CC BY
42
ISSN 1026-2237 ИЗВЕСТИЯ ВУЗОВ. СЕВЕРО-КАВКАЗСКИИ РЕГИОН. ЕСТЕСТВЕННЫЕ НАУКИ._2020. № 4
ISSN 1026-2237 BULLETIN OF HIGHER EDUCATIONAL INSTITUTIONS. NORTH CAUCASUS REGION. NATURAL SCIENCE. 2020. No. 4
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ BIOLOGICAL SCIENCES
УДК 579.22:57.017.3
doi 10.18522/1026-2237-2020-4-130-142
АДАПТАЦИЯ ДРОЖЖЕЙ S. CEREVISIAE Y-503, S. CEREVISIAE DAW-3A, S. OVIFORMIS М-12Х К РАЗЛИЧНЫМ ЗНАЧЕНИЯМ ЭТАНОЛА. ТВЕРДЫЕ ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ
© 2020 г. Э.А. Халилова1, Э.А. Исламмагомедова1, С.Ц. Котенко1, А.А. Абакарова1, Д.А. Аливердиева1
1Прикаспийский институт биологических ресурсов Дагестанского федерального исследовательского центра РАН,
Махачкала, Россия
ADAPTATION OF THE YEAST S. CEREVISIAE Y-503, S. CEREVISIAE DAW-3A, S. OVIFORMIS M-12X TO VARIOUS ETHANOL VALUES. SOLID GROWTH MEDIA
E.A. Khalilova1, E.A. Islammagomedova1, S. Ts. Kotenko1, А-A. Abakarova1, D.A. Aliverdieva1
1Caspian Institute of Biological Resources, Dagestan Federal Research Center, Russian Academy of Sciences, Makhachkala, Russia
Халилова Эсланда Абдурахмановна - кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник, лаборатория биохимии и биотехнологии, Прикаспийский институт биологических ресурсов Дагестанского федерального исследовательского центра РАН, ул. М. Гаджиева, 45, г. Махачкала, Республика Дагестан, 367000, Россия, e-mail: eslanda61@mail.ru
Исламмагомедова Эльвира Ахмедовна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, лаборатория биохимии и биотехнологии, Прикаспийский институт биологических ресурсов Дагестанского федерального исследовательского центра РАН, ул. М. Га-джиева, 45, г. Махачкала, Республика Дагестан, 367000, Россия, e-mail: islammagomedova@mail.ru
Котенко Светлана Цалистиновна - кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник, лаборатория биохимии и биотехнологии, Прикаспийский институт биологических ресурсов Дагестанского федерального исследовательского центра РАН, ул. М. Гаджиева, 45, г. Махачкала, Республика Дагестан, 367000, Россия
Абакарова Аида Алевдиновна - старший лаборант, лаборатория биохимии и биотехнологии, Прикаспийский институт биологических ресурсов Дагестанского федерального исследовательского центра РАН, ул. М. Га-джиева, 45, г. Махачкала, Республика Дагестан, 367000, Россия, e-mail: aida.abaкarva@rambler.ru
Eslanda A. Khalilova - Candidate of Biological Sciences, Leading Researcher, Laboratory of Biochemistry and Biotechnology, Caspian Institute of Biological Resources, Dagestan Federal Research Center, Russian Academy of Sciences, M. Gadzhieva St., 45, Makhachkala, Republic of Dagestan, 367000, Russia, e-mail: eslanda61@mail.ru
Elvira A. Islammagomedova - Candidate of Biological Sciences, Senior Researcher, Laboratory of Biochemistry and Biotechnology, Caspian Institute of Biological Resources, Dagestan Federal Research Center, Russian Academy of Sciences, M. Gadzhieva St., 45, Makhachkala, Republic of Dagestan, 367000, Russia, e-mail: islammagomedova@mail.ru
Svetlana Ts. Kotenko - Candidate of Biological Sciences, Leading Researcher, Laboratory of Biochemistry and Biotechnology, Caspian Institute of Biological Resources, Dagestan Federal Research Center, Russian Academy of Sciences, M. Gadzhieva St., 45, Makhachkala, Republic of Dagestan, 367000, Russia
Aida A. Abakarova - Senior Laboratory Assistant, Laboratory of Biochemistry and Biotechnology, Caspian Institute of Biological Resources, Dagestan Federal Research Center, Russian Academy of Sciences, M. Gadzhieva St., 45, Makhachkala, Republic of Dagestan, 367000, Russia, e-mail: aida. abaKarva@rambler. ru
ISSN 1026-2237 BULLETIN OF HIGHER EDUCATIONAL INSTITUTIONS. NORTH CAUCASUS REGION. NATURAL SCIENCE. 2020. No. 4
Аливердиева Динара Алиевна - кандидат биологических наук, заведующий лабораторией биохимии и биотехнологии, Прикаспийский институт биологических ресурсов Дагестанского федерального исследовательского центра РАН, ул. М. Гаджиева, 45, г. Махачкала, Республика Дагестан, 367000, Россия, e-mail: aliverdieva_d@mail.ru
Dinara A. Aliverdieva - Candidate of Biological Sciences, Head of the Laboratory of Biochemistry and Biotechnology, Caspian Institute of Biological Resources, Dagestan Federal Research Center, Russian Academy of Sciences, M. Ga-dzhieva St., 45, Makhachkala, Republic of Dagestan, 367000, Russia, e-mail: aliverdieva_d@mail.ru
Представлена информация о детерминантах жизнеспособности дрожжевых культур, культивируемых в виде колоний на твердом агаре в различных условиях этанольного стресса. Штаммы дрожжей, как правило, демонстрировали вместе с медленным ростом более высокую жизнеспособность. Установлено влияние различных концентраций этанола (6, 12, 18 %) и глюкозы (20 %) на морфофизиологические свойства дрожжей S. cerevisiae Y-503, S. cerevisiae DAW-За и S. oviformis М-12Х. Обнаружено, что Y-503 и DAW-За наиболее устойчивы к этанольному и осмотическому стрессу. Антагонистическое взаимодействие нескольких стрессоров наиболее наглядно отразилось на толерантности штаммов к этанолу+глюкозе. Фенотипические исследования показали, что штаммы имели стратегию выживания в неблагоприятных условиях в форме устойчивости к ингибитору - теллуриту калия (K2TeO3) - у Y-503, в большей степени - М-12Х. Обнаружена потребность DAW-3a в инозите, орнитине и лизине, М-12Х - в сорбите, инозите. Штаммы невосприимчивы к синтетическим антимикотикам широкого спектра действия - кетоконазолу и флукона-золу, однако антибиотик нистатин ингибировал их рост; в большей мере отмечена высокая чувствительность штамма М-12Х. Сравнительный анализ морфофизиологических параметров клеток и гигантских колоний изучаемых штаммов определил преимущество полиплоида Y-503 по выживаемости и толерантности к воздействию этанольного стресса. Результаты работы могут быть использованы в научных исследованиях и биотехнологиях различного назначения, основанных на использовании стрессоустойчивых дрожжей S. cerevisiae.
Ключевые слова: дрожжи, стресс, этанол, глюкоза, морфология, клетка, колонии.
The paper considers information on the determinants of the viability of yeast cultures cultivated in the form of giant colonies on solid agar under various conditions of ethanol stress. Yeast strains tends to show higher viability along with slow growth. The effect ofvarious concentrations of ethanol (6, 12, 18 %), glucose (20 %) on the morphophysiological properties of the yeast S. cerevisiae Y-503, S. cerevisiae DAW-3a and S. oviformis M-12X is revealed. It has been determined that Y-503 and DAW-3a are most resistant to ethanol and osmotic stress. The antagonistic interaction of several stressors most clearly affected the tolerance of the strains to all positions with "ethanol + glucose ". Phenotypic studies have found that the strains survival s trat-egy in adverse conditions in the form of resistance to potassium tellurite inhibitor (K2TeO3) in Y-503, to a greater extent in M-12X. A need for DAW-3a for inositol, ornithine, and lysine was detected; M-12X - sorbitol, inositol. The strains are unsusceptible to synthetic broad-spectrum antimycotics - ketoconazole and fluconazole. However, antibiotic nystatin inhibited their growth, and a high sensitivity of strain M-12X was noted to a greater extent. A comparative analysis of the morphophysiological parameters of cells and giant colonies of the studied strains determined the advantage ofpolyploid Y-503 in survival and tolerance to the effects of various types of stress. The results can be applied in scientific research and biotechnology for various purposes, based on the use of stress-resistant S. cerevisiae yeast.
Keywords: yeast, stress, ethanol, glucose, morphology, cell, colonies.
В последние годы предпринято много усилий, чтобы найти эволюционные пути для улучшения толерантности промышленных дрожжей к высоким концентрациям этанола в среде ферментации [1-3].
Для изучения проблемы выживаемости дрожжей в условиях стресса существуют различные методы исследований, большинство из которых на сегодняшний день сосредоточено на популяциях клеток, выращенных в периодических или непрерывных жидких культурах. Напротив, использование твердых питательных сред, предполагающее существование микробов в естественных условиях, связано со сложностью проведения эксперимента с длительным пространственным отслеживанием развития культуры [4]. В последнее десятилетие дрожжевые
колонии стали отличной моделью для изучения особенностей эволюционных и физиологических механизмов многоклеточных организмов [5], в том числе высокой пролиферации клеток [6], действия антагонистов и антибиотиков; дифференцирования клеток [7], поляризации, цитокинеза [8], хронологической продолжительности жизни, рака, скрининга лекарств [9] и др.
Известна уникальная информация о детерминантах жизнеспособности клеток высших эукариот, культивируемых в виде гигантских колоний на твердом агаре и жидких средах лабораторного ферментера или биореактора, в которых обеспечивается достаточное количество питательных веществ для удовлетворения энергетических потребностей [2, 10].
ISSN 1026-2237 BULLETIN OF HIGHER EDUCATIONAL INSTITUTIONS. NORTH CAUCASUS REGION. NATURAL SCIENCE. 2020. No. 4
Клетки в колониях подвергаются воздействию градиентов питательных веществ, продуктов метаболизма и газов, чья сложная пространственная и временная динамика приводит к дифференцированию культуры. Дрожжи, растущие в виде колоний на агаре, больше напоминают ткани многоклеточных организмов, чем дрожжи в жидкой культуре, и, как правило, демонстрируют вместе с медленным ростом более высокую жизнеспособность [2].
Ранее нами были проведены многочисленные исследования для поиска биохимически активных, толерантных к этанолу штаммов рода Saccharomyces с использованием жидких и твердых сред. Представлены данные воздействия различных концентраций этанола на морфофизиологические показатели S. cerevisiae Y-503 [11].
Принимая во внимание, что большинство промышленных процессов получения этанола осуществляется в жестких физико-химических условиях, предполагается использование различных экстремально устойчивых штаммов дрожжей, включая гибридные и рекомбинантные культуры.
Цель настоящих исследований - изучение влияния различных концентраций этанола в условиях твердых питательных сред на культурально-морфо-логические и биохимические свойства штаммов рода Saccharomyces, полученных в результате экстремальных физических и генетических воздействий.
Объекты исследований - штаммы дрожжей: гетерозиготный тетраплоид Saccharomyces cerevisiae Y-503, полученный в результате лазерного воздействия на промышленный гибридный штамм S. cerevisiae 73 [12]; гетероталличный гаплоид Saccharomyces cerevisiae DAW-За - потомок линии Y-503; Saccharomyces oviformis M-12X - полученный в результате мутагенного действия холода сверхнизких температур на штамм S. cerevisiae М-12 [13] из коллекции лаборатории биохимии и биотехнологии ПИБР ДФИЦ РАН и Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика (Россия). Принадлежность S. cerevisiae Y-503 и S. cerevisiae DAW-За к таксону Saccharomyces показана с помощью молекулярно-генетических методов [14].
Инкубацию микроорганизмов осуществляли в микробиологическом термостате Binder-115 (США) при рабочей температуре 30 °С. Для культивирования дрожжей использовали твердую среду YPD. Её состав, %: дрожжевой экстракт - 0,5 (BD, США), пептон - 0,5 (BD, США), D-глюкоза - 2,0 (Merk, Германия), агар-агар - 2,5 (Difco, Нидерланды). Взвешивание субстратов осуществляли на аналитических весах DV215CD (Ohaus Discovery, Швейцария). Для получения агаризованных сред использо-
вали агар (Difco, Испания); кислотность среды рН 4,5 корректировали 1N HCl или 4M KOH (Россия) на рН-метре Hanna Instrumentals pH 211 (Германия).
Питательную среду Сабуро для культивирования дрожжей, определения чувствительности к антибиотикам и теллуриту калия готовили из сухой среды готового набора реагентов промышленного производства в соответствии с инструкцией изготовителя (ФБУН «ГНЦПМиБ», Россия). Её состав, г/л: панкреатический гидролизат рыбной муки - 10,0, панкреатический гидролизат казеина - 10,0, дрожжевой экстракт - 2,0, натрия фосфат однозамещенный -2,0, d-глюкоза - 40,0, агар - 10,0±3,0; рН 6,0±0,3. Для приготовления среды Сабуро с теллуритом калия (K2TeO3) использовали готовую среду, как описано выше, с дополнительным внесением 5 мл 2-%-го раствора соли / 1 л среды.
Морфологический анализ клеток и их фотографирование осуществляли с помощью светового микроскопа СХ21 FS1 (Olympus, Япония) и цифровой фотокамеры Power Shot A640 (Canon, Япония). Основным критерием для определения морфотипов колоний служили признаки: форма, пигментация, окраска, поверхность, профиль, край, структура.
Стрессоустойчивость дрожжей к различным концентрациям этанола (6, 12, 18 %) и глюкозы (20 %) определяли при культивировании на агаровой среде YPD в чашках Петри в течение 10 сут. Этанол вносили в питательную среду глубинным методом параллельно в две стерильные чашки Петри, заливали расплавленной и охлажденной (до 45±1 °С) средой; высота слоя 4-5 мм. Среду немедленно равномерно перемешивали круговыми движениями; при её затвердении чашки переворачивали вверх дном и ставили в термостат на одни сутки при 30 °С.
Чувствительность к различным субстратам, противогрибковым препаратам (кетоконазол, флукона-зол, нистатин) изучали диско-диффузионным методом, используя стандартные диски «Системы индикаторные бумажные для идентификации микроорганизмов» НПО «Микроген» холдинга «Нацимбио» (Россия) с 10-30 мкг антимикробного агента, и замером зон отсутствия роста [15]. Способность к продуцированию ферментов уреазы (КФ 3.5.3.1), окси-дазы (КФ 1.4.3.3) и ß-галактозидазы (КФ 3.2.1.23) определяли, используя экспресс-тесты для исследования ферментативной активности микроорганизмов (MERCK, Германия).
Исследования морфологии колоний выполнены в 3-кратной повторности одним экспериментатором для обеспечения достоверности.
При исследовании толерантности дрожжей к воздействию этанола определенное внимание уделено вопросам фенотипических свойств культур (табл. 1).
ISSN 1026-2237 BULLETIN OF HIGHER EDUCATIONAL INSTITUTIONS. NORTH CAUCASUS REGION. NATURAL SCIENCE. 2020. No. 4
Таблица 1
Фенотипические признаки штаммов S. cerevisiae Y-503, S. cerevisiae DAW-3a и S. oviformis М-12Х / Phenotypic signs of strains of S. cerevisiae Y-503, S. cerevisiae DAW-3a, S. oviformis M-12X
Штамм
Тест S. cerevisiae S. cerevisiae S. oviformis
Y-503 DAW-3a М-12Х
Отно- 5, 10, 15, 20 5, 10, 15, 20
шение (опт. 5) (опт. 5) н
к №01, % [16, 17] [16, 17]
3,0; 4,5; 7,0; 3,0; 4,5; 7,0; 2,9-3,6; 4,5
пН 9,0; 11,0 9,0; 11,0 (опт. 3-4)
(опт. 4,5) (опт. 4,5)
[16, 17] [16, 17] [18]
Темпера- 28-30; 37 28-30; 37 20-24; 28-30
тура, оС (опт. 30) (опт. 30) (опт. 24, 30)
Малонат
натрия
Сорбит - - +
Инозит - + +
Орнитин - + -
Лизин - + -
Глюкоза + + +
Уреаза - - -
Р-галакто-
зидаза
Оксидаза - - -
Примечание. «-» - отсутствие активности или потребления; «+» - активность, потребление; «н» - не изучено. В каждом столбце обозначены статистически значимые значения в 3-кратной повтор-ности (одновременно).
Как установлено ранее, штаммы S. cerevisiae Y-503 и S. cerevisiae DAW-3a толерантны к воздействию 5-20-%-му NaCl при рН 4,5 и температуре 30 оС [16, 17]. Результаты исследований продемонстрировали резистентность культур по отношению к ингибитору сукцинат-дегидрогеназного комплекса дыхательной цепи - малонату натрия; утилизацию глюкозы в качестве источника углерода и энергии. Следует отметить способность штамма DAW-За, в отличие от родительского Y-503, усваивать инозит (витамин В8), орнитин и лизин, М-12Х - инозит и сорбит (табл. 1).
Считается, что этанольный стресс активирует внутриклеточный сигнальный путь UPR (unfolded protein response), регулирующий сотни генов, ответственных за функционирование эндоплазматиче-ского ретикулума, состав липидов и текучесть мембран, в том числе гена INO1. При этом известно влияние инозита на активацию UPR-пути и изменение состояния липидов мембран [19]. По нашим данным, штаммы DAW-3a и М-12Х (табл. 1) способны потреблять инозит в составе питательной среды, что особенно важно в условиях этанольного стресса.
Как известно, микробиальное загрязнение при ферментативных процессах синтеза этанола происходит закономерно дикими дрожжами и грамполо-жительными бактериями из семейства Lacto-bacШaceae, которые во время спонтанного брожения конкурируют за факторы роста, необходимые дрожжам; синтезируют значительное количество органических кислот; выделяют орнитин, подавляющий спиртовое брожение. Для лабораторных штаммов 5". cerevisiae, в основном являющихся производными штамма 5. cerevisiae S288с, наиболее предпочтительным источником азота является глу-тамин, но наряду с ним они могут использовать соли аммония, пролин, мочевину, орнитин, аллантоин [20]. В этом случае данные табл. 1 свидетельствуют, что штамм 5. cerevisiae DAW-3a обладает преимуществом, активно используя орнитин.
Ферментирующие дрожжи могут также продуцировать алифатическую незаменимую аминокислоту лизин, обладающую потенциальной способностью ингибировать некоторых представителей молочнокислых бактерий [21]. Очевидно, что лизин как дополнительный источник азота не был востребован 5. cerevisiae У-503 и 5. oviformis М-12Х (табл. 1), так как штаммы способны сами его синтезировать. Имеются данные, что в процессе получения этанола наибольшее накопление незаменимых аминокислот в биомассе штаммов Y-503 и М-12Х приходилось на валин, лейцин, изолейцин, тирозин и лизин [18, 22].
Способность штаммов к продуцированию ферментов уреазы (КФ 3.5.3.1), оксидазы (КФ 1.4.3.3) и Р-галактозидазы (КФ 3.2.1.23) не обнаружена.
Принимая во внимание, что вопросы микробной контаминации бродильных производств продолжают оставаться актуальными [23], нами была изучена чувствительность штаммов Y-503, DAW-3a и М-12Х к противогрибковым препаратам широкого спектра действия (табл. 2).
Используемые препараты, как известно, инги-бируют развитие грибов за счет нарушения биосинтеза мембранных липидов, где эргостерол, обеспечивающий целостность и текучесть мембран, представляет биохимическую мишень повреждающего действия. Обнаружена резистентность штаммов к синтетическим антимикотикам II поколения - ке-токоназолу, III поколения - флуконазолу (за исключением полиенового антибиотика природного происхождения - нистатина). Зоны ингибирования культур Y-503 и DAW-3a нистатином на среде Са-буро визуально четко различимы и почти идентичны. Отмечена высокая чувствительность штамма М-12Х к антибиотику по сравнению с другими культурами (табл. 2).
ISSN 1026-2237 BULLETIN OF HIGHER EDUCATIONAL INSTITUTIONS. NORTH CAUCASUS REGION. NATURAL SCIENCE. 2020. No. 4
Таблица 2
Чувствительность штаммов S. cerevisiae Y-503, S. cerevisiae DAW-3a и S. oviformis М-12Х к различным противогрибковым препаратам / The sensitivity of the strains S. cerevisiae Y-503, S. cerevisiae DAW-3a and S. oviformis M-12X to various antifungal drugs
Противогрибковый препарат Штамм
Зона действия, мм
S. cerevisiae Y-503 S. cerevisiae DAW-3a S. oviformis М-12Х
Кетоконазол - - -
Нистатин 4 5 10
Флуконазол - - -
Примечание. «-» - отсутствие роста.
Изучение морфологических характеристик колоний штаммов Y-503 и DAW-3a на среде Сабуро обнаружило достаточно хороший рост, в отличие от М-12Х, с характерной для культур окраской (рис. 1а, б, в). Установлены следующие отличия: 5". cerevisiae У-503 - обильный сплошной рост широких штрихов колоний с волнистым краем, сливочного цвета с блеском; 5. cerevisiae DAW-3a - рост скудный по сравнению с У-503, штрихи более узкие, светло-бежевого цвета с блеском; 5. oviformis М-12Х - рост четковидный, 3 круглые, выпуклые и 2 диффузные колонии палевого цвета с блеском.
Исследования толерантности микроорганизмов к потенциально токсичным металлам в последние годы получили особую актуальность. Металлорезистент-ные микробные штаммы часто проявляют способность предотвращать или уменьшать проникновение токсичных металлов в клетку [24]. Имеются данные о способности отдельных представителей дрожжей 5. cerevisiae к детоксикации теллурита, связанной с ци-тозольным вакуолярным компартаментом и вакуо-лярной Н-АТФазой. Сообщается о превращении тел-лурита в летучие метилированные формы бактериями и грибами; восстановлении теллура, которое проявляется в виде черных отложений внутри или снаружи клетки. Устойчивость к токсичным соединениям за
счет их перевода в менее токсичную форму может определять стратегию выживания микроорганизмов в неблагоприятных условиях [25, 26].
Возник интерес, насколько чувствительны изучаемые штаммы в присутствии ингибитора - теллу-рита калия в среде. На среде Сабуро с добавлением теллурита характер роста культур изменился: вместо сплошного обильного роста штрихов на поверхности среды (рис. 1а, б, в) отчетливо выделялись круглые, выпуклые колонии, особенно крупные у Y-503 (рис. 1г, д, е). Штамм Y-503 формировал колонии в виде капель жемчужного цвета с заметным потемнением, у М-12Х - в очень мелких белых прозрачных колониях это особенно отражено. На среде Сабуро с теллуритом, как и без него, штамм М-12Х существенно отличался от других культур по площади и размеру колоний. Поведение штамма, полученного в результате мутагенного действия сверхнизких температур, в условиях различных видов стресса требует отдельного серьезного изучения. В колониях обоих штаммов участки сплошного роста не окрашены. Известно, что высокочувствительные штаммы дрожжей могут накапливать значительное количество теллурита в клетке, но, обладая низкой способностью к детоксикации, иметь неокрашенные колонии [27]. В мелких колониях молочного цвета,
л
а / а
б / b
в / c
г / d
Д / e
е / f
Рис. 1. Рост штаммов на среде Сабуро: а - S. cerevisiae Y-503; б - S. cerevisiae DAW-3a; в - S. oviformis М-12Х; на среде Сабуро с теллуритом калия: г - S. cerevisiae Y-503; д - S. cerevisiae DAW-3a; е - S. oviformis М-12Х / Fig. 1. The growth of strains in Sabouraud media: а - S. cerevisiae Y-503; b - S. cerevisiae DAW-3a;
c - S. oviformis М-12Х; in Sabouraud media with potassium tellurite: d - S. cerevisiae Y-503; e - S. cerevisiae DAW-3a; f - S. oviformis М-12Х
ISSN 1026-2237 BULLETIN OF HIGHER EDUCATIONAL INSTITUTIONS. NORTH CAUCASUS REGION. NATURAL SCIENCE. 2020. No. 4
образованных штаммом DAW-3a, отсутствовали признаки потемнения, что указывало на повышенную чувствительность последнего. Результаты исследований штаммов Y-503 и М-12Х по отношению к ингибитору определили их наибольшую устойчивость к стрессовым условиям.
Следующим этапом исследований было изучение влияния различных концентраций этанола на морфолого-культуральные свойства дрожжей S. cerevisiae Y-503, S. cerevisiae DAW-3a и S. oviformis M-12X. В течение 10 сут колонии как многоклеточные организмы дифференцировались; осуществляли медленную и устойчивую диффузию питательных веществ, что позволяло клеткам штаммов постепенно увеличивать популяцию. Контролем для серии опытов с этанолом служил вариант колонии со стандартной средой YPD без добавок, содержащей в том числе 2 % глюкозы (рис. 2а).
Согласно предыдущим экспериментам, штамм Y-503 на жидких мелассных пита- а/а тельных средах синтезировал до 8,1, 9,5, 12,0 % этанола [28, 29], М-12Х на виноградном сусле - 12,0-12,8 % этанола [13]. Штамм DAW-За никогда не изучался на предмет влияния этанола. Исследование воздействия различных концентраций этанола на морфо-физиологические свойства указанных штаммов, выращенных на твердых питательных средах YPD, проведено впервые. Характер образования колоний и их морфология 6 % этанол отражены на рис. 2 и в табл. 3. Показано, что размер колоний М-12Х и DAW-3a при концентрации 6 % этанола в среде уменьшился на 6,8 и 24,5 % по отношению к контролю (0 % этанола), а для Y-503, напро- . ^ тив, увеличился на 8,3 %.
Выявлено, что культуры Y-503 и DAW-За достаточно 2п % г+6 % этанола
толерантны к 12-%-му этанолу в среде, диаметр колоний снизился по сравнению с контролем на 10,0 и 23,1 % соответственно. Напротив, М-12Х оказался менее вос-
X
б / b
приимчив к данной концентрации - увеличение размера колонии составило 18,2 % (рис. 2б).
Как и следовало ожидать, с увеличением концентрации этанола скорость роста клеток в колониях штаммов закономерно уменьшалась. Использование 18-%-го этанола в среде культивирования стало причиной уменьшения размеров колоний штаммов DAW-3а и Y-503 на 23,1 и 26,7 % по сравнению с контролем. Для роста колоний М-12Х данная концентрация этанола оказалась критической - снижение размеров на 59,1 %. На протяжении всего эксперимента У-503 и М-12Х сохраняли форму цветка, в отличие от DAW-3а, имеющего колонию округлой формы при 12 % этанола в среде.
Процесс получения этанола предполагает повышенное содержание углеводов в среде ферментации. Представляло интерес выяснить, как поведут себя
V
0 % iralio.la
<ч
мг»
12 % ланола
и»»-*
18 % л анола
Î
в /с
20 % Г+12 % ланола
«MA*
20 % Г+l 8 % этанола
Рис. 2. Морфология колоний штаммов S. cerevisiae Y-503, S. cerevisiae DAW-3a и S. oviformis M-12X при воздействии различных значений этанола и глюкозы: а - исходная культура (контроль); б - этанол; в - этанол+глюкоза. Масштабная линейка 1 мм / Fig. 2. Morphology of colonies of strains S. cerevisiae Y-503, S. cerevisiae DAW-3a and S. oviformis M-12X when exposed to various values ethanol and glucose: а - original culture (control); b - ethanol; с -ethanol+glucose.
Scale bar is 1 mm
ISSN 1026-2237 BULLETIN OF HIGHER EDUCATIONAL INSTITUTIONS. NORTH CAUCASUS REGION. NATURAL SCIENCE. 2020. No. 4
дрожжи на твердых средах с различными концентрациями этанола при внесении мажорного в условиях эксперимента количества глюкозы (20 %), обычно используемого при производстве этанола.
В литературе имеются сведения, что гиперосмотический стресс, возникающий в результате высоких концентраций этанола и сахара, приводит к снижению пролиферации и жизнеспособности дрожжевых клеток [27, 30]. Контролем для серии опытов этанол+глюкоза (рис. 2в) являлись варианты с 6-1218 % этанола (рис. 2б). Добавление 20 % глюкозы в контрольную среду без этанола оказалось стрессовым только для DAW-3a - размер колонии уменьшился на 23,1 %; для Y-503 и М-12Х, напротив, увеличился на 19,2 и 18,2 % соответственно (табл. 3). Однако сочетание компонентов 6 % этанола+20 % глюкозы в среде замедлило метаболизм штаммов Y-503, DAW-3a и М-12Х, и соответственно, размер колоний уменьшился на 7,7, 18,5 и 25,5 %.
Использование 12 % этанола+20 % глюкозы сократило размер колоний Y-503, DAW-3a и М-12Х на 16,7, 41,8 и 4,8 %. Соответствующие условия, как и в варианте с 12 % этанола, в большей степени отрицательно сказались на жизнеспособности DAW-3a. Надо полагать, что осмотический потенциал в среде, вызванный высоким содержанием глюкозы, способен увеличить воздействие этаноль-ного стресса [31], что мы и наблюдали у штамма DAW-3а (рис. 2в).
Сочетание двух стресс-факторов с повышенной концентрацией 18 % этанола+20 % глюкозы не способствовало подавлению жизнедеятельности штаммов, в большей степени это касалось М-12Х, размер колонии которого увеличился на 88,9 %. Как показали результаты эксперимента, генетическая стратегия выживания штамма М-12Х неожиданно проявилась как при воздействии теллура, так и в условиях повышенного значения стресс-факторов. При этом размер колонии Y-503 уменьшился на 4,5 %, DAW-3а - 12,7 % по сравнению с вариантом 18 % этанола без глюкозы в среде (рис. 2б, в; табл. 3).
В целом данные эксперимента показали, что максимальная скорость роста колоний установлена для У-503 - на среде с 6 % этанола и 6 % этанола+20 % глюкозы, DAW-3а - с 0 % этанола и 6 % этанола+20 % глюкозы, М-12Х - 12 % этанола и 12 % этанола+20 % глюкозы (рис. 2, табл. 3). Обнаружено, что уменьшение размеров колоний по сравнению с контролем в первой серии опытов можно расположить в следующей последовательности усредненных данных: 18,4:23,6:38,0 %, Y-503:DAW-3а:М-12Х. Для серии этанол+глюкоза процент уменьшения размера колоний был также минималь-
ным для штамма У-503 (9,6:15,5:24,3 %, У-503:М-12Х:DAW-3а). Между тем отмечено некоторое увеличение колоний Y-503 на среде с 6 % этанола, а для М-12Х - на средах с 18 % этанола и 18 % этанола+20 % глюкозы соответственно. Таким образом, дополнительное использование глюкозы в условиях этанольного стресса не увеличивает размер колоний, но и не ингибирует рост клеток, а в случае с М-12Х с мажорным содержанием этанол+глюкоза значительно активирует метаболизм. Примечательно, что колонии М-12Х приобретают округлую форму с ровными краями, которая характерна для штамма на виноградном и солодовом сусло-агаре.
Необходимо заметить также, что на средах с 18 % этанола и этанол+глюкоза (рис. 2б, в) возникли разломы, которые не были обнаружены на средах без этанола (рис. 2а) или с его меньшим количеством (рис. 2б). Рост дрожжевой биомассы в разломах не обнаружен.
В литературе имеются сведения о воздействии повышенных концентраций этанола на проницаемость клеточных мембран. Это создаёт условия для увеличения притока протонов (снижение рН в цитозоле до токсичных уровней), денатурации белков, повышения уровня активных форм кислорода, окислительного стресса, при котором уменьшается доступность воды, вызывая обезвоживание [32-34]. Возможно, в условиях данного эксперимента мажорная концентрация этанола и одновременное воздействие двух стресс-факторов могли привести к изменению метаболизма и формированию пространственно-временной архитектуры колоний культур таким образом, что это спровоцировало определенное накопление продуктов метаболизма, обезвоживание и, как следствие, разломы среды.
Кроме того, что в вариантах этанол+глюкоза структурированные колонии штаммов Y-503 и DAW-3a приобретают форму звездочек или цветка со стрелками. Известно, что клетки дрожжей, растущие в колониях на твердых питательных средах, способны передавать питательные вещества из центральной части на периферию. Запрограммированная гибель центральных клеток может способствовать общему выживанию сообщества колонии, причем клетки нижнего (по вертикали) слоя обладают более высокой дыхательной способностью, чем верхнего [9, 35]. Таким образом, формирование колониальных структур штаммов позволяет более эффективно перераспределять ресурсы между клетками в пределах колонии, создавая при этом сложные внешние формы.
te;
о
б
Таблица 3
Морфология колоний и клеток дрожжей S. cerevisiae Y-503, S. cerevisiae DAW-За и S. oviformis M-12X на средах с различным содержанием этанола и глюкозы / Morphology of colonies and cells of the yeast S. cerevisiae Y-503, S. cerevisiae DAW-За and S. oviformis M-12X
on media with different contents of ethanol and glucose
о
3
I 0
g
В
5 £
I
I g
^
s?
1 H
I s
tc; §
it? I
cq
Среда
Характеристика колонии YPD (контроль) YPD+6 % YPD+12 % YPD+18 %
Б. сегеугэше У-503 Б. сегеушае БАШ-За Б. оп/оппгэ М-12Х Б. сегеушае У-503 Б. сегеушае БАШ-За Б. оп/оппгэ М-12Х Б. сегеушае У-503 Б. ст/оггтй БАШ-За Б. оп/оппгэ М-12Х Б. сегеугэше У-503 Б. сегеугэше БАШ-За Б. ом/огтю М-12Х
Размер, см (А) 1,00x1,20 1,10x1,30 0,80x1,10 1,00x1,30 0,90x1 ДО 0,85x1,10 0,90x1,20 1,05x1,05 0,80x1,30 0,80x1,10 1,00x1,10 0,60x0,60
Размер,см (Б) 1,10x1,30 1,00x1,10 0,80x1,30 1,00x1,20 0,80x1,10 0,70x1,00 0,90x1,00 0,75x0,85 0,90x1,10 0,80x1,05 0,80x1,20 0,80x0,85
Форма (А) В виде цветка В виде цветка неправильной формы В виде цветка неправильной формы В виде цветка В виде цветка В виде цветка В виде цветка Округлая В виде цветка неправильной удлиненной формы В виде цветка неправильной формы В виде цветка В виде цветка
Цвет (А) Молочно-кремовый Молочно-кремовый Молочно-кремовый Светло-бежевая с розовинкой Светло-бежевая с розовинкой Светло-бежевая с розовинкой Бежевая Бежевая Бежевая с розовинкой Бежевая Бежевая Бежевая
Поверхность (А) Матовая, радиально исчерченная Матовая, радиально исчерченная Матовая, радиально исчерченная Матовая с легким блеском, радиально исчерченная Матовая с легким блеском, радиально исчерченная Матовая с легким блеском, радиально исчерченная Матовая с легким блеском, радиально исчерченная, 3 тонких концентрических круга Матовая с легким блеском, радиально исчерченная Матовая с легким блеском, радиально исчерченная Матовая, радиально исчерченная Матовая, радиально исчерченная Матовая, радиально исчерченная
Профиль (А) Слабый кратер с приподнятым центром Слабый кратер с приподнятым центром Плоский с приподнятым центром Плоский маленький кратер Плоский с приподнятым центром Плоский Плоский с приподнятым центром Плоский с приподнятым центром Плоский с приподнятым центром Плоский с приподнятым центром Плоский с приподнятым центром Плоский с приподнятым центром
Край (А) Фестончатый Фестончатый Фестончатый Волнистый / фестончатый Волнистый / фестончатый Волнистый / фестончатый Волнистый / фестончатый Слегка волнистый Волнистый / фестончатый Несколько волнистый Волнистый / фестончатый Волнистый / фестончатый
Морфология клеток (А) 4-7x6-12, 5x5 цкм; почкующиеся 11,3% 2-5x4-7, 3x3, 4x4,5x5,6x6, 7x7, (единицы 10x10) цкм; почкующиеся 18,3 % 2-6x5-12, 5x5,6x6,8x8, 9x9 цкм; почкующиеся 20,7% 3-8x3-11 цкм; почкующиеся 17,3 % 2-3x2-6,2x2, 3x3,4x4,5x5, 6x6, (единицы 7x7) цкм; почкующиеся 16,8 % 2-6x3-8,2x2, 3x3,4x4,5x5, (единицы 7x7) цкм; почкующиеся 52,6 % 2-7x4-10 цкм; почкующиеся 34,1 % 2x2,3x3,3x4, 4x4,4x5,5x5 (единицы 6x6) цкм; почкующиеся 8,8 %, имеются цепочки почкующихся 2x2,3x3,4x4, 4x5,5x5, (единицы 7x8) цкм; почкующиеся 22,4 % 3-6x3-8 цкм; почкующиеся 14,5 % 2x2,2x3,3x3, 3x4,4x4 цкм; неотделимые почкующиеся клетки 2x2,3x3,3x4, 3x5,4x4,5x5, 5x6, (единицы 3x7,) цкм; почкующиеся 14,0 %, имеются цепочки почкующихся
Примечание: А - колонии и клетки на питательной среде УРЭ с различными концентрациями этанола; Б - колонии на питательной среде УРЭ с различными концентрациями этанола+20 % глюкозы.
ISSN 1026-2237 BULLETIN OF HIGHER EDUCATIONAL INSTITUTIONS. NORTH CAUCASUS REGION. NATURAL SCIENCE. 2020. No. 4
а / а
б / b
в / c
г / d
w
■
lAr
ш 0
' ш ш
.•о
S. cerevisiae DAW-3a
О О
S. oviformis M-12X
Рис. 3. Морфология клеток штаммов S. cerevisiae Y-503, S. cerevisiae DAW-3a, S. oviformis M-12X: a - исходные клетки; б - в присутствии 6 % этанола; в - 12 % этанола; г - 18 % этанола. Световая микроскопия, увеличение х600 / Fig. 3. The morphology of cells of strains S. cerevisiae Y-503, S. cerevisiae DAW-3a, S. oviformis M-12X: a - the original cells; b - in the presence of 6 % ethanol; с - 12 % ethanol; d - 18 % ethanol. Light microscopy, increase x600
ISSN 1026-2237 BULLETIN OF HIGHER EDUCATIONAL INSTITUTIONS. NORTH CAUCASUS REGION. NATURAL SCIENCE. 2020. No. 4
Как правило, воздействие различных концентраций этанола нарушает проницаемость и липидный состав клеточных мембран, вызывает задержку клеточного цикла [36], что приводит к изменению роста и размеров клеток. Тенденция к уменьшению размеров клеток на всех этапах эксперимента продемонстрирована в табл. 3 и рис. 3. Доминирующая форма клеток штамма Y-503 при всех значениях этанола -округло-овальная или овально-округлая, редко -округлая (6 % этанола) или овальная (12 % этанола). Для штамма DAW^ характерна округлая форма (за исключением редких овальных клеток в исходной культуре). Для М-12Х - в основном округлые клетки, причем в исходных - округлые и округло-овальные составлял 50/50, встречались овальные (6 % этанола) и яйцеобразные (12 % этанола).
Внесение 6-%-го этанола в среду обнаружило накопление большого количества включений, в редких клетках штаммов выявлены вакуоли, причем для штамма М-12Х это соотношение составляет 50/50. При 12 % этанола вакуоли встречаются исключительно в культуре М-12Х. По мере накопления этанола с 6 до 18 % в среде в клетках штаммов прослеживалось утолщение внешней оболочки, увеличение включений в виде запасных питательных веществ, исчезновение вакуолей (рис. 3б, в, г).
Вопросы исследователей, касающиеся влияния почкования на рост колоний, на сегодняшний день остаются нерешенными. Как следует из табл. 3, максимальное число почкующихся клеток (ПК) выявлено у штаммов: Y-503 - на среде с 12 % этанола; DAW-3a - 0 % этанола; М-12Х - 6 % этанола. Для всех культур отмечена закономерность - количество ПК уменьшается с увеличением концентрации этанола. Для штамма Y-503 показано уменьшение ПК при увеличении этанола как в жидких [11], так и твердых питательных средах. Отмечена тенденция к увеличению количества ПК до 12 % этанола в среде при культивировании штаммов Y-503 и М-12Х. Напротив, для DAW-3а - снижение ПК на всех средах с этанолом. Наряду с этим выявлены цепочки из неотделившихся после почкования клеток на средах: 12 и 18 % этанола - у штаммов М-12Х, 18 % этанола - DAW^.
В заключение необходимо отметить, что в условиях этанольного стресса на твердых питательных средах все штаммы S. cerevisiae Y-503, S. cerevisiae DAW^ и S. oviformis М-12Х имели собственную стратегию выживания, обусловленную их функциональным состоянием, причем Y-503 обладал большей жизнеспособностью, что, возможно, связано с плоидностью культуры [14]. Штамм М-12Х проявил себя в условиях различных стрессов достаточно резистентным, не уступая гаплоиду DAW-3 a.
Штамм DAW-За лучше адаптировался на средах с этанолом, М-12Х - этанол+глюкоза. Толерантность исследуемых штаммов к различным значениям этанола наглядно продемонстрировала такие морфолого-культуральные особенности, как характер изменения клеток и гигантских колоний. Изучение адаптации дрожжей в условиях этанольного стресса на твердых питательных средах особенно важно для понимания механизмов функционирования клеточных культур и дальнейшего их применения в различных биотехнологических процессах.
Литература
1. Caspeta L., Castillo T., Nielsen J. Modifying yeast tolerance to inhibitory conditions of ethanol production processes. Review // Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 2015. Vol. 3. P. 184-195. Doi: 10.3389/fbioe.2015.00184.
2. Zhang Q., Jin Y.F., Fang Y., Zhao H. Adaptive evolution and selection of stress-resistant Saccharomyces cerevisiae for very high-gravity bioethanol fermentation // Electronic J. of Biotechnology. 2019. Vol. 41. P. 88-94. Doi: 10.1016/j.ejbt.2019.06.003.
3. HelalatH.S., Bidaj S., Samani S., MoradiM. Producing alcohol and salt stress tolerant strain of Saccharomyces cerevisiae by heterologous expression of pprI gene // Enzyme and Microbial Technology. 2019. Vol. 124. P. 17-22. Doi: 10.1016/j.enzmictec.2019.01.008.
4. Palkovâ Z., Vâchovâ L. Life within a community, benefit to yeast long-term survival // FEMS Microbiol. Review. 2006. Vol. 30, iss 5. P. 806-824. Doi: 10.1111/j .1574-6976.2006.00034.x.
5. OpalekM., Wloch-Salamon D. Aspects of multicel-lularity in Saccharomyces cerevisiae yeast: a review of evolutionary and physiological mechanisms. Review // Genes (Basel). 2020. Vol. 11, iss. 6. P. 690. Doi: 10.3390/genes11060690.
6. Koschwanez J.H., Kevin R. Foster K.R., Andrew W. Murray A. W. Correction: sucrose utilization in budding yeast as a model for the origin of undifferentiated multicel-lularity // PLOS Biology. 2011. Vol. 9, iss. 8. Р. e1001122. Doi:10.1371/journal.pbio.1001122.
7. Vâchovâ L., Câp M., Palkovâ Z. Yeast colonies: a model for studies of aging, environmental adaptation, and longevity. Review // Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2012. P. 1-8. Doi: 10.1155/2012/601836.
8. Wang Y., Lo W.-C., Chou C.-S. A modeling study of budding yeast colony formation and its relationship to budding pattern and aging // PLOS computational biology. 2017. Vol. 13, iss. 11. Р. e1005843. Doi:10.1371/jour-nal.pcbi.1005843.
9. Gulli J., Cook E., Kroll E., Rosebrock A., Caudy A., Rosenzweig F. Diverse conditions support near-zero growth in yeast: Implications for the study of cell lifespan // Microbiol Cell. 2019. Vol. 6, iss. 9. P. 397-413. Doi: 10.15698/mic2019.09.690.
ISSN 1026-2237 BULLETIN OF HIGHER EDUCATIONAL INSTITUTIONS. NORTH CAUCASUS REGION. NATURAL SCIENCE. 2020. No. 4
1G. Reis V.R., Bassi A.P.G., Silva J.C.G., Ceccato-An-tonini S.R. Characteristics of Saccharomyces cerevisiae yeasts exhibiting rough colonies and pseudohyphal morphology with respect to alcoholic fermentation // Brazilian J. of Microbiology. 2G13. Vol. 44, iss. 4. P. 1121-1131. Doi: 1G.159G/S1517-B3B22G14GG5GGGG2G.
11. Xалилова Э.А., Абрамов Ш.А., Котенко С.Ц., Исламмагомедова Э.А. Влияние стимулятора биосинтеза этанола - геотермальной воды на морфофизиоло-гические особенности дрожжей Saccharomyces cere-visiae в различных условиях культивирования // Хранение и переработка сельхозсырья. 2010. № S. С. 44-4б.
12. А.с. № 12S499S. 09.04.19S5. Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae Y-5G3, используемый в производстве хлебобулочных изделий. Абрамов Ш.А., Котен-ко С.Ц., ДалгатоваБ.И., Маммаев А.Т., Пейсахова Д.С.
13. А.с. № 1104149. 21.G3.19B3. Штамм дрожжей Saccharomyces oviformis М-12Х, используемый для производства шампанских виноматериалов и столовых вин. Абрамов Ш.А., Котенко С.Ц., Макуев А.-С.М., Власова О.К., Нахшунов Р.И.
14. Аливердиева Д.А., Мамаев Д.В., Лагутина Л.С., Шольц К.Ф. Особенности изменения содержания субстратов эндогенного дыхания в клетках Saccharomyces cerevisiae при низкой температуре // Биохимия. 2GG6. Т. 71, вып. 1. С. 50-5B.
15. МУК 4.2.1S90-04 Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам: метод. указания. М.: Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004. 91 с.
16. Xалилова Э.А., Исламмагомедова Э.А., Котенко С.Ц., ГасановР.З., АбакароваА.А., АливердиеваДА. О морфологических свойствах штамма S. cerevisiae Y-5G3 в условиях осмотического, температурного и кислотного стресса // Изв. Самарского науч. центра РАН. 2019. Т. 21, № 2 (2). С. 132-14G.
17. Исламмагомедова Э.А., Xалилова Э.А., Котенко С.Ц., Гасанов Р.З., Абакарова А.А., Аливердиева Д.А. Изменение морфологических свойств дрожжей S. cerevisiae в условиях стресса // Изв. Самарского науч. центра РАН. 2019. Т. 21, № 2 (2). С. 1G1-1G7.
1B. Исламмагомедова Э.А., Xалилова Э.А., Котен-ко С.Ц. Некоторые физиолого-биохимические свойства штамма Saccharomyces oviformis М-12Х в зависимости от условий культивирования // Производство спирта и ликероводочных изделий. 2011. № 1. С. 13-15.
19. Navarro-Tapia E., Querol A., Pérez-Torrado R. Membrane fluidification by ethanol stress activates unfolded protein response in yeasts // Microb Biotechnol. 2G1B. Vol. 11, iss. 3. P. 465-475. Doi: 1G.1111/1751-7915.13G32.
2G. Magasanik B., Kaiser C.A. Nitrogen regulation in Saccharomyces cerevisiae // Gene. 2GG2. Vol. 29G, iss. 12. P. 1-1B. Doi: 1G.1G16/SG37B-1119(G2)GG55B-9.
21. Kim J.S., Daum M.A., Jin Y.S., Miller M.J. Yeast Derived LysA2 Can Control Bacterial Contamination in Ethanol Fermentation // Viruses. 2G1B. Vol. 1G, iss. 2B1. Р. 1-16. Doi: 1G.339G/v1GG6G2B1.
22. Халилова Э.А., Исламмагомедова Э.А., Котенко С.Ц. Некоторые особенности азотного обмена в метаболизме дрожжей Saccharomyces cerevisiae Y-503 на питательной среде с геотермальной водой фенольного класса // Производство спирта и ликероводочных изделий. 2011. № 2. С. 9-12.
23. Fadel M., Zohri A.N.A., El-Heeny M.S., Abdel A.A.M. Managing of bacterial contamination in alcoholic fermentation of sugar cane molasses // Asian J. of Science and Technology. 2018. Vol. 9, iss. 1. Р. 7383-7391.
24. Gadd G.M., White C. Removal of thorium from simulated acid process streams by fungal biomass // Biotechnology and bioengineering. 1989. Vol. 33, iss. 5. P. 592-597. Doi: 10.1002/bit.260330512.
25. Gharieb M.M., Gadd G.M. Evidence for the involvement of vacuolar activity in metal (loid) tolerance: vacuolar-lacking and -defective mutants of Saccharomyces cerevisiae display higher sensitivity to chromate, tellurite and selenite // Biometals. 1998. Vol. 11. P. 101-106. Doi: 10.1023/A:1009221810760.
26. Chasteen T.G., FuentesD.E., Tantaleân J.C., Claudio Christian Vâsquez C.C. Tellurite: history, oxidative stress, and molecular mechanisms of resistance. Reviews // FEMS Microbiology. 2009. Vol. 33, iss. 4. P. 820-832. Doi: 10.1111/j.1574-6976.2009.00177.x.
27. Reis V.R., Antonangelo A.T.B.F., Bassi A.P.G., Co-lombi D., Ceccato-Antonini S.R. Bioethanol strains of Sac-charomyces cerevisiae characterised by microsatellite and stress resistance // Biotechnology and industrial microbiology. 2017. Vol. 48, iss. 2. P. 268-274. Doi: 10.1016/j.bjm.2016.09.017.
28. Абрамов Ш.А., Халилова Э.А. Способ сбраживания мелассного сусла. Пат. № 2329302. 22.06.2006.
29. Патент № 2495936. 26.04.2012. Способ получения этанола. Халилова Э.А., Котенко С.Ц., Исламмагомедова Э.А., Аливердиева Д.А.
30. MorardM., Macias L.G., Adam A.C, Lairôn-Peris M., Pérez-Torrado R., Toft C., Barrio E. Aneuploidy and ethanol tolerance in Saccharomyces cerevisiae // Frontiers in genetics. 2019. Vol. 10, iss. 82. P. 1-12. Doi: 10.3389/fgene.2019.00082.
31. Kasbawati A., Anisa K.S. Mathematical study of feedback inhibition effects on the dynamics of metabolites on the central metabolism of a yeast cell: a combination of kinetic model and metabolic control analysis // Biotechnology & Biotechnological Equipment. 2019. Vol. 33, iss. 1. P. 1126-1137. Doi: 10.1080/13102818.2019.1641148.
32. Auesukaree С. Molecular mechanisms of the yeast adaptive response and tolerance to stresses encountered during ethanol fermentation // J. of Bioscience and Bioengineering. 2017. Vol. 124, iss. 2. P. 133-142. Doi: 10.1016/j.jbiosc.2017.03.009.
33. Stanley D., Bandara A., Fraser S., Chambers P.J., Stanley G.A. The ethanol stress response and ethanol tolerance of Saccharomyces cerevisiae // J. of Applied Microbiology. 2010. Vol. 109, iss. 1. P. 13-24. Doi: 10.1111/j .1365-2672.2009.04657.x.
ISSN 1026-2237 BULLETIN OF HIGHER EDUCATIONAL INSTITUTIONS. NORTH CAUCASUS REGION. NATURAL SCIENCE. 2020. No. 4
34. Kuthan M., Devaux F., Janderova B., Slaninova I., Jacq C., Palkova Z. Domestication of wild Saccharomyces cerevisiae is accompanied by changes in gene expression and colony morphology // Molecular Microbiology. 2003. Vol. 47. P. 745-754.
35. Cap M., Stepanek L., Harant K., Vachova L., Palkova Z. Cell differentiation within a yeast colony: metabolic and regulatory parallels with a tumor-affected organism // Molecular Cell. 2012. Vol. 46, iss. 4. P. 436-448. Doi: 10.1016/j.molcel.2012.04.001.
36. Stanley D., Bandara A., Fraser S., Chambers P.J., Stanley G.A. The ethanol stress response and ethanol tolerance of Saccharomyces cerevisiae. Review // Applied Microbiology. 2010. Vol. 109, iss. 1. P. 13-24. Doi: 10.1111/j .1365-2672.2009.04657.x.
References
1. Caspeta L., Castillo T., Nielsen J. (2015). Modifying Yeast Tolerance to Inhibitory Conditions of Ethanol Production Processes. Review. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, vol. 3, pp. 184-195, doi: org/10.3389/fbioe.2015.00184.
2. Zhang Q., Jin Y.F., Fang Y., Zhao H. (2019). Adaptive evolution and selection of stress-resistant Saccharomyces cerevisiae for very high-gravity bioethanol fermentation. Electronic Journal of Biotechnology, vol. 41, pp. 88-94, doi: org/10.1016/j.ejbt.2019.06.003.
3. Helalat H.S., Bidaj S., Samani S., Moradi M. (2019). Producing alcohol and salt stress tolerant strain of Saccha-romyces cerevisiae by heterologous expression of pprI gene. Enzyme and Microbial Technology, vol. 124, pp. 1722, doi: 10.1016/j.enzmictec.2019.01.008.
4. Palkova Z., Vachova L. (2006). Life within a community, benefit to yeast long-term survival. FEMS Microbiol. Review, vol. 30, No. 5, pp. 806-824, doi: 10.1111/j .1574-6976.2006.00034.x.
5. Opalek M., Wloch-Salamon D. (2020). Aspects of multicellularity in Saccharomyces cerevisiae yeast: a review of evolutionary and physiological mechanisms. Review. Genes (Basel), vol. 11, No. 6, p. 690, doi: 10.3390/genes11060690.
6. Koschwanez J.H., Foster K.R., Murray A.W. (2011). Correction: sucrose utilization in budding yeast as a model for the origin of undifferentiated multicellularity. PLOS Biology, vol. 9, No. 8, p. e1001122, doi: 10.1371/jour-nal.pbio.1001122.
7. Vachova L., Cap M., Palkova Z. (2012). Yeast colonies: a model for studies of aging, environmental adaptation, and longevity. Review. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, pp. 1-8, doi: 10.1155/2012/601836.
8. Wang Y., Lo W.-C., Chou C.-S. (2017). A modeling study of budding yeast colony formation and its relationship to budding pattern and aging. PLOS computational biology, vol. 13, No. 11, p. e1005843, doi: 10.1371/jour-nal.pcbi.1005843.
9. Gulli J., Cook E., Kroll E., Rosebrock A., Caudy A., Rosenzweig F. (2019). Diverse conditions support near-
zero growth in yeast: Implications for the study of cell lifespan. Review. Microbiol. Cell, vol. б, No. 9, pp. 397413, doi: 10.15698Imic2019.09.690.
1Q. Reis V.R., Bassi A.P.G., Silva J.C.G., Ceccato-An-tonini S.R. (2013). Characteristics of Saccharomyces cerevisiae yeasts exhibiting rough colonies and pseudohyphal morphology with respect to alcoholic fermentation. Brazilian Journal ofMicrobiology, vol. 44, No. 4, pp. 1121-1131, doi: 10.159QIS1517-S3S22Q14Q05QQQQ2Q.
11. Khalilova E.A., Abramov S.A., Kotenko S.C., Is-lammagomedova E.A. (2010). The effect of the biosynthesis stimulator of ethanol - geothermal water on the morphophysiological features of the yeast Saccha-romyces cerevisiae under various cultivation conditions. Khranenie ipererabotka selkhozsyri, vol. S, pp. 44-4б. (in Russian).
12. Certificate No. 1284998. The strain of yeast of Sac-charomyces cerevisiae Y-503, used in the manufacture of bakeryproducts. Sh.A. Abramov, S.Ts. Kotenko, B.I. Dal-gatova, A.T. Mammaev, D.S. Peisakhova. Q9.Q4.19S5. (in Russian).
13. Certificate No. 1104149. The strain of yeast Saccharomyces oviformis M-12X, used for the production of cham-pagne wine materials and table wines. Sh.A. Abramov, S.Ts. Kotenko, A.-S.M. Makuev, O.K. Vlasova, R.I. Nakhshunov. Q3.21.19S3. (in Russian).
14. Aliverdieva D.A., Mamaev D.V., Lagutina L.S., Sholtc K.F. (200б). Features of changes in the content of endogenous respiration substrates in Saccharomyces cere-visiae cells at low temperature. Biokhimiya, vol. 71, No. 1, pp. 5Q-5S. (in Russian).
15. МПК 4.2.1890-04. (2004). Determination of the sensitivity of microorganisms to antibacterial drugs. Methodical instructions. Moscow, Federal Center for State Sanitary and Epidemiological Supervision of the Ministry of Health of Russia Press. (in Russian).
16. Khalilova E.A., Islammagomedova E.A., Kotenko S.C., Gasanov R.Z., Abakarova A.A., Aliverdieva D.A. (2019). On the morphological properties of the strain S. cerevisiae Y-5Q3 under conditions of osmotic, temperature and acid stress. Izvestiia Samarskogo nauchnogo tcentra Rossiiskoi akademii nauk, vol. 21, No. 2 (2), pp. 132-140. (in Russian).
17. Islammagomedova E.A., Khalilova E.A., Kotenko S.C., Gasanov R.Z., Abakarova A.A., Aliverdieva D.A. (2019). Changes in the morphological properties of S. cerevisiae yeast under stress. Izvestiia Samarskogo nauchnogo tcentra Rossiiskoi akademii nauk, vol. 21, No. 2 (2), pp. 101-107. (in Russian).
1S. Navarro-Tapia E., Querol A., Pérez-Torrado R. (2Q1S). Membrane fluidification by ethanol stress activates unfolded protein response in yeasts. Microb. Biotechnol., vol. 11, No. 3, pp. 4б5-475, doi: 1Q.1111I1751-7915.13032.
19. Magasanik B., Kaiser C.A. (2QQ2). Nitrogen regulation in Saccharomyces cerevisiae. Gene, vol. 290, No. 12, pp. 1-1S, doi: 10. 1Q16ISQ37S-1 119(Q2)QQ55S-9.
20. Kim J.S., Daum M.A., Jin Y.S., Miller M.J. (2Q1S). Yeast Derived LysA2 Can Control Bacterial Contamina-
ISSN 1026-2237 BULLETIN OF HIGHER EDUCATIONAL INSTITUTIONS. NORTH CAUCASUS REGION. NATURAL SCIENCE. 2020. No. 4
tion in Ethanol Fermentation. Viruses, vol. 10, No. 281, pp. 1-16, doi: 10.3390/v10060281.
21. Islammagomedova E.A., Khalilova E.A., Kotenko S.C. (2011). Some physiological and biochemical properties of the Saccharomyces oviformis M-12X strain depending on the cultivation conditions. Production of alcohol and alcoholic beverages, No. 1, pp. 13-15.
22. Khalilova E.A., Islammagomedova E.A., Kotenko S.C. (2011). Some features of nitrogen metabolism in yeast Saccharomyces cerevisiae Y-503 in a growth medium with geothermal water of the phenolic class. Proizvodstvo spirta i likerovodochnykh izdelii, vol. 2, pp. 9-12. (in Russian).
23. Fadel M., Zohri A.N.A., El-Heeny M.S., Abdel A.A.M. (2018). Managing of bacterial contamination in alcoholic fermentation of sugar cane molasses. Asian Journal of Science and Technology, vol. 9, No. 1, pp. 7383-7391.
24. Gadd G.M., White C. (1989). Removal of thorium from simulated acid process streams by fungal biomass. Biotechnology and bioengineering, vol. 33, No. 5, pp. 592597, doi: 10.1002/bit.260330512.
25. Gharieb M.M., Gadd G.M. (1998). Evidence for the involvement of vacuolar activity in metal (loid) tolerance: vacuolar-lacking and defective mutants of Saccharomyces cerevisiae display higher sensitivity to chromate, tellurite and selenite. Biometals, vol. 11, pp. 101-106, doi: 10.1023/a:1009221810760.
26. Chasteen T.G., Fuentes D.E., Tantalean J.C., Vas-quez C.C. (2009). Tellurite: history, oxidative stress, and molecular mechanisms of resistance. Reviews. FEMS Microbiology, vol. 33, No. 4, pp. 820-832, doi: 10.1111/j.1574-6976.2009.00177.x.
27. Reis V.R., Antonangelo A.T.B.F., Bassi A.P.G., Colombi D., Ceccato-Antonini S.R. (2017). Bioethanol strains of Saccharomyces cerevisiae characterised by microsatellite and stress resistance. Biotechnology and industrial microbiology, vol. 48, No. 2, pp. 268-274, doi: 10.1016/j.bjm.2016.09.017.
28. Certificate No. 2329302. Method for fermenting molasses wort. Sh.A. Abramov, E.A. Khalilova. 22.06.2006. (in Russian).
Поступила в редакцию /Received
29. Certificate No. 2495936. Methodfor producing ethanol. E.A. Khalilova, S.C. Kotenko, E.A. Islammagomedova, D.A. Aliverdieva. 26.G4.2G12. (in Russian).
30. Morard M., Macías L.G., Adam A.C., Lairón-Peris M., Pérez-Torrado R., Toft C., Barrio E. (2G19). Aneu-ploidy and ethanol tolerance in Saccharomyces cerevisiae. Frontiers in genetics, vol. 1G, No. B2, pp. 1-12, doi: 1G.33B9/fgene.2G19.GGGB2.
31. Kasbawati A., Anisa K.S. (2G19). Mathematical study of feedback inhibition effects on the dynamics of metabolites on the central metabolism of a yeast cell: a combination of kinetic model and metabolic control analysis. Biotechnology & Biotechnological Equipment, vol. 33, No. 1, pp. 1126-1137, doi: 1G.1GBG/ 131G2B1B.2G19.164114B.
32. Auesukaree С. (2G17). Molecular mechanisms of the yeast adaptive response and tolerance to stresses encountered during ethanol fermentation. Journal of Bioscience and Bioengineering, vol. 124, No. 2, pp. 133-142, doi: 1G.1G16/j.jbiosc.2G17.G3.GG9.
33. Stanley D., Bandara A., Fraser S., Chambers P.J., Stanley G.A. (2G1G). The ethanol stress response and ethanol tolerance of Saccharomyces cerevisiae. Journal of Applied Microbiology, vol. 1G9, No. 1, pp. 13-24, doi: 1G.1111/j .1365-2672.2GG9.G4657.x.
34. Kuthan M., Devaux F., Janderová B., Slaninová I., Jacq C., Palková Z. (2GG3). Domestication of wild Saccharomyces cerevisiae is accompanied by changes in gene expression and colony morphology. Molecular Microbiology, vol. 47, pp. 745-754.
35. Cáp M., Stepánek L., Harant K., Váchová L., Palková Z. (2G12). Cell differentiation within a yeast colony: metabolic and regulatory parallels with a tumor-affected organism. Molecular Cell, vol. 46, No. 4, pp. 436-44B, doi: 1G.1G16/j.molcel.2G12.G4.GG1.
36. Stanley D., Bandara A., Fraser S., Chambers P.J., Stanley G.A. (2G1G). The ethanol stress response and ethanol tolerance of Saccharomyces cerevisiae. Review. Applied Microbiology, vol. 1G9, No. 11, pp. 3-24, doi: 1G.1111/j .1365-2672.2GG9.G4657.x.
9 июня 2020 г. / June 9, 2020
