CC BY
166
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
2007 Биология Вып. 5 (10)
УДК 579.22:579.23
АДАПТАЦИОННЫЕ МЕХАНИЗМЫ ВЫЖИВАНИЯ АЛКАНОТРОФНЫХ РОДОКОККОВ, РЕАЛИЗОВАННЫЕ В НЕБЛАГОПРИЯТНЫХ УСЛОВИЯХ СРЕДЫ
И. Б. Ившинаа,ь, Т. Н. Каменскиха, Б. А. Анохинь
а Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, ул. Голева, 13 ь Пермский государственный университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15
Описаны цитобиохимические особенности клеток актинобактерий рода Rhodococcus в условиях перехода с углеводного на углеводородное питание. Обнаружены разнообразные способы кооперации клеток родококков в колониальной популяции: слипание пептидогликановых слоев клеточной стенки, формирование одиночных пилевидных поверхностных тяжей и множественных шишковидных выростов на наружной поверхности клеточной стенки, обеспечивающие закрепление родококков и сохранение их в гетерофазных природных средах. Выявлены наиболее типичные реакции родококков на присутствие газообразных и жидких н-алканов. Установлен сверхсинтез внеклеточных аминокислот в условиях индукции оксиге-назного ферментного комплекса родококков и высказано предположение относительно физиологической роли данного процесса. Выявленные приспособления алканотрофных родо-кокков рассматриваются в качестве адаптационных механизмов их выживания в специфических условиях внешней среды.
Введение
В связи с возрастающим техногенным загрязнением окружающей среды увеличивается число местообитаний, в которых организмы находятся в экстремальных условиях. Несмотря на то, что проблема адаптации микроорганизмов к неблагоприятным условиям среды традиционно рассматривается биохимией и общей микробиологией, для современной биологии прокариот большой интерес представляют микроорганизмы, способные метаболизировать в экстремальных местообитаниях. В биотопах с повышенным содержанием минеральных солей или нефтяным загрязнением доминирующее положение занимают актинобактерии рода Rhodococcus. Основная биологическая особенность родококков - их способность к окислительной трансформации и деструкции природных и антропогенных углеводородов, синтезу за счет их всех компонентов клеток. Одно уже это свойство делает их наименее зависимыми от внешней среды и позволяет существовать в условиях, неблагоприятных для других микроорганизмов. Однако без должного внимания остаются вопросы адаптации родококков к изменяющимся
условиям среды, переключения с использования одних источников углерода и энергии на другие.
В связи с этим детального изучения заслуживает своеобразие структурной и метаболической организации алканотрофных родококков, появление их качественно новых клеточных структур и физиологических свойств в условиях перехода бактериальных клеток с углеводного на углеводородное питание.
Морфогенез и особенности тонкой структуры клеток родококков
Родококки характеризуются наличием сложного морфогенетического цикла развития. Клетки родококков в молодой (6-15 ч) культуре палочковидные, нитевидные или ветвящиеся (рис. 1а, б). При этом длина клеток колеблется от 7 до 12 мкм, ширина 0.7-0.9 мкм. В первые часы роста образуется нестабильный мицелий, не имеющий перегородок и представляющий собой одну клетку (рис. 1в). Через 16 ч инкубации родококков первичный мицелий распадается на палочковидные фрагменты различной длины. В возрасте 2-5 сут заметно преобладание кокковидных (0.5-0.8 мкм) клеток (рис. 1г).
© И. Б. Ившина, Т. Н. Каменских, Б. А. Анохин, 2007
107
На основании данных о морфологическом разнообразии родококки можно распределить по возрастающей сложности дифференциации клеток в жизненном цикле в такой ряд: R. erythropolis - R. fascians - R. rhodochrous - R. “longus” - R. opacus - R. ruber. Так, представители R. ruber с наиболее выраженным жизненным циклом и мицелиальной стадией развития клеток (в морфоцикле R. ruber обнаруживается четыре формы клеток: прорастающая, ветвистая, палочковидная и переживающая) характеризуются способностью ассимилиро-
вать, наряду с жидкими, тяжелые газообразные н-алканы (пропан, н-бутан). Не лишено оснований предположение (Калакуцкий, Агре, 1977), что фрагментация мицелия увеличивает отношение клеточной поверхности к объему и тем самым повышает способность родококков к поглощению трудноусваиваемого субстрата. По-видимому, благодаря способности образовывать первичный мицелий родококки приспособились к жизни не только в водной среде, но и в твердофазном субстрате.
. л а t > * * ^ Г .1,1 ^. ' - v >йс
в \ V » ' 1 ■ Г >, 4? + , V. Щ Ч * Ърь*у1 г Ч' >\ 'ч ;"v,- * >
Рис. 1. Морфология клеток R. орасш' ИЭГМ 716 при росте на мясопептонном агаре. Время культивирования: а - 6 ч; б - 9 ч; в - 15 ч; г - 48 ч (окраска генциановым фиолетовым)
Дополнительная информация о морфологических особенностях родококков получена с помощью сканирующей электронной микроскопии при изучении архитектоники формируемых ими колоний. Так, колонии R. ruber дифференцированы на субстратную и надсубстратную зоны роста. При этом наблюдаются разнообразные способы кооперации клеток в колониальной популяции - от слипания пептидогликановых слоев клеточных стенок до формирования одиночных пилевидных поверхностных тяжей и множественных шишковидных выростов на наружной поверхности клеточной стенки (рис. 2а, б). Очевидно, образование морфо-
функциональных межклеточных контактов в колониях, способствующих возникновению коммуникаций между контактирующими клетками и эффективной генерации ответа «кооперативной клеточной системы» на возможные экологические ситуации, - приспособительный признак родокок-ков, обеспечивающий выживание в гетерофазных природных средах. Можно предполагать, что в естественных условиях закрепление родококков на субстрате идет либо за счет адгезии клеток на его поверхности, либо за счет врастания клеток в субстрат, образования в нем ветвистых особей и формирования мицелиоподобных структур (рис. 2в).
Рис. 2. Клетки R. ruber ИЭГМ 333, выращенные на минеральной среде в атмосфере пропана (а, б) и мясопептонном агаре (в), в сканирующем микроскопе:
а - х 36 000; б - х 45 000; в - х 25 000. КВ - кольцевидный выступ; стрелками показаны шишковидные выросты.
Электронограммы выполнены к.б.н. В.П. Шеховцовым с использованием сканирующего электронного микроскопа JSM-50A (фирма JEOL, Япония)
При электронно-микроскопическом изучении алканотрофных родококков выявлены изменения в структурно-функциональных комплексах клеток, которые находятся в зависимости от длины углеродной цепи утилизируемого углеводородного субстрата. Наиболее типичная реакция родококков на присутствие газообразных и жидких н-алканов -наличие капсул полисахаридной природы, обнаруживающих родство с рутениевом красным (рис. 3а); вакуолеподобных образований, обладающих ульт-раструктурными характеристиками, свойственными гранулам поли-р-оксибутирата (рис. 3е); повышение содержания осмиофильных включений, соответствующих по результатам цитохимического окрашивания гранулам полифосфатов (рис. 3 а, б) и увеличение их размеров (до 100 нм). Отличительная особенность клеток, выращенных на пропане или н-
бутане, - фрагментация цитоплазмы (рис. 3в), наличие жировых включений (рис. 3а,б), формирование оксисомоподобных структур (рис. 3а), представляющих собой специализированные участки локализации окисляющих ферментов, которые необходимы для трансформации углеводородного субстрата, образование развитой внутриклеточной мембранной системы (рис. 3а), представленной различными конфигурациями и расположенной нередко по периферии цитоплазмы. Преимущественная локализация выявленных сложных внутриклеточных мембранных образований около клеточной стенки свидетельствует о их вероятной роли в увеличении поверхности цитоплазматической мембраны и метаболизме пропан- и бутанокисляющих ро-дококков. Так, в газоокисляющих клетках обнаруживается активный синтез материала клеточной
Рис. З. Ультратонкие срезы клеток R. ruber, выращенных на минеральной среде в атмосфере пропана:
а - штамм ИЭГМ ЗЗЗ, х 80 ООО; б - штамм ИЭГМ 580, х 82 ООО; в - ИЭГМ 565, х 70 ООО; г, д -ИЭГМ З42, х 82 ООО; е - ИЭГМ 7З, х 70 000.
КС - клеточная стенка; РКС - разрастание клеточной стенки; МК - микрокапсула; Н - нуклеоид; П - поперечная перегородка; ВМС - внутрицитоплазматическая мембранная система; В - волютин; Ж - жировые включения; ФЦ - фрагментация цитоплазмы; ПОБ - поли-р-оксибутират; ОС -
оксисомоподобная структура.
Электронограммы выполнены к.б.н. Л.Е. Глазачевой с использованием электронного микроскопа JEM-100B (фирма JEOL, Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВт и рабочем увеличении 1З 000-З0 000
стенки (рис. 3г, д). Около разрастаний клеточной стенки обычно выявляются мезосомы, имеющие контакт с пограничной цитоплазматической мембраной, и электронно-плотные включения, так называемые оксисомы. Избыточный рост клеточной стенки, увеличивающий ее поверхность, очевидно, связан с созданием своеобразного депо, обеспечивающего фиксацию поступающего гидрофобного ростового субстрата.
Таким образом, данные электронно-цитохимического анализа алканотрофных родококков делают очевидной коррелятивную связь их поверхностных и мембранных ультраструктур с деструктивными процессами н-алканов. Исчезновение наблюдаемых изменений в ультратонком строении клеток по мере многократных серийных пересевов последних и инкубации их на стандартных органических средах - убедительное доказательство функциональной приспособленности родококков, инкубированных в присутствии газообразных и жидких н-алканов.
Сверхсинтез экстрацеллюлярных аминокислот
В условиях индуцированного алканотрофного метаболизма родококков обнаружено изменение
качественного и количественного состава синтезируемых ими внеклеточных аминокислот. Как видно из рис. 4, родококки при выращивании их в глюкозо-минеральной среде и в минеральной среде в атмосфере пропана способны в процессе роста синтезировать и выделять в среду, как правило, несколько аминокислот. При этом следует отметить увеличение количества экстрацеллюлярных аминокислот при росте в минеральной среде с газообразными углеводородами по сравнению с таковыми при росте их в среде с глюкозой. Представители R. ruber накапливают при культивировании в присутствии пропана аргинин, валин, гистидин, глутаминовую кислоту, изолейцин, лизин, метионин, тирозин, фенилаланин. При этом состав продуцируемых аминокислот зависит от индивидуальных особенностей конкретных штаммов родококков. Родококки - активные продуценты аминокислот - могут быть использованы в качестве исходного материала для селекции перспективных форм, синтезирующих преимущественно одну аминокислоту в количестве, достаточном для производства.
0,7
0,6
н- 0,5 о
Ц
0
1 0,4
0,3
*
а
ф
ч
о
о
0,2
0,1
£
і
і
гЬ
£
□ а
□ б
*
£
rf
£
Ала
Ара*
Вал* Гис* Гли Глу Иле* Лей* Лиз* Мет* Тир Тре* Сер Фен*
0
Рис. 4. Синтез экстрацеллюлярных аминокислот родококками при росте на среде с глюкозой (а) и
в присутствии пропана (б):
Ала - аланин, Арг - аргинин, Вал - валин, Гис - гистидин, Гли - глицин, Глу - глутаминовая кислота, Иле - изолейцин, Лей - лейцин, Лиз - лизин, Мет - метионин, Тир - тирозин, Тре Сер - треонин + серин, Фен - фенилаланин; * - незаменимые аминокислоты.
Аминокислотный состав культуральной жидкости родококков изучали методом ионообменной хроматографии с использованием пластинок «Фиксион 50х8». Подвижная фаза - цитратный буфер рН 3.3. Количественное содержание аминокислот определяли после денситометрии пластин на микрофотометре G-П, рассчитывая
площади пиков каждой аминокислоты
Способность алканотрофных родококков накапливать внеклеточные аминокислоты, помимо практического значения может иметь и экологический смысл. Известно, что в обмене веществ между организмами биоценозов важную роль играют свободные аминокислоты, влияющие на развитие комплексов микробных ассоциаций. Не исключено смысла предположение, что экстрацеллюлярные аминокислоты, синтезируемые пропан- и бутано-кисляющими родококками в естественных субстратах с минимальным содержанием органических веществ, могут быть использованы в процессе жизнедеятельности другими группами гетеротрофных микроорганизмов ценоза.
Следует отметить, что вопрос о физиологической роли процесса сверхсинтеза родококками экс-трацеллюлярных аминокислот остается открытым. Очевидно, данный процесс следует рассматривать как футильный сброс избытка восстановительных эквивалентов (избыточной энергии), позволяющий родококкам выживать в неблагоприятных условиях среды (Акименко, 1989).
Заключение
Выявлено, что родококки в условиях индуцированного алканотрофного метаболизма обладают разнообразными способами кооперации клеток в колониальной популяции: слипание пептидогли-кановых слоев клеточной стенки, формирование одиночных пилевидных поверхностных тяжей, об-
разование множественных шишковидных выростов на наружной поверхности клеточной стенки. Характерной особенностью клеток родококков, выращенных в присутствии газообразных и жидких н-алканов, является наличие фибриллярных капсул полисахаридной природы, повышение содержания и размеров гранул полифосфатов и по-ли-р-оксибутирата, фрагментация цитоплазмы, формирование оксисомоподобных структур, гиперсинтез мембранного аппарата, преимущественная локализация сложных мембранных структур около клеточной стенки,активный синтез новых участков клеточной стенки, а также сверхсинтез таких энергоемких соединений, как экстрацеллю-лярные аминокислоты. Все это значительно расширяет адаптивные возможности родококков, свидетельствует об их биологической пластичности и может рассматриваться в качестве адаптационных механизмов выживания их в специфических условиях внешней среды обитания.
Список литературы
Акименко В.К. Альтернативные оксидазы микроорганизмов. М.: Наука, 1989. 263 с.
Калакуцкий Л.В., Агре Н.С. Развитие актиномицетов.
М.: Наука, 1977. 285 с.
Нестеренко ОА., Квасников Е.И., Ногина Т.М. Но-кардиоподобные и коринеподобные бактерии. Киев: Наукова думка, 1985. 336 с.
Поступила в редакцию 18.05.2006
Adaptive mechanisms of alkanotrophic rhodococci survival under unfavorable conditions
I.B. Ivshina, T.N. Kamenskikh, B.A. Anokhin
Cytobiochemical features of cells of the genus Rhodococcus actinobacteria under the nutritional shift from carbohydrate type to hydrocarbon one were characterized. Rhodococci cells were found to use different grouping strategies in colony populations, i.e. adhesion of cell wall peptidoglycane layers and formation of multiple cone-shaped offshoots on the cell wall surface. These allow rhodococci cells to “attach” to and survive in hete-rophasic natural habitats. Most typical reactions of rhodococci to gaseous and liquid «-alkanes were detected. Induction of rhodococci oxygenase complex resulted in overexpression of extracellular amino acids, thus the physiological role of this process was assumed. The alkanotrophic rhodococci adaptations observed in the study are considered as adaptive mechanisms of their survival under specific environmental conditions.
