CC BY
23Физика живого, Т. 17, No2, 2009. С.68-72.
©Цапенко П.К., Оглобля О.В., Лященко Т.П.
УДК 577.3
ВПЛИВ БОМБЕЗИНУ НА ЕЛЕКТРИЧНУ АКТИВНІСТЬ ГЕПАТОЦИТІВ ЩУРІВ
Цапенко П.К., Оглобля О.В., Лященко Т.П.
Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Україна e-mail: tsapenkopetr@yahoo.com
Поступила в редакцию 11.05.2009
Були проведені дослідження впливу норадреналіну та ацетилхоліну (класичних холестатика та холеретика) на електричну активність гепатоцитів за допомогою мікроелектродної техніки. В обох випадках була зафіксована збуджуюча гіперполяризація клітин. З дією даних речовин порівнювалася дія бомбезину. Було показано, що бомбезин викликає деполяризацію гепатоцитів, що може бути пов’язане з активацією НСО3--обмінника та відкриттям натрієвих та катіонних каналів, що в свою чергу може бути зумовлене активацією натрій-таурохолевого транспортера на базальній мембрані та амфіфільного транспортера на апікальній мембрані гепатоцитів.
Ключові слова: бомбезин, мембранний потенціал, гепатоцит.
ВСТУП
В живому організмі існує декілька типів регуляторних гуморальних систем, серед яких одне з провідних місць посідає пептидергічна система регуляції. Основними компонентами цієї системи є низькомолекулярні пептиди, що забезпечують перенесення необхідної інформації, координацію, нормальне функціонування, розвиток і взаємодію клітинних популяцій (Ашмарин, 1982). Значна кількість регуляторних пептидів бере участь у нейрогуморальній регуляції жовчоутворювальної функції печінки (Климов, 1983; Масюк, 1991). До них слід віднести і бомбезиноподібні пептиди -сполуки, що були виділені у 1971 році зі шкіри амфібій (Anastas’i A., 1971, Kim J.B., 2001). На сьогодні питання регуляції бомбезином жовчної секреції є остаточно нез’ясованим. Переважна більшість робіт стосується дії бомбезину на клітини жовчних протоків. Так, встановлено, що бомбезин та гастрин-рилізинг пептид стимулюють секрецію бікарбонату в просвіт жовчних канальців шляхом активації НСО3--обмінника (Cho W.K., Mennone A., Boyer J.L., 1997). При вивченні жовчної секреції у собак натщесерце було встановлено, що бомбезин викликає значне зростання жовчотоку. При цьому вихід жовчних кислот та фосфоліпідів залишався незмінним, а вихід холестеролу знизився щодо контролю на 17% (Kortz W.J., Nashold J.R., Delong E., Meyers W.C., 1986). Гладенькі м’язи жовчного міхура також виявилася чутливими до дії бомбезину (Schjodager B., Poulsen S.S., et all, 1991). Таким чином, можна стверджувати, що бомбезин та
його аналог гастрин-рилізинг пептид відіграють важливу роль у канальцевій секреції жовчі, а також забезпечують скорочення жовчного міхура та вихід жовчі у дванадцятипалу кишку (Schjodager B., Poulsen S.S., et all, 1991). Отже, можна зазначити, що дані щодо означеної проблематики є суперечливими.
Дослідження впливу бомбезину на жовчну секрецію in vivo не дає остаточної відповіді щодо механізмів дії цього пептиду, оскільки великою мірою залежить від шляхів введення речовини. Дія бомбезину безпосередньо на гепатоцити в умовах in vitro дозволяє виключити реакцію «каскадного» типу. Тому ми взяли за мету дослідити вплив бомбезину на інтегральний показник діяльності гепатоцитів - мембранний потенціал, та порівняти його з дією класичних нейромедіаторів: ацетилхоліну та норадреналіну.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ
Оскільки гепатоцити в умовах in vitro зберігають свої основні властивості in vivo, вони є зручним об’єктом для дослідження функцій печінки на клітинному рівні. За допомогою електрофізіологічних методів можна досліджувати процеси, що відбуваються в гепатоцитах, від трансмембранного транспорту до секреторних процесів у цих клітинах (Poisner, 1985).
Через мембрану гепатоцитів постійно транспортуються речовини, при чому цей транспорт часто іде проти градієнта концентрації. Як і в інших епітеліальних клітинах, такий транспорт може йти з використанням енергії
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ С КАТИОННЫМИ ФЕНАЗИНАМИ ВБЛИЗИ ГРАНИЦЫ РАЗДЕЛА РАСТВОРОВ С РАЗНОЙ КОНЦЕНТРАЦИЕЙ ХЛОРИДА НАТРИЯ
трансмембранного градієнта іонів №+. Такий транспорт буде електрогенним, адже крізь мембрану переносяться заряджені частинки в певних співвідношеннях. Отже, матимемо зміну мембранного потенціалу, яку можна зареєструвати за допомогою мікроелектродної техніки. Саме таким чином досліджується поглинання гепатоцитами жовчних кислот з крові, які потім знову секретуються в жовчні канальці. Відомо, що разом з таурохолевою кислотою всередину гепатоцита входять іони №+ в співвідношенні 1:1, що спричинює зміну мембранного потенціалу. Таким чином, фіксуючи зміни потенціалу мембрани, можна судити про інтенсивність поглинання таурохолевої кислоти. Для таких досліджень використовують звичайні скляні мікроелектроди опором 80-100м0м. Вони заповнені 3М розчином КС1 (Lidofsky, Fitz, 1993).
Досліди проводилися на лабораторних білих щурах масою 200-250г в умовах гострого експерименту. Для вивчення дії досліджуваних речовин безпосередньо на гепатоцити ми використовували мікроелектродну техніку. Для виділення об’єкту ми використовували методику Сеглена (Сакман, Неер, 1987). Щури перебували під тіопенталовим наркозом в дозі 5мг/100г маси тіла тварини, після наркотизації проводилася лапаротомія та відмивання печінки від крові розчином Локка для ссавців зі швидкістю 10мл/хв. Після перфузії печінки ми брали ліву чи праву долі органу та відпрепаровували сполучнотканинну оболонку. Це проводилося для того, щоб зняти амортизацію цілісного ізольованого органу, яка
заважає проникненню мікроелектрода. Препарат печінки прикріплювався до експериментальної камери, дно якої було вкрито силгардом, та перфузувався фізіологічним розчином, що був визнаний оптимальним для культивування гепатоцитів. Склад розчину (в мМ): 140 NaCl, 4 KCl, 1 CaCl2, 1 MgCl2, 10 глюкоза, 1 KH2PO4, 10 HEPES (pH 7,4, NaOH), що подавався зі швидкістю 2мл\хв (Fitz, 1994).
Нами використовувалися мікроелектроди з боросилікатного скла зовнішнього діаметру 1,45мм опором 100-120 МОм. Мікроелектроди заповнювалися 2,5М розчином KCl. Норадреналін ми перфузували в концентрації 1мкМ/л, ацетилхолін -в концентрації 10мкМ\л, бомбезин - в концентрації 50нМ/л. Саме такі концентрації були взяті, бо з літературних джерел відомо, що ці дози є максимально ефективними (Mitchell et all., 1995; Sanchez-Guttierez, 2000; Aliev,2005).
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Нашим завданням було дослідити зміни мембранного потенціалу гепатоцитів за дії основних нейромедіаторів: норадреналіну та
ацетилхоліну, які справляють протилежні впливи на основну функцію печінки - жовчосекреторну, та порівняти їх дію з дією бомбезину.
Досліди показали, що норадреналін справляє збуджуючий вплив на гепатоцит в цілому, про що свідчить гіперполяризація у відповідь на дію цієї речовини (рис.1).
t, сек
Рис. 1. Зміни мембранного потенціалу (МП) гепатоцитів під впливом норадреналіну (1мкМ, М±м, n=5).
Наші дослідження показали, що в стані спокою гепатоцит має мембранний потенціал близько -20мВ, що узгоджується з літературними даними, а у відповідь на дію норадреналіну потенціал клітини зростає та залишається стабільно на цьому рівні
протягом часу перфузії препарату розчином норадреналіну. Отже, в цьому випадку ми бачимо яскравий приклад збуджуючої гіперполяризації, на фоні якої спостерігаються певні коливання потенціалу.
Цапенко П.К., Оглобля О.В., Лященко Т.П.
t, сек
Рис. 2. Вплив ацетилхоліну в концентрації 10 мкМ на електричну активність гепатоцитів (М±м, п=6).
Рис. 3. Вплив бомбезину в концентрації 50 нМ на електричну активність гепатоцитів (М±м, n=5).
У відповідь на дію ацетилхоліну (іншого класичного медіатора) маємо дещо іншу картину (рис.2). В даному випадку також спостерігається збуджуюча гіперполяризація, однак амплітуда коливань клітинного потенціалу гепатоцитів є значно меншою. Такі відмінності в дії цих речовин можуть бути пов’язані з тим, що у щурів симпатична нервова система відіграє більш значну роль в регуляції функцій печінки, ніж парасимпатична, що проявляється в більшому тонічному впливі симпатичних нервів в умовах in vivo. Отже, гепатоцити інших тварин можуть інакше реагувати на дію норадреналіну та ацетилхоліну.
Прогнозуючи ефекти бомбезину на зміни мембранного потенціалу гепатоцитів, логічно було б припустити схожість з реакцією на дію ацетилхоліну, оскільки за даними літератури, бомбезин стимулює процес жовчовиділення, так само, як і ацетилхолін (Moroz et all. 2007). Проте,
реальна картина виявилася дещо іншою. У відповідь на введення бомбезину таке явище, як збуджуюча гіперполяризація зовсім не спостерігалася (рис.3). Натомість ми спостерігали незначну деполяризацією, спричинену дією пептиду.
Відсутність збуджуючої гіперполяризації у відповідь на дію бомбезину може свідчити про те, що бомбезин не бере участі в регулюванні синтетичних процесів в клітинах печінки, адже синтетична активність секреторної клітини супроводжується зростанням її мембранного потенціалу (Poisner, 1985). Зменшення трансмембранної різниці потенціалів гепатоцитів свідчить про залучення електрогенних механізмів, що призводять до входження в клітину катіонів або виходу з неї аніонів. В першу чергу можна пов’язати дані ефекти з активацією натрій-залежних трансмембранних транспортерів, а саме йср (натрій-таурохолевий котранспортуючий пептид),
ВПЛИВ БОМБЕЗИНУ НА ЕЛЕКТРИЧНУ АКТИВНІСТЬ ГЕПАТОЦИТІВ ЩУРІВ
та пов’язаними з цим транспортером транспортерів гідрофобних та амфіфільних компонентів жовчі. Окрім цього, деполяризація гепатоциту може бути спричинена виділенням через апікальну мембрану іонів HCO3" в обмін на позаклітинні іони Cl" (Zsembery et all., 2000). Вищевикладене дозволяє припустити, що при дії бомбезину посилюється виділення бікарбонатів та ліпідних та амфіфільних компонентів жовчі, особливо тауро- та глікокон’югатів, стимулюється повернення жовчних кислот з крові. Разом з тим, синтез жовчних кислот de novo, ймовірно, не активується. Ці дані підтверджуються дослідженнями Мороз та ін. (200б).
Також слід відмітити той факт, що в деяких клітинах спостерігалася відставлена дія після введення бомбезину, що і зумовило відносно велику помилку середнього на початку досліду.
Оскільки в умовах нашого досліду зберігаються зв’язки між субпопуляціями гепатоцитів однієї долі, і, в свою чергу, немає можливості контролю від клітини якої субпопуляції проводилося відведення, така відмінність часових ефектів бомбезину може бути пояснена наявністю вторинного посередника, що виділяється клітинами перипортальної зони у відповідь на дію бомбезину та впливає на клітини перивенозної зони через міжклітинний простір (Dupont et. al., 2000). Отже, існує необхідність перевірки цієї гіпотези і пошуку можливого посередника у ефектах бомбезину на клітини перивенозної зони.
ВИСНОВКИ
Підсумовуючи вищевикладене, треба зазначити: бомбезин викликає деполяризацію
гепатоцитів, тобто його дія не повторює дію ані класичного холекінетика ацетихоліну, ані класичного холестатика норадреналіну, а отже й не пов’язана з синтетичними процесами в клітинах. Проте, бомбезин, ймовірно, активує захоплення жовчних кислот з крові, виділення бікарбонатів та кон’югованих жовчних кислот, насамперед, за рахунок вже створених та рециркулюючих.
Література
1. Ашмарин И.П. Гипотеза о существовании новой высшей категории в иерархии регуляторных пептидов // Нейрохимия. - 1987. - Т. б, №1. - С. 23-28.
2. Климов П.К. Пептиды и пищеварительная система. -Л.: Наука, 1983. - 271с.
3. Масюк А.И. Гормональная регуляция желчеотделения: феноменология, возможные молекулярные механизмы // Успехи современной биологии. - 1991. - Т.3, вып.1. -С. 48-58.
4. Anastasi A, Erspamer V, Bucci M. Isolation and structure of bombesin and alytesin, 2 analogous active peptides from
the skin of the European amphibians Bombina and Alytes // Experientia. - 1971. - N27(2).- P. 1бб-1б7.
5. Kim J.B., Johansson A., Holmgren S., Conlon J.M. Gastrin-releasing peptides from Xenopus laevis; purification, characterization and miotropic activity // Am J Physiol Regulatory Integrative Comp Physiol.- 2001.-Vol. 281.-P.902-908.
6. Сho W.K., Mennone A., Rydberg A., Boyer J.L. Bombesin dtimulates bicarbonate secretion from rat cholangiocytes: Implications for neural regulation of bile secretion // Gastroenterology. 1997.- vol. 113, issue 1.- P. 311-321.
7. Kortz W.J., Nashold J.R., Delong E., Meyers W.C. Effects of bombesin on fasting bile formation // Ann.Surg. - 1986.-vol. 203, issue 1.- P. 1-7.
8. Schjodager B., Poulsen S.S., et al. Gastrin-releasing peptide is a transmitter mediating porcine gallbladder contraction // AJP - Gastrointest. Liver Physiol.- 1991.- vol. 2б0, issue 4. - P. 577-585.
9. Poisner R.H. The secretory process. Vol.2, The electrophysiology of the secretory cell.- Amsterdam: Elsevier, 1985.- 21б p.
10. Lidofsky S.D., Fitz J.G., Weisiger RA., Scharschmidt B.F. Hepatic taurocholate uptake is electrogenic and influenced by transmembrane potential difference // Am. J. Physiol.-1993.- 2б4.- P. G478-G485.
11. Сакман Б., Неер Э. Регистрация одиночных каналов-М.: Мир, 1987.- 448 с.
12. Fitz J.G., Sostman H. Nucleotide receptors activate cation, potassium, and chloride currents in a liver cell line // Am. J. Physiol.- 1994.- 2бб.- P. G544 - G553.
13. Sanchez-Gutierez J.C., Sanchez-Arias J.A., Samper B., Feliu J.E. Modulation of gluconeogenesis by epinephrine in hepatocytes isolated from genetically obese (fa/fa) Zucker rats // Arch. Biochem. Biophys.- 2000.- Vol.373(1).-P. 249-254.
14. Aliev R.R., Fedorov V. V., Rozenshtraukh L. V. Study of the effect of acetylcholine on the excitability of true pacemaker cells of rabbit sinus node using computer simulation // Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology.- 2005.-Vol.402.- P. 223-225.
15. Mitchell F.M., Heasley L.E., Qian N.-X., Zamarripa J., Johnson J.Z. Differential modulation of bombesin-stimulated phospholipase C and mitogen-activated protein kinase activity d-Arg, d-Phe, D-Trp, Leu Substance P // American socity for Biochemistry and molecular biology, inc.- 1995.- Vol.210, N 15.- issue 14.- P.8623-8628.
16. Moroz O., Veselsky S., Lyaschenko T., Nuryshenko N. Bombesin influence on bile lipid composition in rat // Acta Physiologica.- 2007.- Vol.191.- p.39.
17. Zsembery A., Thalhammer T., Graf J. Bile Formation: a Concerted Action of Membrane Transporters in Hepatocytes and Cholangiocytes // News Physiol Sci.-2000.-Vol.15, issue 1.- P. 6-11.
18. Мороз О. Ф., Лященко Т.П., Весельський С.П., Макарчук М.Ю. Вплив бомбезину на жовчну секрецію у щурів // Науковий вісник Волинського державного університету імені Лесі Українки.- 2006. - №5.- С.43-46.
19. Dupont, G., Tordjmann, T., Clair, C., Swillens, S., Claret, M., Combettes, L. Mechanism of receptororiented intercellular calcium wave propagation in hepatocytes // FASEB J.- 2000.- №14.- P. 279-289.
Цапенко П.К., Оглобля О.В., Лященко Т.П.
ВЛИЯНИЕ БОМБЕЗИНА НА ЭЛЕКТРИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ГЕПАТОЦИТОВ КРЫС Цапенко П.К., Оглобля А.В., Лященко Т.П.
Были проведены исследования влияния норадреналина и ацетилхолина (классических холестатика и холеретика) на электрическую активность гепатоцитов с помощью микроэлектродной техники. В обоих случаях была зафиксирована возбуждающая гиперполяризация клеток. С действием данных веществ сравнивалось действие бомбезина. Было показано, что бомбезин вызывает деполяризацию гепатоцитов, что может объясняться активацией НСО3- обменника а также открытием натриевых и катионных каналов, что в свою очередь может быть обусловлено активацией натрий-таурохолевого транспортера на базальной мембране и амфифильного транспортера на апикальной мембране гепатоцитов.
Ключевые слова: бомбезин, мембранный потенциал, гепатоцит.
INFLUENCE OF BOMBESIN ON ELECTRICAL ACTIVITY OF RAT HEPATOCYTES Tsapenko P.K., Ogloblia O.V., Lyashchenko T.P
The influence of norepinephrine (bile secretion inhibitor) and acetylcholine (bile secretion stimulator) on hepatocytes membrane potential difference using microelectrode technique was investigated. It is shown that norepinephrine and acetylcholine perfusion provokes membrane hyperpolarisation of hepatocytes. We supposed that bombesin effect should be similar to acetylcholine. But, in contrast to acetylcholine, bombesin depolarizes membrane of hepatocytes. A such effect could be explained by activation of HCO3 -exchanger and amphiphilic compounds secretion.
Key words: bombesin, membrane potential difference, hepatocyte.
