CC BY
116
АБЗИМЫ С ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ И НУКЛЕАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ ПРИ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЯХ
ГЕНЕРАЛОВ И.И., ДМИТРАЧЕНКО Т.И., ЖЕЛЕЗНЯК Н.В., СТЫЧНЕВСКАЯ Е.В., ЗЫКОВА О.С., ГЕНЕРАЛОВА А.Г.,
ЖЕРУЛИК С.В.
УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский
университет»
Резюме. Известно. что каталитические антитела или абзимы обнаруживаются при самых разных инфекционных и аутоиммунных заболеваниях. однако их патогенетическая роль пока остается невыясненной. В настоящем исследовании изучалась протеолитическая и ДНКазная активность поликлональных иммуноглобулинов класса G. выделенных от больных инфекционным мононуклеозом. ветряной оспой и herpes zoster. инфекцией herpes labialis. вирусными гепатитами В и С.
Было установлено. что катионы металлов Mg(II). Ca(II). Zn(II). Cu(II) усиливают протеолитическую и нуклеазную активность абзимных IgG. появляющихся при вирусных заболеваниях.
Преимущественным субстратом для абзимов-протеаз являются амиды и пептиды. имеющие в своем составе основные аминокислоты (аргинин. лизин). Было показано. что лизин-амидазная активность IgG является высокоспецифичной для инфекционного мононуклеоза. что может быть использовано для иммунологической лабораторной диагностики данного заболевания.
Дана сравнительная характеристика абзимной активности IgG при различных вирусных заболеваниях. Полученные результаты подтверждают возможность участия каталитических антител в патогенезе вирусных инфекций.
Ключевые слова: абзимы. ДНКазная активность. протеолитическая активность. герпетическая инфекция. вирусные гепатиты В и С.
Abstract. It is well-known that catalytic antibodies or abzymes are demonstrated in diverse infectious and autoimmune diseases; nevertheless. their direct pathogenic role still remains unclear. In present study catalytic protease and nuclease activity of polyclonal IgG isolated from sera of patients with Epstein-Barr infection. chickenpox and shingles. herpes labialis infection. and viral hepatites B and C was studied.
It was determined that metal ions Mg(II). Ca(II). Zn(II). Cu(II) enhance proteolytic and nuclease activity of polyclonal IgGs arisen in viral infections.
Amides and peptides with basic amino acids (lysine. arginine) appeared to be the most preferable substrates for protease abzymes. Lysine-amidase IgG activity was demonstrated as highly specific for Epstein-Barr infection that can be used for immunological diagnosis of this disorder.
Comparative study of abzyme activities in various kinds of viral infections was made. The obtained data confirm the possibility of direct participation of abzymes in pathogenesis of viral infections.
Key words: abzymes. DNAse activity. proteolytic activity. herpetic infection. viral hepatites B and C.
Адрес для корреспонденции: Республика
Беларусь. 210009. г.Витебск. пр-кт Фрунзе. 78-48. тел. 8-0212-370612. е-mail: [email protected]. -
Г енералов И.И.
Проблема взаимодействия вирусов с иммунной системой макроорганизма по-прежнему не теряет актуальности в современной вирусологии и иммунологии [5].
Большинство вирусов являются причиной не только острых. но и тяжелых хронических заболеваний. Во многих случаях возбудитель персистирует пожизненно. приводя к поражению большинства органов и систем с глубоким расстройством их функции.
Тем не менее. несмотря на многочисленные успехи в расшифровке особенностей патогенеза данных заболеваний. воздействие вирусных агентов на иммунную систему человека до сих пор полностью не изучено [5].
Среди гуморальных факторов защиты весьма важными являются иммуноглобулины (ИГ) и антитела (АТ). Они нейтрализуют вирионы и их компоненты в крови и других биологических жидкостях организма. активируют систему комплемента. участвуют в опсонизации вирусных частиц.
Сравнительно недавно было обнаружено. что АТ способны сами проявлять ферментативные свойства и расщеплять некоторые субстраты. Оказалось. что при определенных условиях в молекуле АТ возможно образование каталитического центра [9]. Такие АТ. обладающие собственной ферментативной активностью. получили название абзимов.
По мнению многих исследователей. абзимная активность является одним из самых перспективных новых диагностических маркеров патологических процессов (Lacroix-Desmazes S. с соавт.. 2005-2006 [13. 14])].
Однако. учитывая сравнительно короткий срок исследования поликлональных каталитических ИГ. а также широкий спектр возможных видов абзимной активности. многие важные особенности их действия остаются пока невыясненными. Кроме того. основные исследования проводятся лишь в ограниченном спектре аутоиммунной патологии (системная красная волчанка. ревматоидный артрит. бронхиальная астма. аутоиммунный тиреоидит [9]). Другие же заболевания практически не изучались. В свою очередь. весьма вероятно появление каталитических АТ не только при аутоиммунизации. но и при развитии инфекционных процессов. И в том и другом случае происходит многократная стимуляция системы иммунитета с возможностью генерации каталитических АТ. Такие предположения выдвигались уже неоднократно.
предложен даже специальный термин для каталитических АТ. специфически разрушающих инфекционные АГ - абзимы-«антигеназы» (Hifumi E. с соавт. 2006 [11]).
В предварительных исследованиях нам удалось показать. что при развитии вирусных инфекций удается обнаружить АТ. имеющие собственную каталитическую активность (Невинский Г.А.. Генералов И.И.. 2000-2002 [1. 4]). При этом появляющиеся аутоабзимы проявляют разную субстратную специфичность. в первую очередь - нуклеазную и протеолитическую.
Тем не менее. системных исследований абзимной активности при вирусных заболеваниях пока не проводилось. Совершенно не изучены взаимосвязи каталитических АТ с проявлениями вирусных болезней. степенью их тяжести. развитием осложнений и т.д.
Отсюда очевидный интерес представляет дальнейшая характеристика каталитической (нуклеазной и протеолитической) активности АТ при различных инфекционных заболеваниях вирусной этиологии. в первую очередь
- широко распространенных и социально значимых. таких как герпетическая инфекция и вирусные гепатиты В и С.
Методы
Для определения протеолитической активности ИГ использовали синтетические субстраты. включающие нитроанилиды различных аминокислот и пептидов: бензоил-DL-аргинин-р-нитроанилид (БАНА). бензоил-тирозин-р-нитроанилид (ТНА). лизин-р-нитроанилид (ЛНА). бензоил-валил-глицил-аргинин-р-нитроанилид (ВГАНА). аргинин-пролин-р-нитроанилид (АПНА). Для оценки ДНКазной активности IgG применяли ДНК тимуса теленка (все реактивы пр-ва Sigma. США).
Абзимная активность иммуноглобулинов класса G оценивалась у 24 практически здоровых лиц (контрольная группа доноров крови). 19 больных инфекционным мононуклеозом (герпетической инфекцией. вызванной вирусом герпеса 4 типа). 10 больных инфекцией herpes labialis (вирусом герпеса 1 типа). 8 больных ветряной оспой и 6 больных опоясывающим лишаем (герпетической инфекцией. вызванной вирусом герпеса 3 типа). 30 больных вирусными гепатитами В и С.
Диагноз заболеваний устанавливался на базе Витебской областной инфекционной больницы. Витебского областного дерматовенерологического диспансера. забор сыворотки крови доноров проводился на Витебской областной станции переливания крови.
Для очистки препаратов IgG использовалась агароза. конъюгированная с рекомбинантным белком А золотистого стафилококка (Pierce. USA) и матрица для гель-фильтрации Молселект Г10 ("Reanal". Венгрия).
Сывороточную концентрацию IgG определяли методом иммуноферментного анализа с использованием тест-системы производства ЗАО «Вектор-Бест» (Россия) согласно инструкции. прилагаемой к набору.
Концентрацию выделенных препаратов иммуноглобулинов определяли прямым спектрофотометрическим методом на 280 нм. Коэффициент пересчета
для перевода концентрации в мг/мл составил 1.45. Дополнительно концентрацию АТ и других белков определяли по методу Бредфорд [7].
Анализ чистоты выделения АТ проводился методами иммунодиффузии по Оухтерлони. иммуноэлектрофорезом по Грабару-Уильямс. электрофорезом в полиакриламидном геле (ПААГ) в диссоциирующих условиях с окраской Кумасси R250 [6].
В последнем случае применяли электрофорез в 10-12% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия в невосстанавливающих или восстанавливающих условиях в присутствии 0.1% 2-меркаптоэтанола (все реагенты - производства фирмы Sigma). Методику выполняли в приборе для вертикального электрофореза в пластинах в системе буферов по Laemmli [6]. Пробы ИГ предварительно диссоциировали кипячением в течение 2 минут в присутствии 1% додецилсульфата натрия (ДДС-Na. SDS-Na) и при необходимости - 2% меркаптоэтанола. Белковая нагрузка в большинстве экспериментов составляла 8-10 мкг IgG на трек. Фиксацию белков осуществляли 50% раствором трихлоруксусной кислоты в течение 1 ч. Окраска
- кумасси яркий голубой R250. 0.1% раствор. до полного прокрашивания геля. Пластины с гелем отмывали 7.5% уксусной кислотой.
Для определения абзимной активности нами была проведена адаптация способов оценки ферментативной ДНКазной и БАНА-амидазной активности для определения ее в препаратах ИГ.
Все протеолитические реакции выполняли по сходной схеме. К 0.2 мл субстрата (растворяется в минимальном объеме диметилсульфоксида) в концентрации 0.5 мг/мл на 0.05М трис-HCl буфере pH 8.3. содержащем 0.025% азид натрия. добавляли 0.05 мл препарата IgG в концентрации 0.5-1.0 мг/мл. Инкубировали в течение 20 ч при температуре 37 °С. Реакция ставилась в планшетах для иммуноферментного анализа (ИФА). Опытные и контрольные пробы дублировали. Регистрацию результатов проводили на фотометре Ф300 производства РУП «Витязь» (Витебск). методика №20. двухволновое
измерение на 405 и 570 нм. Полученные данные выражали в условных единицах оптической плотности (Ед). эквивалентных приросту оптической плотности опытной пробы в сравнении с холостой пробой.
С учетом возможности повышения абзимной активности в присутствии катионов металлов в дальнейших экспериментах в реакционный буфер добавляли хлорид цинка и сульфат меди в концентрации 0.00001 М и хлориды магния и кальция в концентрации 0.001 М.
ДНКазную абзимную активность определяли по методу риванолового сгустка. как описано ранее [3]. Результаты реакции оценивали визуально в единицах активности (баллах) от 0 до 5 единиц.
Статистическую обработку результатов проводили на персональном компьютере с использованием пакетов прикладных статистических программ. Использовали методы описательной статистики. Характер распределения изучаемых величин оценивали по критерию Колмогорова-Смирнова. Для сравнения данных между группами использовали метод множественных сравнений по Бонферрони и Шеффе. метод Краскелла-Уоллиса для
множественного сравнения медиан. При сравнении двух выборок использовали критерии Стъюдента и Вилкоксона-Манна-Уитни. Корреляцию между признаками определяли по Пирсону и Спирмену.
Результаты и обсуждение
1. Анализ чистоты полученных препаратов IgG
По данным иммунодиффузии и иммуноэлектрофореза в агарозе использованная модификация метода очистки позволяет получить IgG без примесей других иммуноглобулинов.
При этом методика обеспечивала выход электрофоретически и иммунохимически гомогенных IgG (см. рис.1 и рис. 2).
2. Определение БАНА-амидазной и ДНКазной активности IgG больных вирусными заболеваниями
Первоначальные эксперименты включали оценку протеазных и нуклеазных абзимов в стандартных условиях. изложенных в разделе «Материалы и методы». В частности. для оценки протеолитических абзимов использовали субстрат БАНА. применявшийся нами ранее для определения абзимной активности при аутоиммунных заболеваниях [2]. Реакционный буфер не содержал катионов металлов в качестве активаторов абзимной активности. В свою очередь. для проведения ДНКазной реакции использовали буфер. содержащий хлорид магния.
При проведении реакций в данных условиях БАНА-амидазная активность оказалась минимальной. Она практически не обнаруживалась при инфекционном мононуклеозе. ветряной оспе. минимальный уровень активности (Мср+m. ед опт плотн.) отмечался у здоровых лиц (0.006+0.001); больных вирусными гепатитами (0.007+0.001). несколько выше - у больных опоясывающим лишаем (0.01+0.003 ЕОП) и herpes labialis (0.01+0.003 ЕОП).
ДНКазная абзимная активность в стандартных условиях также была невысокой. У больных инфекционным мононуклеозом она была выявлена у 3 из 19 обследованных. 2 из 11 больных ветряной оспой. 1 из 6 опоясывающим лишаем. 2 из 8 больных herpes labialis. У здоровых лиц она была обнаружена у 3 из 24 обследованных. Несколько более высокой активность была при вирусных гепатитах (8 из 30 обследованных). из них при гепатите В положительными были 3 пробы из 9. гепатите С - 5 из 21.
Во всех случаях активность не превышала 1-2 баллов.
С учетом известных сведений об усилении каталитической активности абзимов-протеаз и ДНК-абзимов в присутствии катионов металлов [15]. в дальнейшем в реакционную смесь были добавлены катионы Mg(II). Ca(II). Zn(II). Cu(II). Это привело к увеличению активности. особенно в отношении протеолитических абзимов.
Результаты определения БАНА-амидазной активности приведены в таблице 1.
Рис. 1. Иммунодиффузия по Оухтерлони препаратов 1^0, полученных различными методами риванол-аффинной хроматографии. Примечание. На фотографии представлен образец ^О, очищенный после переосаждения сыворотки риванолом на активированном угле (нижние лунки) или на Молселекте Г10 (лунки справа). СПБЧ - сыворотка против всех сывороточных белков человека, анти-1^А, анти-1^М, анти-1^0 -
соответствующие антисыворотки.
А. В.
Рис. 2. Электрофорез выделенных препаратов ^О в 12% ПАГ в присутствии 8Б8-Ыа, окраска Сооша88Іе Я250.
Примечание. А. 8Б8-Ыа-электрофорез ^О в ПАГ в невосстанавливающих условиях. Треки 1-4 - 1^0 больного инфекционным мононуклеозом в количестве 100 - 50 - 1 - 0,5 мкг. Трек 5 - контрольная сыворотка. В. 8Б8-Ка-электрофорез 1^0 в ПАГ в восстанавливающих условиях с 0,1% 2-меркаптоэтанолом. Диссоциация проб проводилась в присутствии 1%
8Б8-Ыа и 5% 2-меркаптоэтанола.
Таблица 1
Металлозависимая БАНА-амидазная активность больных ______________вирусными инфекциями ^_________________________
Г руппа обследованных N Ед, Мср+m
Доноры 24 0.022+0.002
Больные инфекционным мононуклеозом 19 0.025+0.002
Больные herpes zoster 6 0.019+0.007
Больные ветряной оспой 11 0.021+0.004
Больные herpes labialis S 0.012+0.003
Больные вирусными гепатитами 30 0.011+0.002
в том числе
гепатитом В 9 0.014+0.005
гепатитом С 21 0.009+0.002
Из приведенных данных следует, что протеолитическая активность появилась во всех группах, возрастая в 3-5 раз и более по сравнению с активностью без катионов.
Активность IgG больных мононуклеозом была максимальной, достоверно превышая таковую у больных с инфекцией вирусом герпеса 1 типа и вирусными гепатитами. Обращает внимание то обстоятельство, что уровни протеолитических абзимов при вирусных гепатитах были высокозначимо ниже, чем у здоровых лиц (p=0,0005). Это различие было характерно для обоих вариантов вирусных гепатитов, однако оказалось значительно более выраженным при сравнении доноров с больными вирусным гепатитом С (p=0,0001). Между собой активность больных вирусным гепатитом не отличалась (p>0,05)
При определении ДНКазной активности препаратов IgG в присутствии катионов (Mg(II), Ca(II), Zn(II), Cu(II)) активность была обнаружена у 5 из 19 больных инфекционным мононуклеозом, 1 из 6 опоясывающим лишаем, 2 из 8 больных herpes labialis, вирусных гепатитах (4 из 30 больных). По сравнению с Mg-зависимой активностью, частота выявления ДНКазных металлозависимых абзимов повысилась при ветряной оспе (5 из 11 больных).
Полученные результаты подтверждают активирующее влияние ионов металлов на абзимную активность ИГ.
Далее нами было впервые проведено исследование абзимной протеолитической и нуклеазной активности IgG в зависимости от их сывороточной концентрации. В предварительных экспериментах определяли содержание IgG в исследуемых сыворотках методом иммуноферментного анализа и сравнивали изучаемые группы по этому признаку между собой (Таблица 2).
Из полученных результатов следует, что наблюдаются определенные различия в содержании IgG в изучаемых группах. В частности установлено, что содержание сывороточных IgG при вирусных гепатитах высокозначимо
превышает концентрацию IgG доноров. больных мононуклеозом и herpes zoster (p<0.01).
Таблица 2
Содержание иммуноглобулинов класса G в исследуемых сыворотках
больных и здоровых лиц, мг/мл
Г руппа обследованных N Мср+m, мг/мл
Доноры 24 9.29i0.92
Больные инфекционным мононуклеозом 15 9.73i1.15
Больные herpes zoster 5 9.08i1.99
Больные ветряной оспой 10 11.706i1.54
Больные herpes labialis 8 12.60i1.11
Больные вирусными гепатитами 26 14.57i1.03
в том числе
гепатитом В 7 15.1i1.82
гепатитом С 19 14.38i1.26
Очевидно, что суммарная сывороточная абзимная активность 1^0 будет также отличаться в зависимости от содержания ИГ в сыворотке.
Это подтвердили результаты дальнейших экспериментов. Так, было выявлено, что в отсутствии катионов металлов наивысшую протеолитическую активность (на 1 мл сыворотки) проявляют IgG больных herpes labialis, при этом их активность достоверно превышала донорскую и больных вирусными гепатитами (p<0,05-0,01). Достоверных отличий между БАНА-амидазной активностью доноров и больных вирусными гепатитами обнаружено не было.
При сравнении металлозависимой протеолитической активности АТ, содержащейся в 1 мл сыворотки, было обнаружено, что межгрупповые различия в удельной абзимной активности (на 1 мг IgG) нивелируются с учетом увеличения сывороточной концентрации IgG у больных вирусными гепатитами. Данные по металлозависимой протеазной абзимной активности (на 1 мл сыворотки) приведены в Таблице 3.
Таблица 3
Абзимная сывороточная протеазная активность (в присутствии катионов металлов) у больных вирусными заболеваниями____________
Г руппа обследованных N Мср+m, Ед
Доноры 24 0.197i0.02
Больные инфекционным мононуклеозом 15 0.244i0.035
Больные herpes zoster 5 0.164i0.035
Больные ветряной оспой 10 0.21i0.05
Больные herpes labialis 8 0.13i1.035
Больные вирусными гепатитами 26 0.17i0.047
в том числе
гепатитом В 7 0.134i0.065
гепатитом С 18 0.16i0.057
Исходя из полученных значений, максимальная сывороточная абзимная активность в отношении субстрата БАНА обнаруживается при инфекционном мононуклеозе. Активность этих абзимов превышает таковую в сравнении с инфекцией herpes labialis (p=0,06) и вирусными гепатитами (p=0,12). Тем не менее, эти данные не обнаруживают высокозначимых отличий между собой с учетом высокой концентрации IgG в группах с исходно низкой удельной БАНА-амидазной активностью (например, при вирусных гепатитах).
Далее нами было впервые проведено сопоставление абзимной активности IgG и соответствующей нуклеазной и амидазной активности сывороток в пересчете на содержание данных видов активности в 1 мл сыворотки.
Было выявлено, что в некоторых препаратах доля абзимной активности в суммарной ферментативной активности сывороток является значимой.
При оценке амидазной активности сывороток без катионов металлов в группе здоровых доноров и больных вирусными гепатитами В и С обнаружены образцы, где доля абзимной активности от общей сывороточной составляет 1520% или более. В частности, среди доноров такая абзимная активность обнаружена у 8 из 24 человек. Низкий относительный уровень амидазной абзимной активности был обнаружен у больных инфекционным мононуклеозом.
Сходные результаты были получены при анализе амидазных абзимов, активированных катионами металлов. 9 из 24 человек в группе доноров демонстрировали амидазную активность, составляющую 20% и более от общей сывороточной активности, в группе больных вирусными гепатитами В и С - 10 из 26 человек, больных ветряной оспой - 6 из 10, herpes zoster и herpes labialis -1 из 6 и 5 из 6, соответственно .
При оценке ДНКазной активности подобной зависимости выявить не удалось, учитывая невысокую частоту обнаружения ДНКазной абзимной активности в изучаемых группах. Однако и здесь были обнаружены образцы сывороток, 5-20% общей нуклеазной активности которых обусловлено
абзимной активностью.
Полученные данные свидетельствуют о достаточно высоком патогенетическом и/или саногенетическом потенциале каталитических антител и иммуноглобулинов.
3. Другие виды протеолитической активности IgG больных вирусными заболеваниями
Все вышеизложенные результаты подтвердили наши и имеющиеся литературные данные [12, 15, 16] о значительной вариабельности параметров каталитической активности поликлональных ИГ. Остается весьма актуальным подбор оптимальных условий для проведения поликлонального абзимного
8 9
катализа с учетом наличия в сыворотке не менее 10-10 специфичностей АТ. При поликлональной активации В-лимфоцитов (что происходит, например, при ВИЧ-инфекции или инфекционном мононуклеозе) это значение может увеличиваться на несколько порядков. Активность одних клонов может при этом ингибироваться, других - существенно возрастать. С учетом высокой
специфичности абзимного катализа. в частности. когда молекула белка или полинуклеотида гидролизуется по единственной пептидной [8] или фосфодиэфирной связи во всей молекуле полимера. любые. даже незначительные изменения микроокружения активного центра или состояния субстрата будут существенно влиять на катализ.
Отсюда весьма важным при оценке абзимов деполимеризующего действия является подбор оптимального субстрата для катализируемой реакции. С целью определения преимущественной субстратной специфичности поликлональных абзимов. гидролизующих пептидные связи. нами была проведена оценка абзимной активности в зависимости от природы аминокислотных остатков. образующих пептидную связь. В частности. было установлено. что пролин-содержащий амид (АПНА). и амид. содержащий тирозин (ТНА). весьма слабо подвержены действию каталитических АТ. возникающих при изученных вирусных заболеваниях. Ускорения гидролиза данных субстратов не отмечалось.
Тем не менее. удалось обнаружить. что некоторые АТ наряду с субстратом БАНА эффективно гидролизуют другие амиды. содержащие основные аминокислоты - лизин (субстрат ЛНА) или аргинин. Наиболее эффективно гидролиз пептидной связи происходил в том случае. если аминокислотный остаток основной аминокислоты (аргинина) входил в состав короткого пептида Уа1-01у-А^ (субстрат ВГАНА). Пример реакций приведен на Рис.3. ________________________________________________
Е
о,1 е Ц
0,08
3 9 11
Рис. 3. Гидролиз пептидов и амидов различной структуры под действием
каталитических 1^0.
Примечание. Пробы 3. 9. 11 - образцы разных каталитических 1^0. выделенных от больных вирусными гепатитами.
При анализе протеолитической активности 1^0 в отношении субстрата ВГАНА по всей группе больных вирусными заболеваниями было установлено. что по уровню значений она была достоверно выше. чем показатели других
абзимных протеолитических реакций.
Данный вид активности обнаруживался (включая минимальные значения) у 16 из 24 доноров (66^7%)^ 13 из 19 больных инфекционным мононуклеозом (68^4%)^ 3 из 6 больных инфекцией herpes zoster 5 из 11 больных ветряной оспой 4 из 8 больных инфекцией herpes labialis. При вирусных гепатитах она была выявлена всего у 8 человек из 30 обследованных (26^7%). Частота встречаемости данного вида активности при вирусных гепатитах была достоверно (p<0^05-0^01) ниже^ чем у здоровых лиц или при инфекционном мононуклеозе.
Полученные результаты свидетельствуют о широкой распространенности данного феномена и возможной протективной роли таких АТ.
Средние значения данного вида активности представлены в Таблице 4.
Таблица 4
Значения удельной ВГ АНА-пептидазной абзимной активности ___________больных вирусными инфекциями________________________
Г руппа обследованных N Ед, Мср+m
Доноры 24 0■024±0■004
Больные инфекционным мононуклеозом 19 0■05±0■016
Больные herpes zoster 6 0■026±0■009
Больные ветряной оспой 11 0■019±0■005
Больные herpes labialis 8 0■036±0■016
Больные вирусными гепатитами 30 0^011±0^002
По данному показателю значения активности больных вирусными гепатитами были достоверно (р<0,05-0,01) ниже, чем в других группах, включая группу здоровых лиц-доноров.
Этот результат также указывает на возможную патогенетическую значимость снижения абзимной протеолитической активности при возникновении и развитии вирусных гепатитов.
Схожие результаты были получены при оценке ВГАНА-пептидазной реакции с учетом сывороточной концентрации 1^0 (на 1 мл сыворотки).
Результаты представлены в таблице 5.
Таблица 5
Уровни абзимной протеолитической активности (субстрат ВГАНА) в
1 мл ^ сыворотки
Г руппа обследованных N Ед, Мср+m
Доноры 24 0■201±0■039
Больные инфекционным мононуклеозом 19 0■646±0■30
Больные herpes zoster 6 0■242±0■09
Больные ветряной оспой 11 0■232±0■077
Больные herpes labialis 8 0■517±0■27
Больные вирусными гепатитами 30 0■127±0■027
По данному показателю значения активности больных вирусными гепатитами были достоверно (p<0,05) ниже, чем у больных инфекционным мононуклеозом, а также ниже, чем у здоровых доноров, хотя в последнем случае данные статистически незначимы (p=0,13).
При анализе протеолитической активности IgG в отношении субстрата ЛНА, содержащего другую основную аминокислоту (лизин), было установлено, что положительная ЛНА-гидролизующая активность является
высокоспецифичной для инфекционного мононуклеоза. При других вирусных заболеваниях частота обнаружения этого вида активности была минимальной. Показано, что при инфекционном мононуклеозе она обнаруживалась у 11 больных из 19, тогда как при другой патологии она либо не встречалась (вирусные гепатиты, инфекция herpes zoster), либо обнаруживалась в единичных случаях (1 из 11 больных ветряной оспой и 1 из 8 больных инфекцией herpes labialis).
Г рафик рассеивания значений гидролиза субстрата ЛНА в зависимости от вида патологии представлен на Рис. 4.
Рис. 4. Уровни ЛНА-амидазной активности при различной вирусной
патологии
Примечание. Группы обследованных: 1 - доноры; 2 - инфекционный мононуклеоз; 3 - herpes zoster; 4 - больные ветряной оспой. 5 - herpes labialis; б
- гепатиты.
По уровням ЛНА-гидролизующей активности значения при
инфекционном мононуклеозе были высокодостоверно выше. чем при другой изученной вирусной патологии (p<0.01 -0.001) и в сравнении с контрольной группой доноров (p<0.001).
Исходя из полученных данных. нами был разработан и предложен дополнительный лабораторный критерий диагностики инфекционного мононуклеоза по уровню ЛНА-гидролизующей абзимной активности. Проведен расчет операционных характеристик данного теста для диагностики инфекционного мононуклеоза. В качестве группы сравнения использовали объединенную группу больных другой герпетической инфекцией (25 человек). Рассчитывались диагностическая чувствительность. специфичность. диагностическая эффективность теста. прогностическая ценность положительного и отрицательного результатов. отношение правдоподобия положительного и отрицательного результата [10].
При дифференциации инфекционного мононуклеоза от другой герпетической патологии были получены следующие значения данных параметров:
диагностическая чувствительность установления диагноза инфекционного мононуклеоза по ЛНА-тесту - 58%;
специфичность - 92%;
диагностическая эффективность теста - 77%;
прогностическая ценность положительного результата - 84.6%;
прогностическая ценность отрицательного результатов - 74%;
отношение правдоподобия положительного результата - 7.25;
отношение правдоподобия отрицательного результата - 0.45.
Эти параметры соответствуют критериям «полезного теста» для установления диагноза инфекционного мононуклеоза при дифференциации его от другой герпетической инфекции [10].
Вышеприведенные данные показывают. что критерии. основанные на абзимной активности. могут эффективно применяться при лабораторной диагностике вирусной патологии.
Заключение
1. Катионы металлов М£(П). Са(11). 2и(П). Си(11) усиливают
протеолитическую и нуклеазную активность абзимных 1^0. появляющихся при вирусных заболеваниях.
2. Преимущественным субстратом для абзимов-протеаз являются амиды и пептиды. имеющие в своем составе основные аминокислоты (аргинин. лизин).
3. Лизин-амидазная активность 1^0 является высокоспецифичной для
инфекционного мононуклеоза. что может быть использовано для
иммунологической лабораторной диагностики данного заболевания.
Литература
1. ДНК и РНК-гидролизирующие антитела из крови больных различными формами вирусного гепатита / А. Г. Барановский [и др.] // Биохимия. - 1997. -Т. 62, № 12. - С. 1590-1599.
2. Генералов, И. И. Абзимная активность препаратов IgG у больных ревматоидным артритом и системной красной волчанкой / И. И. Генералов, Е. В. Сидорская // Иммунология. - 1998. -№ 3. - С. 54-56.
3. Генералова, А. Г. Оценка ДНКазной активности методом риванолового сгустка / А. Г. Генералова, И. И. Генералов // Клин. лаб. диагн. - 1997. - № 11. -С. 24, 33-34.
4. Ферментативная активность препаратов IgG при вирусных гепатитах / И. В. Жильцов [и др.] // Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол. - 1998. -№ 4. - С. 73-77.
5. Маянский, А. Н. Патогенетическая микробиология / А. Н. Маянский. -Нижний Новгород: Изд-во НГМА, 2006. - 520 с.
6. Остерман, Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование: практ. пособие / Л. А. Остерман. -М., 1981. - 286 с.
7. Практическая химия белка: пер. с англ. / под ред. А. Дарбре. - М.: Мир, 1989. - 223 с.
8. HIV-1 integrase-hydrolyzing antibodies from sera of HIV-infected patients / S. V. Baranova [et al.] // Biochimie. - 2009. - Vol. 91. - P. 1081-1086.
9. Catalytic Antibodies / Ed. Eh. Keinan. Weinheim. - Wiley-Vch Verlag. -2005. - 578 p.
10. Guidelines for immunologic laboratory testing in the rheumatic diseases: an introduction. Am. Coll. of Rheumatology ad hoc Committee on immunologic testing guidelines // Arthritis Rheum. - 2002. - Vol. 47. - P. 429 - 433.
11. Catalytic features and eradication ability of antibody light-chain UA 15-L against Helicobacter pylori / E. Hifumi [et al.] // J. Biol. Chem. - 2008. - Vol. 283. -P. 899-907.
12. Unexpected presence of polyreactive catalytic antibodies in IgG from unimmunized donors and decreased levels in rheumatoid arthritis / R. Kalaga [et al.] // J. Immunol. - 1995. - Vol. 155, N 5. - P. 2695-2702.
13. High levels of catalytic antibodies correlate with favorable outcome in sepsis / S. Lacroix-Desmazes [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2005. - Vol. 102, N 11. - P. 4109-4113
14. Catalytic IgG from patients with hemophilia A inactivate therapeutic factor VIII / S. Lacroix-Desmazes [et al.] // J. Immunol. - 2006. - Vol. 177. - P. 1355-1363.
15. Natural catalytic antibodies (abzymes) in normalcy and pathology / G. A. Nevinsky [et al.] // Biochemistry. - 2000. - Vol. 65, N 11. - Р. 1473-1487.
16. .Natural catalytic antibodies: peptide-hydrolyzing activities of Bence-Jones proteins and VL fragments / S. Paul [et al.] // J. Biol. Chem. - 1995. - Vol. 270. - P. 15257-15261.
