CC BY
67
УДК 631.52: 577.21
АДАПТАЦИЯ МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ SSR-МАРКЕРОВ ПШЕНИЦЫ ДЛЯ АНАЛИЗА ГЕНОМОВ ПЫРЕЯ СРЕДНЕГО,
ПЫРЕЯ УДЛИНЕННОГО И ПШЕНИЧНО-ПЫРЕЙНЫХ ГИБРИДОВ
П.Ю. КРУПИН, М.Г ДИВАШУК, И.А. ФЕСЕНКО, Г.И. КАРЛОВ
(Центр молекулярной биотехнологии РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева)
Адаптированы микросателлитные маркеры пшеницы для анализа генома пырея среднего и пырея удлиненного. В результате проведенных исследований из 37 маркеров пшеницы для анализа генома пырея среднего было адаптировано 29, для пырея удлиненного — 32 маркера. В пшенично-пырейном гибриде Истра 1 для шести маркеров (Xgwm46, Xgwm340, Xgwm314, Xgwm156, Xgwm292, Xwmc221) показана амплификация фрагментов, характерных для пырея. Полученные результаты могут быть использованы для изучения геномов пырея среднего и пырея удлиненного, а также в селекционной работе с пшенично-пырейными гибридами.
Ключевые слова: мягкая пшеница, пырей средний, пырей удлиненный, пшенично-пырейный гибрид, отдалённая гибридизация, SSR-маркеры, микросателлитные маркеры.
Промежуточные пшенично-пырейные гибриды (ППГ) — селекционный материал, обладающий большим потенциалом [1, 9]. В своём геноме ППГ (2n=56) сочетают 38-42 хромосомы пшеницы и 14-18 хромосом пырея [6]. При их получении используют различные виды пырея разного уровня плоидности: понтийский (Thinopy-rum ponticum, 2n=70), средний (Th. intermedium, 2n=42), удлиненный (Th. elongatum 2n=14). При этом у различных ППГ набор хромосом пырея отличается друг от друга и представляет собой уникальную комбинацию из хромосом пырея среднего, пырея понтийского или пырея удлиненного [3, 6].
Благодаря наличию пырейного субгенома ППГ обладают комплексной устойчивостью к грибным и вирусным заболеваниям, высокой зимостойкостью и некоторые из них — способностью отрастать после скашивания и многолетним образом жизни [1, 9]. Разные комбинации пырейных хромосом обеспечивают биоразнообразие форм, различающихся между собой по этим признакам. Таким образом, ППГ может служить как селекционным мостиком для переноса хозяйственно ценных признаков в геном пшеницы, так и модельным объектом для изучения взаимодействия пшеничного и пырейного геномов [8].
Из-за слабой молекулярно-генетической изученности геномов пырея возникают сложности при анализе ППГ. Использование молекулярных маркеров геномов пырея позволило бы картировать хозяйственно полезные признаки на пырейных хромосомах и направленно интрогрессировать их в хромосомы пшеницы, а также глубже понять взаимодействие геномов у отдалённых гибридов [2, 4, 7, 13].
Наиболее эффективными и полиморфными маркерами для молекулярной характеристики злаков являются микросателлитные маркеры (SSR). Они основаны на
полиморфизме микросателлитных повторов и продемонстрировали высокую эффективность при картировании генома пшеницы. В настоящее время разработано более 1500 маркеров для маркирования ее генома [10]. Разработка SSR-маркеров для малоизученных в молекулярно-генетическом плане видов является длительным, трудоемким и затратным процессом. В качестве альтернативы в настоящее время успешно применяется так называемый перенос (transfer), или адаптация SSR-маркеров, созданных для родственных видов. Такой подход был успешно использован для нескольких SSR-маркеров генома пшеницы при изучении геномов видов пырея [15].
Цель данной работы — адаптация микросателлитных маркеров пшеницы для изучения геномов пырея среднего и пырея удлиненного, а также пшенично-пырейного гибрида.
Материал и методы
В работе использовали ДНК пырея среднего (каталожный номер системы GRIN 401200, Иран), пырея удлиненного (каталожный номер системы GRIN 401007, Турция), пшенично-пырейного гибрида Истра 1 (Отдел отдалённой гибридизации ГБС РАН имени Н.В. Цицина).
ДНК выделяли CTAB-методом из этиолированных проростков по методу Bernatzky и Tanksley [5].
Выбранные для работы SSR-маркеры [11, 16] перечислены в таблице. ПЦР проводили при температуре отжига, рекомендованной в литературе [11] и в соответствии с методикой Schuelke [12]. Первый раунд ПЦР заключался в синтезе ПЦР-продукта с использованием прямого (0,04 пкмоль/мкл) и обратного праймеров (0,16 пкмоль/мкл). Второй раунд ПЦР состоял в мечении полученного ПЦР-продукта при температуре отжига 53°С. Полученный продукт анализировали методом фраг-ментного анализа с помощью секвенатора ABI 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems).
Результаты и их обсуждение
Первым этапом в работе был отбор микросателлитных маркеров для дальнейшего фрагментного анализа. Была проведена полимеразная цепная реакция с 37 SSR-маркерами на образцах пшеницы, пырея и ППГ. После разделения фрагментов в агарозном геле отобрали 33 маркера, для которых наблюдался продукт амплификации при использовании ДНК диких сородичей (см. таблицу). Для маркеров Xgwm205, Xgwm264, Xgdm33, Xgwm44 не наблюдали амплификации на пырее удлинённом и пырее среднем, и они были исключены из дальнейшего фраг-ментного анализа.
В ходе фрагментного анализа было установлено, что зачастую с геномов пырея среднего, пырея удлиненного и пшенично-пырейного гибрида Истра 1 амплифици-руются фрагменты двух типов: микросателлитный тип (так называемая «гребенка») и немикросателлитный тип (монопик). В нашей работе при анализе полученных данных мы учитывали лишь фрагменты, дающие амплификацию по микросателлитно-му типу (рисунок). Сравнение с фрагментами пшеницы осуществляли на основании литературных данных [10, 11, 16].
Адаптация микросателлитных маркеров пшеницы для изучения генома пырея среднего и пырея удлиненного может найти широкое применение. SSR-маркеры мо-
Фрагментный анализ продуктов амплификации ввР-маркера ХдЬтБ (пырей средний и пырей удлинённый): красный — маркер размеров, синий — анализируемый фрагмент
гут быть использованы в филогенетических и популяционных исследованиях этих видов, а также при переносе хозяйственно полезных признаков в пшеницу [4, 7]. В результате проведенных нами исследований в геноме пырея среднего и пырея удлиненного следующие SSR-маркеры давали фрагменты микросателлитного типа: Xcfd168, Xgdm8, Xgwm312, Xgwm325, Xgwm46, Xgwm340,Xgwm382, Xgwm642. Xbarc57, Xgwm341, Xgwm319, Xgwm397, Xgwm149, Xgwm335, Xgwm268. Xgwm484, Xgwm174, Xgwm111, Xgwm314, Xgwm232, Xgwm71, Xgwm52, Xgwm156. Xgwm292, Xgwm493, Xgwm538, Xwmc170, Xwmc221, Xwmc153. Кроме того. SSR-маркеры Xgwm157, Xgwm469 и Xcfd68 давали продукт только у пырея удли-
Результаты фрагментного анализа на пшенице, пырее среднем, пырее удлиненном и ППГ сорта Истра 1
(размеры указаны с учётом приращения на 20 п.н. за счёт праймера М13)
Маркер ХсГсЛ 68 Хдсіт8 Хд\л/т312 Хд\л/т325 Хд\л/т46 Хд\л/т157 Хд\л/т469 Хд\л/т428 Хд\л/т340 Хд\л/т382
Локализация на хромосоме 20, 2А 5В, 30 2А 6В, 60 7ВЭ 201 1 В, 50, 60Э. 70 ЗВ1_ 2АЦ 2В, 20
Размер у пшеницы (по лит. данным) 197 216, 219 133, 138 186, 179 106, 110 172, 170 137, 133 159 86, 184, 108
Пырей средний 238, 245, 247, 256, 260, 284, 326, 336 127, 130, 145, 160, 170, 184, 207, 220 187 93, 100, 105, 125, 143, 154, 227, 240, 340, 343 92, 97, 102, 113, 140, 145, 155, 165, 175, 314 0 0 0 140, 145, 147, 162, 175, 179, 187, 197, 192, 210 93, 103, 108, 120, 125
Пырей удлиненный 180, 187, 190, 232, 245, 254, 260, 265, 267, 273, 276 120, 137, 146,160, 162, 165, 175 163, 177, 180, 187, 197, 247 96, 126, 140, 142, 153, 225, 238, 243 102, 118, 125, 143, 157, 172, 182, 188, 194 117, 127, 137, 139, 118, 130, 153, 160, 165, 0 84, 103, 105, 125, 140, 145, 170, 175, 185, 205, 207, 212, 220, 225, 227 103, 105, 109, 111, 115, 121, 140
ППГ (Сорт Истра 1) 235, 257, 275 158, 160, 165, 184, 266 112, 145, 170, 176, 237 151 122, 130, 142, 145, 197, 224, 122, 127 117,160, 184 162, 170, 180 140, 178, 236 104, 129, 218, 270
Маркер Хд\л/т642 ХЬагс57 хд\л/т341 Хд\л/т319 Хд\л/т397 Хд\л/т149 Хд\л/т335 Хд\л/т268 Хд\л/т484 Хд\л/т174
Локализация на хромосоме Ю1_ ЗА 30 7А, 2В 4А 4В 5ВЦ 5ЕЦ 7Е1_ 1В 20 501_
Размер у пшеницы (по лит. данным) 187, 179 166 157 170168 175 193 161 152 203 240 204 198 153 143 233 204
Пырей средний 94, 97, 143, 160, 170, 182, 195, 213, 240, 303 205, 210, 217, 230, 253, 263 108, 116, 128, 132, 186 183, 185, 205, 223 165, 184, 230, 239, 260, 270 120, 162, 170, 172, 230, 255 153, 167, 228 85, 92, 97, 143, 145, 159, 177, 204, 215, 227, 235, 243, 265, 286, 293, 305, 388 114, 135, 145, 155, 180, 244, 275, 304, 310, 315, 318, 325 149, 153, 315, 325, 326, 363, 370
Пырей удлиненный 88, 95, 138, 157, 187, 195, 200, 205, 207, 230, 304, 310, 315 211 108, 110, 126 168, 187, 197, 205, 222, 235, 290, 295, 307, 337 162, 180, 187, 190, 198, 215, 222 110, 115, 162, 167, 172, 187, 195, 200, 214, 225, 230, 243, 255 156, 223, 257 120, 134, 147, 175, 177, 185, 190, 200, 205, 215, 220, 235, 237, 245, 265, 267, 285, 287, 290, 295, 377, 115, 137, 144, 150, 155 170, 173, 180, 297, 300, 308, 310, 320, 363, 403
Истра 1 97, 140, 158, 184, 190, 198, 220, 245, 257 108, 117, 124, 144 133, 135, 156,, 193, 216, 157, 181, 194, 219 171 187, 208 87, 115, 130, 165, 205, 210, 233, 235, 255, 257, 265 164 187, 354, 415
Маркер Хд\л/т111 Хд\л/т314 Хд\л/т232 Хд\л/т71 ХсГс)68 Хд\л/т156 Хд\л/т292 Хд\л/т52.2 Хд\л/т493 Хд\л/т538
Локализация на хромосоме 70 4В, 30 Ю, 50 30, 20Э, 2ВЭ, 2АЭ 7А, 70 6В, 5В, 5А 501_, 6ЕЭ 301_ ЗВ 4В1_
Размер у пшеницы (по лит. данным) 206 184 182 171 140144 126 124 120 118 101 204 300 279 214 188 142 128 179, 171 168 149
Пырей средний 150, 350, 353, 355, 359 106, 113, 137, 142, 152, 155, 165, 170, 182, 200, 215, 238, 250, 252 141 122, 125, 127, 132, 165, 0 176, 186, 287 176, 181, 186, 264 125, 140, 155 120, 208, 117, 197 177, 235
Пырей удлиненный 150 153 114, 132, 140, 146, 150, 152, 157, 161, 167, 182, 200, 255, 265, 271, 292, 294, 324 120, 140, 287 126, 151, 290 115, 124, 132, 128 160, 170, 177, 183, 287 185 124, 140, 147, 152, 240, 255, 265 180, 207, 218 140, 184, 195, 153, 190, 210,
Истра 1 155 220 114, 156, 141, 181, 254 153, 203, 140, 281 160, 286 110, 118, 122, 124, 127, 138, 140 186, 227 176, 186, 280, 286 187, 191, 233 125, 170, 366 157 156, 167, 172
Маркер Х\л/тс170 Х\л/тс221 Х\л/тс153 Хд\л/т205 Хд\л/т264 Хдс)тЗЗ Хд\л/т44
Локализация на хромосоме 2А 70 ЗА1. , Ю 5А, 50 1 А, 1 В, ЗВ, 7В 1А, 1 В, Ю 70
Размер у пшеницы (по лит. данным) 230 209 177
Пырей средний 214, 245, 105, 145, 225, 265 109, 157, 232, 275 120, 208, 262, 278 153, 277 157, 281 0 0 0 0
Пырей удлиненный 272, 285 277, 292 143, 210, 223, 98, 100, 154 0 0 0 0
Истра 1 240 130, 145, 229, 226, 100, 154, 172
ненного. Маркер Xgwm428 ни на пырее среднем, ни на пырее удлиненном фрагментов не показал. Таким образом, из 37 88Я-маркеров генома пшеницы могут быть использованы 29 маркеров для анализа генома пырея среднего и 32 маркера для пырея удлиненного.
Успешные результаты по адаптации 88Я-маркеров пшеницы для анализа геномов пырея позволили провести оценку их эффективности на модельном пшенично-пырейном гибриде Истра 1, полученном с участием различных видов пырея и сортов пшеницы [1]. Сорт ППГ Истра 1 хорошо изучен с агрономической, ботанической, технологической и фитопатологической точек зрения. Кроме того, данный сорт получил подробную молекулярноцитогенетическую характеристику пырейных хромосом [3]. У пырея среднего, пырея удлиненного и Истры 1 среди продуктов ПЦР были отмечены фрагменты, близкие по размеру к пшенице у следующих 88Я-маркеров: Xcfd168, Xgwm382, Xgwm642, Xgwm341, Xgwm319, Xgwm397, Xgwm149, Xgwm268, Xgwm111, Xgwm232, Xgwm71, Xgwm52, Xwmc153. У 88Я-маркеров Xgdm8, Xgwm157, Xgwm469 и Xgwm484 среди ампликонов наблюдались фрагменты, общие у пырея удлиненного, пшеницы и Истры 1. Так как данные микросател-литные маркеры среди фрагментов давали близкие по размеру к пшеничным, а полная родословная данного образца неизвестна, то при анализе ППГ нельзя достоверно установить, амплифицируются они с пшеничного или пырейного геномов.
У микросателлитных маркеров Xgwm46, Xgwm340, Xgwm314, Xgwm156, Xgwm292 среди ампликонов были отмечены фрагменты, общие у пырея среднего, удлиненного и Истры 1, однако не встречающиеся у пшеницы (таблица, бэнды выделены жирным курсивом). Для маркера Xwmc221 кроме основного (226 п.н.) нами было установлено наличие дополнительного пика у Истры 1 размером 229 п.н., который также встречался и у других ППГ, и у пырея понтийского, но отсутствовал у пшеницы. Маркер Xwmc221 ранее использовался для картирования пшенично-пырейной транслокации и давал полиморфизм по бэндам между пшеницей и пыреем [4]. Маркер Xgwm325, согласно литературным данным, даёт специфичный в целом для пырейного генома бэнд размером 100 п.н. [15]. В нашей работе на Истре 1 он не наблюдался, однако был отмечен на пырее среднем и пырее удлиненном (см. табл.).
Таким образом, нами было выявлено 6 микросателлитных маркеров, дающих фрагменты у пырея среднего и/или удлиненного и Истры 1, отсутствующие у пшеницы. Так как различные ППГ отличаются друг от друга составом пырейных хромосом, данная группа маркеров может быть использована при оценке разнообразия пырей-ного генома в коллекциях ППГ, а также при проведении селекционных скрещиваний с целью отслеживания передачи хромосом пырея. Эти маркеры локализованы на всех семи гомеологичных группах пшеницы, кроме второй и четвёртой (таблица). Возможно, они локализованы на соответствующих гомеологичных группах пырея, что позволяет в дальнейшем их использовать при создании дополненных или замещенных линий по конкретной паре хромосом на основе ППГ.
У маркеров Xgwm335, Xcfd68, Xgwm493, Xgwm538 и Xwmc170 среди фрагментов амплификации на пырее среднем и удлиненном не было обнаружено близких по размеру к пшенице и ППГ. Благодаря их отличию от пшеничных фрагментов они также могут быть использованы при работе с отдалёнными гибридами и интрогрес-сионными линиями.
1. Из 37 SSR-маркеров мягкой пшеницы для анализа генома пырея среднего адаптировано 29, для генома пырея удлиненного — 32.
2. В пшенично-пырейном гибриде Истра 1 показана амплификация пырей-специфичных фрагментов для шести SSR-маркеров (Xgwm46, Xgwm340, Xgwm314, Xgwm156, Xgwm292, Xwmc221).
3. Отобрано 11 SSR-маркеров (Xgwm46, Xgwm340, Xgwm314, Xgwm156, Xgwm292, Xwmc221, Xgwm335, Xcfd68, Xgwm493, Xgwm538, Xwmc170 и Xgwm325), дающих специфичные фрагменты в геноме пырея, которые могут быть использованы при анализе пшенично-пырейных гибридов.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и образования Российской Федерации в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России», государственный контакт ГК П1048.
Библиографический список
1. Белов В.И., Иванова Л.П. Улучшение продуктивности октоплоидных промежуточных ППГ // Отдален. гибридизация. М.: Изд-во ТСХА, 2001. С. 166-177.
2. Дивашук М.Г., Карлов Г.И., Соловьев А.А. Использование микросателлитных маркеров для идентификации пшенично-ржаной транслокации у гексаплоидной тритикале // Известия ТСХА, 2007. Вып. 1. С. 61-65.
3. Крупин П.Ю., ДивашукМ.Г., Белов В.И., Глухова Л.И., Александров О. С., Карлов Г.И. Сравнительная молекулярно-цитогенетическая характеристика промежуточных пшенично-пырейных гибридов // Генетика, 2011. Т. 47. № 4. С. 492-498.
4. Ayala-Navarrete L., Tourton E., MechanicosA.A., Larkin P.J. Comparison of Thinopyrum intermedium derivatives carrying barley yellow dwarf virus resistance in wheat // Genome, 2009. Vol. 52. P. 537-546.
5. Bernatzky R., Tanksley S.D. Toward a saturated linkage map in tomato based on isozyme and random cDNA sequences // Genetics, 1986. Vol. 112. P. 887-898.
6. Fedak G., Han F Characterization of derivatives from wheat-Thinopyrum wide crosses // Cytogenet. Genome Res., 2005. Vol. 109. P. 360-367.
7. Lammer D., CaiX., Arterburn M., Chatelain J., Murray T., Jones S. A single chromosome addition from Thinopyrum elongatum confers a polycarpic, perennial habit to annual wheat // Journal of Experimental Botany, 2004. Vol. 55. №. 403. Рр. 1715-1720.
8. Larkin P.J., Banks P.M., Lagudah E.S., Apple R., Chen X., Xin Z.Y., Ohm H.W., McIntosh R.A. Disomic Thinopyrum intermedium addition lines in wheat with barley yellow dwarf virus resistance and with rust resistances // Genome, 1995. Vol. 38. P. 385-394.
9. Newell M., Larkin P., Hayes R., Norton M. Evaluation of perennial wheat germplasm in an Australian environment // “Food Security from Sustainable 7. Agriculture” Proceedings of the 15th Australian Agronomy Conference (Eds H Dove & R. Culvenor). 15-18th November, 2010. Lincoln, Christchurch, New Zealand. Australian Society of Agronomy: http://www.regional.org.au/ au/asa/2010/crop-production/physiology-breeding/6906_newellmt.htm
10. Roder M.S., HuangX.-Q., Ganal M.W. Wheat Microsatellites: Potential and Implications // Molecular Marker Systems in Plant Breeding and Crop Improvement / Biotechnology in Agriculture and Forestry, 2005. Vol. 55. P. 255-266.
11. Roder M.S., Korzun V., Wendehake K., Plaschke J., Tixier M.-H., Leroy P., Ganal M.W. A Microsatellite Map of Wheat // Genetics, 1998. 149. P. 2007-2023
12. SchuelkeM. An economic method for the fluorescent labeling of PCR fragments // Nature Biotechnology, 2000. Vol. 18. http://www.nature.com/nbt/journal/v18/n2/full/nbt0200_233.html
13. Sepsi A, Molnar I, Molnar-Lang M. Physical mapping of a 7A.7D translocation in the wheat-Thinopyrum ponticum partial amphiploid BE-1 using multicolour genomic in situ hybridization and microsatellite marker analysis. // Genome, 2009. Vol.52. P. 748-754.
14. Wang L.-M., Li X.-F., Liu S.-B., Wang H.-G. Studies on the Transferability of Common Wheat (T. аestivum) Microsatellites (SSR) Markers Used in Thinopyrum intermedium //Acta Agriculturae Boreali-Sinica, 2007-06
15. You M.-S., Li B.-Y., Tian Z.-H., Tang Z.-H., Liu S.-B., Liu G.-T. Development of specific SSR marker for Ee genome of Thinopyrum spp. using wheat microsatellites // Chinese Journal of Agricultural Biotechnology, 2004. 1. P. 143-148.
16. http://wheat.pw.usda.gov/GG2/index.shtml
Рецензент — д. б. н. В.В. Пыльнев
SUMMARY
Microsatellite wheat markers for genome analysis of both wheatgrass and intermediate wheatgrass are adapted. As a result of research done, out of 37 wheat markers for genome analysis of intermediate wheatgrass 29 markers have been adapted, whereas 32 markers have been adapted for wheatgrass. In wheat-wheatgrass hybrid Istra 1 for six markers (Xgwm46, Xgwm340, Xgwm314, Xgwm156, Xgwm292, Xwmc221) amplification of fragments, typical of wheatgrass, is shown. The results given can be used for both wheatgrass and intermediate wheatgrass genome study, and also in selection work with wheat-wheatgrass hybrids.
Key words, soft wheat, intermediate wheatgrass, wheatgrass, wheat-wheatgrass hybrid, remote hybridization, SSR-markers, microsatellite markers.
Крупин Павел Юрьевич — Тел. (499) 977-72-01.
Эл. почта: pavelkroupin1985@mail.com
Дивашук Михаил Георгиевич — к. б. н. Тел. (499) 977-72-01. Фесенко Игорь Александрович — к. б. н. Тел. (499) 977-72-01. Карлов Геннадий Иванович — д. б. н. Тел. (499) 977-72-01.
Эл. почта: karlov@timacad.ru
