАСТЕНИЙ-РЕГЕНЕРАНТОВ EREMOGONE SAXATILIS (L.) IKONN.

К ПОЧВЕННЫМ УСЛОВИЯМ

Приведены результаты по адаптации растений Eremogone saxatilis (L.) Ikonn. в разные типы субстратов. Установлен оптимальный субстрат и стартовый размер растений-регенерантов для перевода в условиях ex vitro.

Ключевые слова: редкие растения, адаптация растений, in vitro.

В настоящее время создание генетических банков растений in vitro является одним из перспективных направлений сохранения биоразнообразия растений, которые позволяют разрабатывать эффективные методики по отдельным видам редких растений.

Однако получение высоких результатов при микроклональном размножении в значительной степени лимитируется одним из самых ответственных и трудоемких этапов - адаптацией растений-регенерантов к выращиванию ex vitro, - который завершает весь процесс размножения in vitro и в случае массовой гибели растений может значительно понизить эффективность всего процесса микроразмножения. Неудачи на этапе адаптации напрямую связаны с рядом анатомических и физиологических особенностей растений-регенерантов, которые они приобретают в условиях роста in vitro [1-3].

На данный момент не существует универсальной технологии культивирования in vitro, а также адаптации полученных растений-регенерантов к почвенным условиям, которая была бы пригодна для всех растений. Но, как отмечала Н.А. Вечернина [3], для успешной адаптации растений необходимо создавать оптимальные условия для дальнейшего роста и развития не только надземной части реге-неранта, но и его корневой системы, где важную роль играет субстрат, который должен быть воздушным и влагоемким, не повреждающим хрупкую корневую систему растений при пересадке.

Это и определило направление нашей работы, целью которой было изучить влияние стартовых биометрических показателей растений на их приживаемость при переводе в условия ex vitro, а также выявить наиболее оптимальный субстрат для адаптации растений-регенерантов.

Материалы и методика исследований

Объектом исследований было выбрано редкое декоративное многолетнее растение - Eremogone saxatilis (L.) Ikonn., которое включено в Красную книгу Удмуртской Республики [4]. В качестве основного первичного экспланта при введении в культуру in vitro Eremogone saxatilis были использованы почки возобновления. Экспланты для исследований брались с молодых генеративных растений, растущих на экспозиционных участках Учебного ботанического сада Удмуртского университета [5-7].

Работу в асептических условиях, приготовление и стерилизацию питательных сред проводили по общепринятым методикам [1; 2; 8]. В ходе работы использовалась агаризованная питательная среда, приготовленная по прописи T. Murashige and F. Scoog (MS) с рН=5,6-5,7. Культивировались растения в условиях 16-часового фотопериода, при 24°С и относительной влажности воздуха 60-70%. Для мультипликации побегов использовали метод активации пазушных меристем ростовых побегов. Субкультивирование проводилось через 25-30 суток, при котором учитывалось количество (в шт.) и длина побегов, корней (в см, мм).

При укоренении регенерационных побегов использовалась среда MS, разбавленная вдвое по макро- и микросолям и с пониженным содержанием сахарозы - 15 гр/л. В качестве индуктора ризо-генеза использовалась индолил-3-масляная кислота (ИМК) в концентрации 1 мг/л [8].

Адаптацию к нестерильным условиям проводили в пластмассовых стаканчиках объемом 150 мл, которые помещались в пленочные мини-теплички. Для изучения влияния состава почвенных субстратов на эффективность адаптации растений-регенерантов было использовано 5 вариантов почво-грунтов: 1) торф: песок в соотношении 1:3; 2) торф: песок: перегной в соотношении 1:1:1; 3) торф: песок: перегной: вермикулит в соотношении 1:1:1:1; 4) торф: песок: перегной: вермикулит в соотношении 1:1:2:1; 5) торф: песок: перегной: вермикулит в соотношении 2:1:1:1.

Агрохимический анализ субстратов проводился перед высадкой растений-регенерантов. Анализ обменной кислотности осуществлялся потенциометрическим методом по ГОСТ 26483-91. Сумма поглощенных оснований определялась титриметрическим методом по ГОСТ 27821-88. Содержание подвижного фосфора - фотоколориметрическим методом, а обменного калия - методом пламенной фотометрии по ГОСТ 26207-91 [9-14].

На первых этапах адаптации растения находились в малогабаритных пленочных укрытиях (мини-теплицы), которые позволяли поддерживать высокую влажность воздуха в области наземной части растений. На второй месяц адаптации растения выращивались без создания специальных условий (освещенность, влажность). На этапе адаптации к почвенным условиям молодые растения регулярно поливались, так как на приживаемость растений отрицательно влияет как высыхание почвы, так и непродолжительное переувлажнение.

Приживаемость растений фиксировали при появлении новых листьев. Оценка основных параметров роста растений в зависимости от применяемых субстратов проводилась путем измерения линейных размеров.

Статистическая обработка данных проведена по методике Б.А. Доспехова [15] при помощи табличного процессора Microsoft Excel: для каждого среднего арифметического значения (М) определяли стандартную ошибку (±тМ) на уровне значимости 0,05.

Результаты и их обсуждение

При высадке в почвенный субстрат растений-регенерантов они должны иметь хорошо развитые листья или розетки, как отмечает ряд авторов [3; 8], а также развитую корневую систему. В наших работах по укоренению растений песчанки узколистной отмечено, что развитие корневой системы на среде укоренения наблюдается в течение 3-4 недель, что свидетельствует о том, что уже через месяц регенеранты можно высаживать в почвенный субстрат.

В ходе работы установлена зависимость приживаемости микрорастений в субстрате с их стартовыми размерами при переводе в условия ex vitro. На основе биометрических измерений и учета приживаемости растений песчанки при высадке из культуральных сосудов в субстрат выявлено, что растения (вариант 2, 3) с размерами более 5,0 см и с развитой корневой системой хорошо адаптируются в почвенном субстрате. В то время как растения с более низкими биометрическими показателями (вариант 1) показывают более низкую приживаемость 18,4% (табл. 1).

Таблица 1

Приживаемость растений-регенерантов Eremogone saxatШs в зависимости от биометрических

показателей при пересадке в грунт

Вариант опыта Высота розетки, см Количество корней, шт./растение Средняя длина корней, см Корни второго порядка, +/- Прижив аемость растений, %

1 Укоренение в течение 30 дней 3,8±0,17 2,4±0,14 1,8±0,12 - 18,4

2 Укоренение в течение 45 дней 5,2±0,35 4,6±0,12 3,2±0,34 + 52,8

3 Укоренение в течение 60 дней 5,8±0,25 7,4±0,25 4,6±0,22 + 74,5

Наши результаты показали, что на приживаемость пробирочных растений в почвенном субстрате влияют биометрические показатели микрорастений: высота растения, количество и длина корней. Хорошо приживаются растения с сильно развитой корневой системой, которая представлена корнями I и II порядков (табл. 1). На основании полученных данных установлено, что слабо развитые растения песчанки (высотой менее 5,0 см и имеющие от 2 до 4 корней на 1 растение) после нахождения на среде укоренения в течение 30 дней (1-й вариант) не готовы к переносу из пробирок в условия ex vitro. Микрорастения в этом случае целесообразно доращивать до оптимальных параметров и только после этого начинать процесс адаптации к почвенным условиям.

При сравнении биометрических показателей растений, содержащихся на среде укоренения в течение 45 и 60 дней (2-й и 3-й вариант), отмечено, что при сходстве высоты растений (примерно около 5-6 см) образцы этих вариантов существенно отличались по степени развития корневой системы (табл. 1). Растения песчанки в 3-м варианте (укоренение в течение 60 дней) имели наибольшее количество (7,4±0,25) и длину (4,6±0,22) корней на одно растение, что в конечном итоге сказалось на увеличении приживаемости растений (на 21,7 %) (табл. 1, 2).

Таким образом, мы можем рекомендовать использовать для пересадки в почвенные условия микрорастения, у которых начинает разрастаться корневая система. Для увеличения процента приживаемости растений песчанки к почвенным условиям необходим более длительный период укоренения микрорастений на среде (в течение 2 месяцев), в ходе которого формируется более развитая корневая система. При этом молодые листья становятся достаточно развитыми и способными к фотосинтезу.

При переводе регенерантов в почвенные условия во избежание массовой гибели растений применяют различные технологические элементы, которые улучшают качество субстратов. Обычно в качестве компонента, удерживающего влагу, используют слаборазложившийся торф из сфагнового мха, а для улучшения воздушного режима - крупнозернистый песчаник, не содержащий щелочных примесей. В настоящее время для улучшения агрофизических и физико-химических показателей субстратов используют природный материал - вермикулит [16].

Как отмечает Л.А. Иванова [16], торф и песок в той или иной степени улучшают свойства субстрата, но растения, выращенные на нем, как правило, плохо развиваются и не способны зачастую бороться с опасной микрофлорой. В наших работах при использовании для адаптации почвогрунта из торфа и песка (вариант 1) также отмечалась низкая приживаемость растений и слабое развитие растений на протяжении всего периода исследований (табл.2, 3).

Таблица 2

Влияние агрохимических показателей субстратов на приживаемость растений-регенерантов

Eremogone saxatШs

№ Тип субстрата Агрохимические показатели субстратов Приживаемость, %

рНксц ед. ммоль/100г Р2О5, мг/кг К2О, мг/кг

1 Торф: песок (1:3) 5,8 38,1 98,5 65,0 47,8

2 Торф: песок: перегной (1:1:1) 6,6 36,4 447,5 530,0 64,4

3 Торф: песок: перегной: вермикулит (1:1:1:1) 6,8 41,5 431,1 457,5 44,4

4 Торф: песок: перегной: вермикулит (1:1:2:1) 6,8 44,5 671,1 940,0 100,0

5 Торф: песок: перегной: вермикулит (2:1:1:1) 6,4 44,5 397,0 437,5 44,4

Сравнительный анализ субстратов показал, что наиболее важным компонентом почвенной смеси для укоренения и дальнейшего роста растений является перегной. Как видно из табл. 2, высокая приживаемость растений отмечалась в субстратах 4 (100%) и 2 (64,4 %), имеющих повышенное содержание перегноя (более 33,3% от общего объема). Максимальная приживаемость растений в почвенной смеси 4 обусловлена содержанием в нем вермикулита (20 % от общего объема), который улучшает агрофизические свойства субстрата и характеризуется хорошей водоудерживающей способностью, что препятствует иссушению растений в процессе адаптации.

Длительность эксперимента по адаптации растений к почвенным условиям составила 2 месяца. При завершении этапа адаптации во всех вариантах отмечался активный рост и развитие растений, в результате которого растения песчанки сформировали хорошо развитые розетки. В табл. 3 представлены биометрические показатели, которыми характеризовались растения Eremogone saxatilis, адаптированные в разных типах субстрата на момент их переноса в открытый грунт.

Как видно из табл. 3, растения через 60 дней после высадки в грунт, независимо от типа субстрата, сформировали примерно одинаковую наземную часть. Они при этом находились в вирги-нильном состоянии, которое характеризовалось отрастанием на укороченном осевом побеге боковых побегов (дочерних розеток) в основании с 1 или 2 парами листьев. Растения достигали высоты до

11,5 см и представляли собой небольшие дернинки округлой формы до 6,2 см в диаметре, состоящие из 2-7 розеточных вегетативных побегов. Корневая система растений была представлена главным стержневым корнем длиной до 10,0 см и 5-9 боковыми корнями.

Таблица 3

Биометрические показатели растений Eremogone saxatШs при адаптации на разных типах

субстрата к почвенным условиям

№ Тип субстрата Биметрические показатели

Высота растения, см Количество дочерних розеток, шт./растение

1 Торф: песок (1:3) 5,7-8,7 3-6

2 Торф: песок: перегной (1:1:1) 7,1-9,8 3-6

3 Торф: песок: перегной: вермикулит (1:1:1:1) 6,9-10,1 3-6

4 Торф: песок: перегной: вермикулит (1:1:2:1) 9,4-11,4 3-7

5 Торф: песок: перегной: вермикулит (2:1:1:1) 7,2-8,2 2-4

Однако следует отметить, что более крепкие и развитые растения формировались в варианте 4, где в составе субстрата для адаптации использовался вермикулит, который создавал оптимальный водно-воздушный режим и режим минерального питания, обеспечивая тем самым максимальную приживаемость (100%) и высокие темпы роста растений.

Выводы

Для адаптации в почвенные условия пригодны растения, у которых отмечается хорошо сформированная корневая система, а молодые листья развиты и способны к фотосинтезу.

Для увеличения процента приживаемости пробирочных растений песчанки в грунте необходим продолжительный период укоренения микрорастений песчанки в течение 2 месяцев, в результате которого формируется хорошая корневая система.

Для адаптации растений-регенерантов оптимальным является следующий субстрат: торф: песок: перегной: вермикулит в соотношении 1:1:2:1.

Использование вермикулита в составе почвогрунтов позволяет создать оптимальные условия для адаптации растений, обеспечивая максимальную приживаемость и высокие темпы роста растений.

Работа выполнена в рамках проекта № 13474 аналитической ведомственной целевой программы «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2010 годы)».

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Биотехнология сельскохозяйственных растений / пер. с англ. В.И. Негрука. М.: Агропромиздат, 1987. 301 с.

2. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе: учеб. пособие. М.: ФБК-ПРЕСС, 1999. 160 с.

3. Вечернина Н.А. Биотехнология растений. Барнаул: Изд-во Алт. ун-та, 2009. 224 с.

4. Список редких и исчезающих видов высших растений, лишайников, грибов и животных, занесенных в Красную книгу Удмуртской Республики // О Красной книге Удмуртской Республики: Постановление правительства Удмуртской Республики № 31 от 5.03.2007 // Собрание законодательства Удмуртской Республики. 2007. № 11.

5. Дедюхина О.Н. Начальные этапы онтогенеза Eremogone saxatilis (L.) Ikonn. при интродукции в ботаническом саду Удмуртского государственного университета // Биоразнообразие: проблемы и перспективы сохранения: материалы Междунар. науч. конф. Пенза, 2008. С. 25, 26.

6. Дедюхина О.Н., Баранова О.Г. Опыт создания искусственных популяций Eremogone saxatilis (L.) Ikonn. в Ботаническом саду Удмуртского университета // Интродукция растений: теоретические, методические и прикладные проблемы: материалы Междунар. конф. Йошкар-Ола, 2009. С. 22-25.

7. Дедюхина О.Н. Клональное микроразмножение Eremogone saxatilis (L.) Ikonn. // Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира: материалы III Всерос. науч.-практ. конф. Волгоград, 2010. С. 126-130.

8. Катаева Н.В., Бутенко Р.Г. Клональное микроразмножение растений. М.: Наука, 1983. 96 с.

9. Физиология растений: учебник для студ. вузов / под ред. И.П. Ермакова. М.: Изд. центр «Академия», 2005. 640 с.

10. Якушкина Н.И. Физиология растений М.: ВЛАДОС, 2005. 463 с.

11. Ринькис Г.Я., Ноллендорф В.Ф. Сбалансированное питание растений макро- и микроэлементами. Рига: Зи-натне, 1982. 304 с.

12. ГОСТ 27821-88 ПОЧВЫ. Определение суммы поглощенных оснований по методу Каппена. М.: Изд-во стандартов, 1988.

13. ГОСТ 26207-91 ПОЧВЫ. Определение подвижных соединений фосфора и калия по методу Кирсанова в модификации ЦИНАО. М.: Изд-во стандартов, 1992.

14. ГОСТ 26483-85 ПОЧВЫ. Приготовление солевой вытяжки и определение ее pH по методу ЦИНАО. М.: Изд-во стандартов, 1987.

15. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта. М.: Колос, 1979. 416 с.

16. Иванова Л.А. Субстрат для культивирования растений-регенерантов при микроклональном размножении // Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира: материалы II Всерос. на-уч.-практ. конф. Белгород: Изд-во БелГУ, 2008. С. 171-174.

Поступила в редакцию 10.08.11

O.N. Dedyukhina, A.S. Konstantinovа, O.G. Baranova

The adaptation of regenerated plants Eremogone saxatilis (L.) Ikonn. to soil conditions

The article presents the data for the adaptation of Eremogone saxatilis (L.) Ikonn. to different types of substrates. The

optimal substrate and the starting size to put the above plants into an artificial environment (in vitro) are determined.

Keywords: rare plant, adaptation of plants, in vitro.

Дедюхина Ольга Николаевна,

инженер Учебного ботанического сада

ФГБОУ ВПО «Удмуртский государственный университет»

426034, Россия, г. Ижевск, ул. Университетская, 1

E-mail: [email protected]

Константинова Анна Сергеевна,

зав. лабораторией почвенной экологии

ФГБОУ ВПО «Удмуртский государственный университет»

426034, Россия, г. Ижевск, ул. Университетская, 1

E-mail: [email protected]

Баранова Ольга Германовна,

доктор биологических наук, профессор

ФГОБУ ВПО «Удмуртский государственный университет»,

426034, Россия, г. Ижевск, ул. Университетская, 1 (корп. 1)

E-mail: [email protected]

Dedyukhina O.N.,

engineer of Botanical garden

Udmurt State University

426034, Russia, Izhevsk, Universitetskaya str., 1

E-mail: [email protected]

Konstantinova A.S.,

director of the laboratory of soil ecology

Udmurt State University

426034, Russia, Izhevsk, Universitetskaya str., 1

E-mail: [email protected]

Baranova O.G.,

doctor of biology, professor

Udmurt State University

462034, Russia, Izhevsk, Universitetskaya str., 1/1 E-mail: [email protected]